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1、实验二实验二 血红蛋白及其衍生物血红蛋白及其衍生物的吸收光谱及定量测定的吸收光谱及定量测定 一、目的要求一、目的要求1、掌握、掌握722型分光光度计的使用。型分光光度计的使用。2、了解血红蛋白及其衍生物的吸收光谱的测、了解血红蛋白及其衍生物的吸收光谱的测定。定。3、掌握血红蛋白标准曲线的绘制、掌握血红蛋白标准曲线的绘制。二、实验原理 血红蛋白（Hb）与O2结合生成氧合血红蛋白（HbO2），与CO结合生成一氧化碳血红蛋白（HbCO），因其血红蛋白分子结构不同，当光线分别透过各种Hb溶液时，所吸收的光波也各异，可显出特有的吸收光谱。这些吸收光谱可作为它们定性和定量分析的基础，如HbO2在可见光波长
2、400600nm范围内有三个特征的吸收峰，其峰值分别在415、541和576nm处，当氧合血红蛋白转为一氧化碳血红蛋白（HbCO），此时光谱发生改变，在波长419、540和569nm处出现三个特征的吸收峰，其中在500600nm范围内三个特征的吸收峰如下图。 本实验先制备Hb及其衍生物，然后在不同波长下测其光吸收度，以吸光度（A）（又称光密度）为纵坐标，波长为横坐标绘制成吸收光谱曲线，由此可以确定它们最大的吸收波长。 三、仪器和试剂三、仪器和试剂 1仪器：试管及试管架；吸量管；滴管和 量筒；722型分光光度计；CO发生器。2试剂： （1） 浓H2SO4； （2）甲酸； （3）蒸馏水； （4）血
3、红蛋白溶液。 722型分光光度计能在可见光谱区域内对样型分光光度计能在可见光谱区域内对样品物质作定量的分析。该仪器广泛应用于品物质作定量的分析。该仪器广泛应用于医药卫生、临床检验、生物化学、石油化医药卫生、临床检验、生物化学、石油化工、环境保护、质量控制等部门，是生物工、环境保护、质量控制等部门，是生物化学实验室常用分析仪器之一化学实验室常用分析仪器之一1 1、722722型分光光度计的使用型分光光度计的使用基本原理基本原理 溶液中的物质在光的照射激发下，产生了对光吸收溶液中的物质在光的照射激发下，产生了对光吸收 的效应，物质对光的吸收是具有选择性的，各种不的效应，物质对光的吸收是具有选择性的
4、，各种不 同的物质都具有其各自的吸收光谱，因此当某单色同的物质都具有其各自的吸收光谱，因此当某单色 光通过溶液时，其能量就会被吸收而减弱，光能量光通过溶液时，其能量就会被吸收而减弱，光能量 减弱的程度和物质的浓度有一定的比例关系，也即减弱的程度和物质的浓度有一定的比例关系，也即 符合于比色原理符合于比色原理-朗伯朗伯- -比耳定律比耳定律 u 朗伯比尔定律：朗伯比尔定律： A=A=lclc ：摩尔吸光系数：摩尔吸光系数 c c：溶液的浓度：溶液的浓度 l l：液层的厚度：液层的厚度 A A：物质的吸光度：物质的吸光度 操作方法操作方法u 预热仪器预热仪器 u 选定波长选定波长 u 调节调节T=
5、100T=100 u 固定灵敏度档固定灵敏度档 u 调节调节“ “0”0”点点 u 测定测定 u 关机关机 注意事项注意事项u 该仪器应放在干燥房间内，使用温度为该仪器应放在干燥房间内，使用温度为553535。 远离强电场、磁场远离强电场、磁场u 每次做完实验时，应立即洗净比色皿每次做完实验时，应立即洗净比色皿 u 为了防止光电管疲劳。不测定时必须将比色皿为了防止光电管疲劳。不测定时必须将比色皿 暗箱盖打开，使光路切断，以延长光电管使用寿命暗箱盖打开，使光路切断，以延长光电管使用寿命 u 当仪器停止工作时，切断电源，电源开关同时当仪器停止工作时，切断电源，电源开关同时 切断。并且用套子盖住仪器
6、，做好使用登记切断。并且用套子盖住仪器，做好使用登记 u 比色皿的使用方法比色皿的使用方法 拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面， 不要碰比色皿的透光面，以免沾污不要碰比色皿的透光面，以免沾污 洗比色皿时，一般先用水冲洗，再用蒸馏水洗净洗比色皿时，一般先用水冲洗，再用蒸馏水洗净 比色皿外壁的水用擦镜纸或细软的吸水纸蘸干，比色皿外壁的水用擦镜纸或细软的吸水纸蘸干，以保护透光面以保护透光面 四、实验步骤四、实验步骤 1样品的制备： 用草酸钾抗凝，取静脉血，边取边轻轻摇动，即制得全血。 （1）氧合血红蛋白（HbO2）液：加蒸馏水20ml， 取全血（3滴）
7、盛于小烧杯中，混匀，此即HbO2液，呈鲜红色。（2）碳氧血红蛋白（HbCO) 液：取上述HbO2液约5ml于试管中，通CO气体（浓硫酸与甲酸在CO发生器中反应发生）约10秒钟，HbO2即变成樱桃红色的HbCO溶液。2吸光度测定及吸光光谱曲线的绘制： （1）将如上制备的2种血红蛋白液分别盛于比色杯内，在722型分光光度计上以蒸馏水为空白调节吸光度零点和100%（每一次读数均应用空白管调节零点和100%）。 （2） 先从波长500600nm分别测定HbO2，碳氧血红蛋白的吸光度（在相应峰值的10nm范围内每隔2nm记录一次吸光度读数，其余均每隔10nm记录一次吸光度读数）。 （3）然后以吸光度为纵坐标，波长为横坐标描点，并将各点连接成曲线，即为血红蛋白及其衍生物的吸收光谱，但由于使用仪器不同，绘制出的血红蛋白及其衍生物的吸收光谱必有一些差异，对722型分光光度计来说，峰值误差在3nm5nm波长内是允许的。思考题1、什么叫吸收光谱？测定血红蛋白及其衍生物的吸收光谱有何意义？2、Hb属于哪类蛋白质，它的吸收光谱的特征反映它的什么结构成分？3、什么叫吸光度、透光度、消光系数及分子消光系数？
