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1、第四讲 筛选新药之化合物的重要源泉II 组合化学与组合生物合成主要内容一、组合化学简介1 组合化学基本原理2 固相组合化学合成3 液相组合化学合成二、定向生物合成三、突变生物合成四、抗生素基因工程简介五、聚酮体途径抗生素的生物合成六、组合生物合成进展l组合化学是一项新型化学技术，他利用一系列合成、测试技术，在短时间内合成数目庞大的有机化合物，经过高效生物活性筛选，从中发现一批具有活性的药物前体。l组合化学是应生物学家建立起来的高通量筛选技术的需要而产生的。l组合化学合成技术已经给传统的有机合成化学带来了革命性的变化，是近年来科学上取得的重要成就之一。组合化学概念n组合化学最早起源于固相多肽合成
2、。就本质而言，组合化学是建立在高效平行的合成之上的，这种合成方法步骤有限，但生成的化合物库内包含大量化合物。n组合化学不是单一的一种技术，它包含了一系列化学技术。它是一门交叉性学科，它以有机化学为基础，与生物化学、药物化学密不可分，并涉及到数学、物理和计算机等多门科学。而传统有机合成方法是对单个分子分步合成，在数量上是处于低层次的，合成速度太慢，无法满足对化合物量的需要。组合化学的起源五肽的合成n用20种天然氨基酸合成的五肽，组合起来有以下种：n二聚体 202=400 n三聚体 203=8000 n四聚体 204=160,000 n五聚体 205=3200,000组合化学1组合化学是用于新药合
3、成和筛选的一种全新的方法，1988年Furda 等首先提出了此概念，而始于90年代初，它打破了逐一合成、逐一纯化、逐一筛选的模式，以合成和筛选化合物库的形式寻找和优化先导化合物，从而大大加快了发现药物先导化合物的速度。2组合化学结合了化学合成、电脑设计、计算机技术等，能同时产生许多种结构相关但有序变化的化合物，然后用高度灵敏的生物学方法对这些化合物同时进行筛选，从中确定具有生物活性的物质，再经结构测定，以期找到全新的先导化合物，具有其高效、微量、高度自动化的特点。3分为三个阶段：分子多样性化合物库的合成；群集筛选（进行活性检测）；活性分子的结构测定。化合物的合成包括化学合成和生物合成两种；化合
4、物库的筛选可以是固相筛选，也可以是液相筛选或两者结合。组合化学基本原理 n分子多样性化合物库的建立 如何设计模板分子；选择怎样的构建单元；确定何种合成方案；如何完成自动合成等。n群集筛选 选定筛选模式为固相筛选或用何法（细胞功能筛选、受体筛选、抗体筛选等）进行筛选，用何种指示剂（同位素标记、荧光标记、染料染色)等。具体的筛选方法有三种：固相筛选、液相筛选和两者的结合 。n确认活性分子结构 编码技术已应用于解析组合库中高活性化合物的结构。最早提出此技术的是Brenner和Lerner，Nicolaou等提出了射频编码合成仪突破了以往的编码形式，它是建立在射频信号及应用多功能微反应仪的半导体记忆装
5、置基础上的。组合化学策略n要合成大量的化合物，目前有两种不同的策略可以进行：n混合物合成方式和平行合成方式 n既是在反应体系中多种反应物混合在一既是在反应体系中多种反应物混合在一起进行反应，得到多种产物如：正丁酸起进行反应，得到多种产物如：正丁酸与醇缩合形成酯的反应。与醇缩合形成酯的反应。混合物合成方式平行合成方式n是指在合成过程中以平行的方式同时合成多种反应产物。n每个反应是独立进行的，如上述反应当每个反应同时独立进行时，即为平行合成方式。 组合合成技术组合合成包括化学合成和生物合成两种。 化学合成分为固相合成和液相合成，但有关液相合成的报道不是很多。固相合成的方法很多，包括混合固相肽合成、
6、多孔固相合成法、混-分法、光控合成法、以纤维素为载体的合成等，其中最常用的是混分法。 生物合成主要是利用表面显示技术。表面显示技术是一种新的基因技术，它使表达的外源肽(或蛋白质的结构域)以融合的形式显示在噬菌体或细胞的表面，被显示的多肽或蛋白质可以保持相对独立的空间结构和生物活性。一般用噬菌体、噬菌体质粒嵌合体、质粒、大肠杆菌及多核糖体等生物系统，其中应用最多的是噬菌体表达系统。利用生物显示技术进行生物合成肽库或非肽库，用于人工抗体和疫苗的制备、抗原决定簇的定位、多肽药物的研究等。 高通量筛选 High Throughput Screening固相合成法n是最早以固相肽合成建立起来的组合方法。
7、是最早以固相肽合成建立起来的组合方法。n固相合成固相合成Solid phase synthesisSolid phase synthesis技术由技术由Merrifield(1963)Merrifield(1963)首创，首创，他使用取代的树脂作为固相载体来合成多肽；他使用取代的树脂作为固相载体来合成多肽；n但是大量的以多肽合成方法衍生出来的固相合成策略的应用是在但是大量的以多肽合成方法衍生出来的固相合成策略的应用是在8080年代才有了突破年代才有了突破。 HPLC-MSanalysisofanequimolarmixtureof16heterocycliccompoundsgenerated
8、byasplitandcombinesynthesis固相合成的优点n1）可以使用过量的试剂使反应趋于完全。n2）反应结束后，可以通过过滤、洗涤固相介质除去反应物。n3）节省了分离纯化的时间n4) 反应收率高，产物纯度高。树脂珠的种类n目前固相合成中较多使用的树脂是小的球状树脂珠（80-200um）,常用的有以下几种 1 交联聚苯乙烯2 聚酰胺树脂l聚苯乙烯和聚酰胺树脂通常缺乏结构上的刚性，不能用于需要长期溶剂化而达到连续流动合成的目的。l因此人们又设计了许多新型大孔高聚物，其中较好的是多孔玻璃，它是一种刚性的衍生化的玻璃球状物，可以与任何溶剂相容，对腐蚀性溶剂和高压、高温都比较稳定。3 多孔
9、玻璃合成方法l茶叶包法 tea-bag l用具有74mm网眼的聚丙烯网袋（15mmX20mm），里面装满树脂珠，密封好。最初树脂珠上都连有一个保护的氨基酸，然后它被浸在反应物核偶联剂的混合溶剂中，把袋子集中进行脱保护、洗涤、中和及再偶联等步骤。混合均分法 Mix-Splitl一珠一物法(one bead,one compound)，l该方法依赖于在树脂珠上合成化合物，一定数量的载体被分成相等的几部分，然后各部分独自与不同的起始单体原料反应。l反应后，树脂的各部分又重新合并，混匀，再被分成几部分，进一步与一系列试剂反应图例图例其他固相合成方法l多针上的合成多针上的合成 在在4040mm, mm,
10、 直径为直径为4 4mmmm的聚的聚苯乙烯针上合成。苯乙烯针上合成。l在园片上合成在园片上合成 在直径在直径0.6350.635cmcm，厚度为厚度为0.37150.3715cmcm的聚苯乙烯上合成。的聚苯乙烯上合成。l在薄片上合成在薄片上合成 在玻璃片、纸片上合成在玻璃片、纸片上合成（50-40050-400umum）. .n由于应用固相合成的化学反应范围有由于应用固相合成的化学反应范围有限，而且当反应物和产物连接到固相限，而且当反应物和产物连接到固相载体上时，检测反应过程比较困难，载体上时，检测反应过程比较困难，因此人们重新研究了液相合成方法。因此人们重新研究了液相合成方法。 液相合成法S
11、olution phase Synthesis n由于液相合成存在一些不确定性，在合成的每一步之后均需进行某种形式的纯化，如果用平行合成大量的化合物，进行纯化的工作是相当烦琐的，如果用混合物方式合成，那么，纯化过程几乎是不可能的。n因此人们将传统的液相合成的优点与固相合成的优点结合起来，从而形成了液体相合成方法。n其原理是将化合物结合到一种可溶性高分子上，反应后，经过调节反应体系的溶剂、离子强度、pH等使高分子从溶液中沉淀下来。n目前使用的有聚乙烯醇单甲醚，它可以溶解在多种溶剂中，但在乙醚中可以结晶析出。液体相合成l药物合成与筛选l催化剂的合成与筛选l高分子试剂的合成与筛选l酶抑制剂的合成与筛
12、选l酶催化的组合合成组合化学的应用发展状况n存在问题1 组合化学中的分子多样性 2 组合化学的数据处理 n展望1 80年代末第一代专门从事组合化学的生物技术公司成立，其中包括Aftymax、Aptein、Gilead Science、Houghten、Isis等10家公司；2 发展方向是：构建分子多样性化合物库；提高生物检测效率和水平；发展直接测定结构的技术；实行合成和筛选一体化；组合化学与计算机一体化；改革、发展现代生物筛选技术并进行标准化以适应快速筛选的需要等。 3 至今尚未有一种重要的药物上市。目前，Eli lilly（礼莱公司，美国）已研制出了一种治疗中枢神经系统疾病的小分子制剂，目前
13、已进入临床研究阶段。二、定向生物合成（Directed Biosynthesis)生物合成工程nBiosyntheticengineeringistherationalmanipulationofthebiosyntheticpathwayforamicrobialmetaboliteinordertogeneratenovelproducts定向生物合成nDirected Fermentation/Mutasynthesis.Thechangesinstructurecanbeextendedstillfurtherbyfeedingtotheproducingorganismsynthet
14、iccompounds,whichareanaloguesofnaturalintermediatesinthebiosyntheticpathway(DirectedBiosynthesis).Thisisparticularlyefficientifbiosynthesisofthenaturalintermediatecanbeknockedoutallowingallofthebiosynthesistobedirectedtothemodifiedproduct(Mutasynthesis).Feeding CDEJ四、抗生素基因工程简介抗生素药物基因工程实用化平台n从链霉菌中分离出
15、8个聚酮化合物基因簇，其中聚醚类抗生素基因簇为这一类别之世界首例。科研人员发现了聚酮链延伸过程中形成聚醚的多个功能独特的基因，以及一个崭新的聚醚链释放因子。国际上首例聚醚类抗生素 南昌霉素生物合成基因簇的结构组成、聚醚链形成和释放的机制以及 整个抗生素生物合成组装的分子模型，是我国迄今在抗生素分子生物学 领域最重要的贡献之一。其基因簇已申请中国专利。这一课题的科研人 员还成功克隆了国际上第一例烯类抗生素生物合成基因簇；同时利用已 经分离的抗生素基因簇进行抗生素生产率提高和品种改造的遗传工程探 索，获得了提高霉素产量并产生了新结构化合物的菌株，为在抗生素产 业上利用基因工程技术实现高产和开发创新
16、药物提供了模型平台。n上海交通大学与国家基因组南方中心、华中农业大学、江西农业大学合作完成 基因工程限制性内切酶运载体必须具有三个条件：在宿主细胞中能保存下来并能大量复制；有多个限制酶切点，而且每种酶的切点最好只有一个，如大肠杆菌pBR322就有多种限制酶的单一识别位点，可适于多种限制酶切割的DNA插入；有一定的标记基因，便于进行筛选。如大肠杆菌的pBR322质粒携带氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，就可以作为筛选的标记基因。载体质粒载体目的基因的制备目的基因的制备1 鸟枪法 类似于鸟枪发射散弹。具体的做法是：用若干个合适的限制酶处理一个DNA分子，将它切成若干个DNA片段。这些片段的长度相
17、当于或略大于一个基因。然后，将这些不同的DNA片段分别与适当的载体结合，形成重组DNA，再将它导入到相应的营养缺陷型细菌中。最后，把这些细菌中的这段DNA分离出来，再进行一系列的操作，就可以获得基因。这种方法的缺点是专一性较差，分离出来的有时并非一个基因，但由于这种方法操作简便，所以现在仍然广泛采用。2 反转录法 这种方法是在核糖体合成多肽的旺盛时期，首先把含有目的基因的mRNA的多聚核糖体提取出来，分离出mRNA，然后以mRNA为模板，用反转录酶合成一个互补的DNA，即cDNA单链，再以此单链为模板合成出互补链，就成为双链DNA分子。这种方法专一性强，但是操作过程比较麻烦，特别是mRNA很不
18、稳定、生存时间短，所以要求的技术条件较高。3 根据已知的氨基酸序列合成DNA 这种方法是建立在DNA序列分析基础上的。当把一个基因的核苷酸序列搞清楚后，可以按图纸先合成一个个含少量（1015个）核苷酸的DNA片段，再利用碱基对互补的关系使它们形成双链片段，然后用连接酶把双链片段逐个按顺序连接起来，使双链逐渐加长，最后得到一个完整的基因。 把纯化的DNA导入细菌细胞的过程称为转化。原核细胞的转化过程就是导入外源DNA的过程。对于大肠杆菌来说，人们一般采用先用冰冷的CaCl2处理，然后置于42 高温下帮助其吸收外源的DNA，这种方法的最大转化频率为10-3，其效率是每微克DNA一般可以转化1071
19、08个细胞。目前CaCl2转化方法的机制尚不清楚，可能是细胞壁被打了一些孔，DNA分子从这些孔洞中进入细胞，而这些孔洞随后又可以被宿主细胞修复。可以接受DNA的细胞称为感受态细胞。大肠杆菌需要诱导才能变成感受态细胞，而有些细菌细胞则在自然条件下，或是在改变培养基和其他培养条件下就可变成感受态细胞。转化转化透明颤菌血红蛋白基因（vgb)nVitreoscilla Hemoglobin-vgbn透明颤菌的血红蛋白()是20世纪70年代被发现的,由于它具有结合氧的特性,可使透明颤菌这一专性好氧的革兰氏阴性菌在贫氧环境中生长.nDikshit和Webster根据已报道的氨基酸序列合成探针杂交筛选了基因
20、库,得到了含有基因的1.4的片段.n产黄青霉vgb转化菌PTH-1嗜盐新特性,产青霉素比对照株提高14%。透明颤菌血红蛋白的应用表达系统转化子的表达结果E.coli血红素含量提高47倍，淀粉酶产量提高3.5倍，细胞密度提高1.4倍，中性蛋白酶提高30。嗜热脂肪芽孢杆菌淀粉酶产量提高2 3倍谷氨酸棒状杆菌溶氧在5饱和度时LLys的产率提高30Streptomyces coelicolor 溶氧在5饱和度,放线紫红素产量提高10倍，菌浓度提高1.5倍啤酒酵母细胞密度提高2倍产黄青霉头孢菌素C的产量提高5倍Aad-Cyc-Val(ACV)Isopenicillin (IPN)Biosynthetic
21、pathwaysofB-lactamantibiotics7-氨基青霉烷酸(7-ACA)7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA) 基因工程改造CPC产生菌美国礼莱公司应用基因重组技术成功把带有CPC生物合成关键酶基因质粒转化至CPC工业生产菌，获得5株高产菌株，其中一株在中试规模中CPC生产水平提高15。五、聚酮体途径抗生素的生物合成1 放线紫红素（Actinorhodin）聚酮合成酶（PolyketideSynthases）放线紫红素（Actinorhodin）放线紫红素（Actinorhodin）红霉素（Erythromycin）组合生物合成组合生物合成(Combinatorial) biosynthesis polyketidesCoA:coenzymeAorACP:acylcarrierproteinPKS:polyketidesynthaseMonomersPolyketideBackboneCyclized intermediatePolyketidePKSPKS CyclasesTailoring enzymes,Group transferases, etc.组合示例组合示例谢谢大家！第五讲 生物转化与手性合成
