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1、实验七、硝实验七、硝酸还原酶活性测定酸还原酶活性测定实验目的：掌握测定硝酸还原酶活性的原理和方法;巩固分光光度计的使用方法。 硝酸还原酶硝酸还原酶硝酸还原酶硝酸还原酶(NR)(NR)，是硝酸盐同化中第一个酶，也是限速酶，是硝酸盐同化中第一个酶，也是限速酶，是硝酸盐同化中第一个酶，也是限速酶，是硝酸盐同化中第一个酶，也是限速酶，催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，在植物的氮素代谢中发催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，在植物的氮素代谢中发催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，在植物的氮素代谢中发催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，在植物的氮素代谢中发挥重要作用，与作物有效吸收和利用氮素肥料有关，对
2、农作物产挥重要作用，与作物有效吸收和利用氮素肥料有关，对农作物产挥重要作用，与作物有效吸收和利用氮素肥料有关，对农作物产挥重要作用，与作物有效吸收和利用氮素肥料有关，对农作物产量和品质有重要影响，硝酸还原酶活性被当作植物营养或农田施量和品质有重要影响，硝酸还原酶活性被当作植物营养或农田施量和品质有重要影响，硝酸还原酶活性被当作植物营养或农田施量和品质有重要影响，硝酸还原酶活性被当作植物营养或农田施肥的指标之一，也可作为品种选育的指标之一。肥的指标之一，也可作为品种选育的指标之一。肥的指标之一，也可作为品种选育的指标之一。肥的指标之一，也可作为品种选育的指标之一。高等植物硝酸还原酶的模型NR-含
3、钼的黄素蛋白辅基是黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）高等植物硝酸还原酶的模型高等植物硝酸还原酶的模型研究趋势研究趋势 【英文篇名英文篇名】Determination MethodDetermination Method of Nitrate of Nitrate ReductaseReductase Activity in the Activity in the Leaves of Leaves of CamptothecaCamptotheca acuminataacuminata 【作者中文名作者中文名】孙世芹孙世芹; ;阎秀峰阎秀峰; ; 【作者单位作者单位】东北林业大学东北林业大学; ;东北
4、林业大学东北林业大学 哈尔滨哈尔滨;150040;150040; 【文献出处文献出处】东北林业大学学报东北林业大学学报, ,JournalofNortheastForestryUniversityJournalofNortheastForestryUniversity, ,编辑部邮编辑部邮箱箱 20042004年年 0303期期 期刊荣誉：中文核心期刊要目总览期刊荣誉：中文核心期刊要目总览 ASPTASPT来源刊来源刊 中国期刊方阵中国期刊方阵 CJFDCJFD收录刊收录刊 【关键词关键词】喜树喜树; ;硝酸还原酶硝酸还原酶; ;体内法体内法; ; 【英文关键词英文关键词】Camptothec
5、aCamptotheca acuminataacuminata;Nitrate;Nitratereductasereductase;Invivomethod;Invivomethod; 【摘要摘要】以喜树以喜树 ( (CamptothecaacuminataCamptothecaacuminata) )为材料为材料 , ,探讨了用体内法测定其叶片硝酸还探讨了用体内法测定其叶片硝酸还原酶活性的若干问题原酶活性的若干问题 , ,比较分析了硝酸盐诱导、比较分析了硝酸盐诱导、2,4-2,4-二硝基苯酚、三氯乙酸及煮沸等二硝基苯酚、三氯乙酸及煮沸等因素对硝酸还原酶活性测定结果的影响因素对硝酸还原酶活性测
6、定结果的影响 , ,以寻求体内法测定喜树叶片硝酸还原酶活性的以寻求体内法测定喜树叶片硝酸还原酶活性的最佳条件。试验表明最佳条件。试验表明 , ,体内法是一种操作简便、准确可靠的测定喜树叶片硝酸还原酶活体内法是一种操作简便、准确可靠的测定喜树叶片硝酸还原酶活性的方法性的方法 , ,为进一步研究喜树的氮代谢奠定了基础。为进一步研究喜树的氮代谢奠定了基础。维普检索的中文文献维普检索的中文文献 查询结果：共找到查询结果：共找到查询结果：共找到查询结果：共找到 493493条条条条, ,耗时耗时耗时耗时0.0014070.001407秒秒秒秒, , 当前页当前页当前页当前页3/253/25标记数标记数标
7、记数标记数8080条条条条 1.1.卫秀英卫秀英 侯小坤侯小坤 张百俊张百俊 刘荷芬刘荷芬. .氮肥对圆叶菠菜硝酸盐含量及其酶活性的影响氮肥对圆叶菠菜硝酸盐含量及其酶活性的影响J.J.河南科技学院学报：河南科技学院学报：自然科学版，自然科学版，20072007，35(3)35(3)：35-37.35-37. 2.2.刘永梅刘永梅 刘永定刘永定 李敦海李敦海 沈银武沈银武. .氮磷对水华束丝藻生长及生理特性的影响氮磷对水华束丝藻生长及生理特性的影响J.J.水生生物学报，水生生物学报，20072007，31(6)31(6)：774-779.774-779. 3.3.张建平张建平 陈娟陈娟 胡一鸿胡
8、一鸿 莫亿伟莫亿伟. .镉胁迫对浮萍叶片光合功能的影响镉胁迫对浮萍叶片光合功能的影响J.J.农业环境科学学报，农业环境科学学报，20072007，26(6)26(6)：2027-2032.2027-2032. 4.4.乔海涛乔海涛 杨洪强杨洪强 范伟国范伟国. .缺素环境中平邑甜茶根系硝酸还原酶活性及硝态氮含量的变化缺素环境中平邑甜茶根系硝酸还原酶活性及硝态氮含量的变化J.J.中国农学通中国农学通报，报，20072007，23(10)23(10)：114-117.114-117. 5.5.田园田园 梁亮梁亮 宋波宋波 苏小俊苏小俊 袁希汉袁希汉 徐海徐海 陈劲枫陈劲枫. .小白菜硝酸盐累积的基
9、因型差异小白菜硝酸盐累积的基因型差异J.J.江苏农业学报，江苏农业学报，20072007，23(5)23(5)：459-463.459-463. 6.6.徐永杰徐永杰 金慧波金慧波. .北方温室无公害蔬菜施肥技术北方温室无公害蔬菜施肥技术J.J.现代化农业，现代化农业，2007(11)2007(11)：12-12.12-12. 7.7.无无. .壳聚糖对茶树氮代谢影响壳聚糖对茶树氮代谢影响J.J.中国茶叶，中国茶叶，20072007，29(5)29(5)：43-43.43-43. 8.8.洪华生洪华生 王玉珏王玉珏 王大志王大志. .海洋浮游植物硝酸还原酶研究进展海洋浮游植物硝酸还原酶研究进展
10、J.J.海洋科学，海洋科学，20072007，31(10)31(10)：4-10.4-10. 9.9.刘萍刘萍 郭文善郭文善 浦汉春浦汉春 封超年封超年 朱新开朱新开 彭永欣彭永欣. .花后短暂高温对小麦籽粒蛋白质含量的影响及其生理机制花后短暂高温对小麦籽粒蛋白质含量的影响及其生理机制J.J.作物学报，作物学报，20072007，33(9)33(9)：1516-1522.1516-1522. 10.10.何玲何玲 罗佳罗佳 郭宁郭宁 杨公明杨公明. .浆水芹菜发酵过程中硝酸还原酶活性和亚硝酸盐含量的变化浆水芹菜发酵过程中硝酸还原酶活性和亚硝酸盐含量的变化J.J.西北农林科西北农林科技大学学报，
11、技大学学报，20072007，35(9)35(9)：184-188,194.184-188,194. 11.11.董庆霖董庆霖 赵学明赵学明 邢向英邢向英. .强光照对雨生红球藻合成虾青素的影响强光照对雨生红球藻合成虾青素的影响J.J.高校化学工程学报，高校化学工程学报，20072007，21(4)21(4)：685-688.685-688. 12.12.刘亚丽刘亚丽 姬生栋姬生栋 薛华政薛华政 张献伟张献伟 李鹏李鹏 祝红燕祝红燕 陈鹏陈鹏 盛有明盛有明. .转大豆转大豆DNADNA高蛋白小麦变异株系的硝酸还原高蛋白小麦变异株系的硝酸还原酶、叶绿素含量分析酶、叶绿素含量分析J.J.河南农业科
12、学，河南农业科学，2007(7)2007(7)：25-27.25-27. 13.13.马林马林 孟凡德孟凡德 石书兵石书兵 宋维彦宋维彦 聂文魁聂文魁 刘心雨刘心雨 郭飞郭飞. .不同耕作方式对小麦硝酸还原酶活性和旗叶衰老指不同耕作方式对小麦硝酸还原酶活性和旗叶衰老指标的影响标的影响J.J.新疆农业大学学报，新疆农业大学学报，20072007，30(3)30(3)：23-27.23-27. 14.14.卫晓轶卫晓轶 李国清李国清 王艳朋王艳朋 李浩川李浩川 靳静晨靳静晨 田国伟田国伟 刘宗华刘宗华. .不同基因型玉米某些氮代谢生理指标的差异研不同基因型玉米某些氮代谢生理指标的差异研究究J.J.
13、河南农业大学学报，河南农业大学学报，20072007，41(3)41(3)：264-268.264-268. 15.15.曹翠玲曹翠玲 刘建朝刘建朝 姚晨姚晨. .不同呼吸抑制剂对小麦幼苗根系硝酸还原酶活性的影响不同呼吸抑制剂对小麦幼苗根系硝酸还原酶活性的影响J.J.西北农林科技大学西北农林科技大学学报，学报，20072007，35(8)35(8)：185-188.185-188. 16.16.张智猛张智猛 万书波万书波 宁堂原宁堂原 戴良香戴良香. .不同花生品种氮代谢相关酶活性的研究不同花生品种氮代谢相关酶活性的研究J.J.植物营养与肥料学报，植物营养与肥料学报，20072007，13(4
14、)13(4)：707-713.707-713. 17.17.张绪成张绪成 上官周平上官周平. .施氮量对小麦叶片硝酸还原酶活性、一氧化氮含量和气体交换的影响施氮量对小麦叶片硝酸还原酶活性、一氧化氮含量和气体交换的影响J.J.应用生态应用生态学报，学报，20072007，18(7)18(7)：1447-1452.1447-1452. 18.18.毛伟华毛伟华 龚亚明龚亚明 夏晓剑夏晓剑 周艳虹周艳虹 喻景权喻景权. .黄瓜硝酸还原酶黄瓜硝酸还原酶cDNAcDNA片段的克隆及其在缺氮胁迫下的表达片段的克隆及其在缺氮胁迫下的表达J.J.浙江农业学报，浙江农业学报，20072007，19(3)19(3
15、)：160-163.160-163. 19.19.董庆霖董庆霖 邢向英邢向英 赵学明赵学明. .光照强度对雨生红球藻合成虾青素的影响光照强度对雨生红球藻合成虾青素的影响J.J.水生生物学报，水生生物学报，20072007，31(3)31(3)：445-447.445-447.实验原理在一定条件下，NO2的生成量与硝酸还原酶活性呈正相关。NO2可从组织渗透到外界溶液中，通过测定溶液中NO2含量的增加检测该酶活性。NO2含量可用磺胺显色法测定，即在酸性条件下，NO2与磺胺和萘胺反应，生成红色化合物，在520nm下比色测定。实验器材1.天平2.真空泵3.分光光度计4.恒温箱5.剪刀6.试管7.三角瓶
16、8.移液管主要试剂主要试剂0.1mol/LpH7.5磷酸缓冲液0.2mol/LKNO3 3磺胺试剂萘胺试剂亚硝酸钠标准液1. 标准曲线绘制亚硝酸钠标准液磺胺试剂萘胺试剂体积1ml2ml2ml亚硝酸钠标准液浓度0、0.5、1.0、2.0、3.0ug/ml，即共5管溶液。混匀上述溶液，静置20min；520nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。实验步骤实验步骤2. 酶的诱导与还原反应1.1.将实验材料用水洗净，吸水纸吸干；将实验材料用水洗净，吸水纸吸干；2.2.配制配制对照液对照液对照液对照液(5ml PBS + 5mlH20)(5ml PBS + 5mlH20)和和诱导液诱导液诱导液诱导液(5ml
17、 PBS + 5ml KNO3)(5ml PBS + 5ml KNO3)，置于，置于两个烧杯中；两个烧杯中；3.3.用剪刀将叶片剪成边长为用剪刀将叶片剪成边长为0.4cm0.4cm的正方形小块的正方形小块，天平上称取，天平上称取0.5g0.5g重重的两等的两等份，分别投入到上述两烧杯中；份，分别投入到上述两烧杯中；4.4.将盛有叶片的两个烧杯进行将盛有叶片的两个烧杯进行真空抽气真空抽气30min30min，最好使叶片沉入烧杯底部，最好使叶片沉入烧杯底部，30 30 恒温箱中恒温箱中保温保温30min30min。5.5.从两烧杯中从两烧杯中分别吸取分别吸取1ml1ml反应液，注入两只试管中；反应液，注入两只试管中；6.6.再分别依次加入再分别依次加入2ml2ml磺胺试剂磺胺试剂和和2ml2ml 萘胺试剂萘胺试剂，混匀后，混匀后室温静置室温静置20min20min; ; 7.7.520nm520nm波长波长下测定吸光度。下测定吸光度。8.8.根据标准曲线测得根据标准曲线测得NO2NO2浓度，浓度，对照液、诱导液对照液、诱导液NO2NO2浓度差浓度差即为即为NO2NO2的生成量，的生成量，可表示硝酸还原酶的活性。可表示硝酸还原酶的活性。实验步骤实验步骤
