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1、响应面法优化蛋白酶生产工艺响应面法优化蛋白酶生产工艺（下）（下）实验内容实验内容1、干物质失重的测定、干物质失重的测定2、蛋白酶活力的测定、蛋白酶活力的测定3、数据分析与建模、数据分析与建模4、响应曲面作图、响应曲面作图5、整改方案分析、整改方案分析一、干物质失重的测定干重失重发酵前干重发酵后干重干重失重发酵前干重发酵后干重二、蛋白酶活力分析二、蛋白酶活力分析1、 原理原理 （1 1）、福林试剂在）、福林试剂在碱性碱性情况下极不稳定，可被情况下极不稳定，可被酚类酚类化合物还化合物还原而呈蓝色反应。原而呈蓝色反应。（2 2）、蛋白质分子中含有具有酚基的氨基酸）、蛋白质分子中含有具有酚基的氨基酸(
2、 (酪氨酸、色氨酪氨酸、色氨酸及苯丙氦酸等酸及苯丙氦酸等) )。（3 3）、以）、以酪蛋白酪蛋白为底物，同酶液反应，经一定时间后，加为底物，同酶液反应，经一定时间后，加三三氯醋酸氯醋酸，终止酶反应，并使残余的酪蛋白质沉淀，同水解产，终止酶反应，并使残余的酪蛋白质沉淀，同水解产物分开，经过滤后取物分开，经过滤后取滤液滤液。用。用碳酸钠碱化碳酸钠碱化，再加入，再加入福林试剂福林试剂使之发色，用分光光度计测定。使之发色，用分光光度计测定。（4 4）、蓝色反应的强弱，同蛋白水解产物的多少成正比而水）、蓝色反应的强弱，同蛋白水解产物的多少成正比而水解产物的量又是同酶活力成正比例关系。因此，根据蓝色反解产
3、物的量又是同酶活力成正比例关系。因此，根据蓝色反应的强弱就可推测蛋白酶的活力。应的强弱就可推测蛋白酶的活力。 2 2 试剂试剂1 1 福林试剂福林试剂 于于20002000mlml磨口回流装置内加入磨口回流装置内加入钨酸钠钨酸钠( (NaNa2 2WOWO4 42H2H2 2O)100gO)100g，钼酸钠钼酸钠( (NaMoONaMoO4 42H2H2 2O)O)25g25g，水水700700mlml，85%85%磷酸磷酸5050m1m1，浓盐浓盐酸酸10001000mlml，文火回流文火回流1010h h加入加入硫酸锂硫酸锂( (LiLi2 2SOSO4 4)150g)150g，蒸溜水蒸溜
4、水5050m1m1，混匀取去冷凝器，加入几滴混匀取去冷凝器，加入几滴液体溴液体溴，再煮沸，再煮沸l5minl5min，以以驱逐残溴及除去颜色，溶液应驱逐残溴及除去颜色，溶液应呈黄色而非绿色呈黄色而非绿色。若溶液仍有。若溶液仍有绿色，需再滴加溴液。再煮沸除去之。冷却后，定溶至绿色，需再滴加溴液。再煮沸除去之。冷却后，定溶至10001000mlml。过滤，置于棕色瓶中保存。此溶液使用时加过滤，置于棕色瓶中保存。此溶液使用时加2 2倍蒸馏倍蒸馏水稀释水稀释，即成稀释的福林试剂。，即成稀释的福林试剂。 2 2、mol/Lmol/L三氯醋酸三氯醋酸( (TCA)TCA)溶液溶液g g，定容至定容至100
5、01000mlml。3 3、碳酸钠溶液碳酸钠溶液 称取无水碳酸钠称取无水碳酸钠( (NaNa2 2COCO3 3)42.4g)42.4g，定容至定容至10001000m1m1。4 4、乳酸乳酸- -乳酸钠缓冲液乳酸钠缓冲液 A A液：液：g80-90%g80-90%乳酸加蒸馏水定容至乳酸加蒸馏水定容至10001000mlml。 B B液：液：称取称取1616克克70%70%乳酸钠加蒸馏水定容至乳酸钠加蒸馏水定容至10001000mlml。 取取A A液液1616mlml与与B B液液1 1mlmol/L pH2.5 mlmol/L pH2.5 乳酸乳酸- -乳酸钠缓冲液。乳酸钠缓冲液。5 5、
6、2%2%酪蛋白溶液酪蛋白溶液 称称取取干干酪酪素素2 2gmol/Lgmol/L氢氢氧氧化化钠钠2020mlml在在水水浴浴中中加加热热使使溶溶解解( (必必要要时时用用小小火火加加热热煮煮沸沸) )，然然后后用用乳乳酸酸- -乳乳酸酸钠钠缓缓冲冲液液定定容容至至10001000mlml即成。即成。 配配制制后后应应及及时时使使用用或或放放入入冰冰箱箱内内保保存存。否否则则极极易易繁繁殖殖细菌，引起变质。细菌，引起变质。 配配制制酪酪蛋蛋白白溶溶液液定定容容时时，若若泡泡沫沫过过多多，则则可可加加1212滴滴酒酒精精消消泡泡。33503350酸酸性性蛋蛋白白酶酶酪酪蛋蛋白白溶溶液液的的配配制制
7、，应应加加弄弄乳乳酸酸2323滴湿润。滴湿润。6 6、100100g/m1g/m1酪氨酸溶液酪氨酸溶液 精确称取在精确称取在l05g，mol/L盐酸盐酸(HCl)使溶解，加蒸溜使溶解，加蒸溜水定容至水定容至100m1，其浓度为其浓度为1000g/m1。 再吸取此液再吸取此液10ml以蒸馏水定容至以蒸馏水定容至100ml即配成即配成100g/m1酪氨酸镕液酪氨酸镕液 此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内保存，以免繁此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内保存，以免繁殖细菌而变质。殖细菌而变质。 3 3 操作步骤操作步骤3.1 标准曲线的绘制标准曲线的绘制 （1 1）按表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液）
8、按表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液(2)(2)测定步骤测定步骤 另另取取6 6支支试试管管按按上上表表编编号号分分别别吸吸取取不不同同浓浓度度的的酪酪氨氨酸酸1 1mlml，mo1/Lmo1/L碳酸钠碳酸钠5 5m1m1，再加入已稀释的福林试剂再加入已稀释的福林试剂1 1m1m1。 摇摇匀匀置置于于水水浴浴锅锅中中，4040保保温温发发色色2020minmin，在在波波长长660660nmnm处测定吸光度。一般测处测定吸光度。一般测3 3次，取平均值次，取平均值 以以吸吸光光度度为为纵纵座座标标，酪酪氨氨酸酸的的浓浓度度为为横横座座标标，绘绘制制成标准曲线。成标准曲线。 准准确确称称取取蛋蛋白白
9、酶酶固固态态发发酵酵的的湿湿曲曲2 2g g，用用10102020mlml蒸蒸馏馏水水，3030浸浸提提半半小小时时，用用滤滤纸纸过过滤滤。将将滤滤液液稀稀释释一一定定倍数倍数( (使其测定光密度在使其测定光密度在范围内为宜范围内为宜) )。3.2 3.2 酶液的制备酶液的制备 取取四四支支试试管管，分分别别加加入入1 1mlml稀稀释释酶酶液液，其其中中一一支支为为空空白白管，三支为平行试验管，置入管，三支为平行试验管，置入4040水浴中预热水浴中预热3 35 5minmin。 在在三三支支平平行行试试验验管管中中分分别别加加入入1 1ml ml 2% 2% 酪酪蛋蛋白白溶溶液液，准准确确计
10、计时时保保温温1010minmin。立立即即加加入入2 2三三氯氯乙乙酸酸溶溶液液，l5minl5min后后用用滤滤纸纸过过滤滤。分分别别吸吸取取1 1mlml清清液液，加加5 5碳碳酸酸钠钠溶溶液液，最最后后加加入入1 1mlml福林福林- -酚试剂，摇匀，于酚试剂，摇匀，于4040水浴中显色水浴中显色2020minmin。 空空白白管管中中先先加加入入2 2三三氯氯乙乙酸酸溶溶液液，再再加加l l ml ml 2%2%酪酪蛋蛋白白溶液，溶液，1515minmin后用滤纸过滤。以下操作与平行试验管相同。后用滤纸过滤。以下操作与平行试验管相同。 以空白管为对照，在以空白管为对照，在680纳米纳
11、米波长下测波长下测光密度光密度，取其平，取其平均值。均值。 3.3 3.3 测定测定 蛋蛋白白酶酶活活力力单单位位定定义义：在在4040，下下，每每分分钟钟水水解解酪酪蛋蛋白释放白释放1 1微克酪氨酸的酶量定义为微克酪氨酸的酶量定义为1 1个蛋白酶单位。个蛋白酶单位。 式中：式中： K K：标准曲线中标准曲线中ODOD值为值为1 1所相当的酪氨酸的微克数；所相当的酪氨酸的微克数； OD OD：平行试验管的平均光密度；平行试验管的平均光密度； 4 4：试管中反应液总体积：试管中反应液总体积( (毫升毫升) )； 10 10：反应：反应1010分钟；分钟； N N：稀释倍数；稀释倍数；W W：曲的
12、称取量曲的称取量( (克克) )4 4 计算计算 （1 1）对对于于同同一一台台分分光光光光度度计计与与同同一一批批福福林林- -酚酚试试剂剂，其其工工作作曲曲线线K K值值可可以以沿沿用用，当当另另配配福福林林- -酚酚试试剂剂时时，工工作作曲曲线应重作。线应重作。 （2 2）当当用用不不同同产产品品的的酪酪蛋蛋白白对对同同一一蛋蛋白白酶酶测测定定时时，其其结结果果会会有有差差异异，故故蛋蛋白白酶酶活活力力表表示示时时应应注注明明所所用用酪酪蛋蛋白白的生产厂。的生产厂。5 5 说明说明三、三、数据分析与建模数据分析与建模使用使用DESIGN EXPERT 7.1 软件软件1、建立数学模型、建立数学模型2、模型显著性检验、模型显著性检验3、解方程，求出最佳发酵条件、解方程，求出最佳发酵条件4、求出模型所预测的最高产量。、求出模型所预测的最高产量。四、响应曲面作图四、响应曲面作图作出本次实验的作出本次实验的2D与与3D曲面图。曲面图。五、整改方案分析五、整改方案分析 分析本次实验设计存在的问题，如何分析本次实验设计存在的问题，如何改进实验设计？改进实验设计？
