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1、海南医学院海南医学院海南医学院海南医学院 病原生物学教研室病原生物学教研室病原生物学教研室病原生物学教研室 饶朗毓饶朗毓饶朗毓饶朗毓2011本科1目的要求目的要求掌握：掌握：病原菌的常规分离与鉴定方法原则；疫苗的概念；死疫病原菌的常规分离与鉴定方法原则；疫苗的概念；死疫苗和活疫苗的概念及区别；类毒素的概念和特点；人工主苗和活疫苗的概念及区别；类毒素的概念和特点；人工主动免疫和人工被动免疫的比较。动免疫和人工被动免疫的比较。熟悉：熟悉：细菌形态学检查的方法；血清学诊断的方法。细菌形态学检查的方法；血清学诊断的方法。了解：了解：细菌的免疫学诊断技术；亚单位疫苗和细菌的免疫学诊断技术；亚单位疫苗和D
2、NADNA疫苗。疫苗。2感染性疾病的诊断3微生物学诊断微生物学诊断样本采集与送检原则样本采集与送检原则样本采集与送检原则样本采集与送检原则检验程序检验程序检验程序检验程序血清学诊断血清学诊断原则：采取急性期和原则：采取急性期和原则：采取急性期和原则：采取急性期和恢复期双份血清，后恢复期双份血清，后恢复期双份血清，后恢复期双份血清，后者的抗体效价比前者者的抗体效价比前者者的抗体效价比前者者的抗体效价比前者升高升高升高升高4444倍者有意义。倍者有意义。倍者有意义。倍者有意义。检测病原菌及其抗原、产物或核酸检测病原菌及其抗原、产物或核酸检测患者血清中的特异性抗体检测患者血清中的特异性抗体4一一.
3、.细菌标本采集与送检原则细菌标本采集与送检原则1.1.1.1.采集合适的标本采集合适的标本采集合适的标本采集合适的标本2.2.2.2.严格无菌操作严格无菌操作严格无菌操作严格无菌操作3.3.3.3.正确采集标本正确采集标本正确采集标本正确采集标本4.4.4.4.正确标记及包装正确标记及包装正确标记及包装正确标记及包装5.5.5.5.正确运输及保存正确运输及保存正确运输及保存正确运输及保存5二、致病菌的检验程序二、致病菌的检验程序形态学检查形态学检查分离培养分离培养生化试验生化试验血清学试验血清学试验动物实验动物实验药敏试验药敏试验快速检测方法快速检测方法初步诊断初步诊断明确诊断明确诊断6（一）
4、细菌的形态学检查（一）细菌的形态学检查几种常用的显微镜：几种常用的显微镜： 普通光学显微镜普通光学显微镜 暗视野显微镜暗视野显微镜 相差显微镜相差显微镜 荧光显微镜荧光显微镜 电子显微镜电子显微镜7直接涂片染色镜检直接涂片染色镜检菌体形态、排列、大小、染色性、特殊结构菌体形态、排列、大小、染色性、特殊结构初步鉴定初步鉴定8单单 染染 法法只显示细菌的形态与排列只显示细菌的形态与排列复复 染染 法法可观察细菌的形态、排列及其染色性可观察细菌的形态、排列及其染色性革兰革兰染色（染色（Gram Gram stain)stain)抗酸抗酸染色（染色（Acid-fast stain)Acid-fast
5、stain)特殊染色法特殊染色法荚膜染色、芽胞染色、荚膜染色、芽胞染色、 鞭毛染色、异染颗粒鞭毛染色、异染颗粒染色法9步骤：结果: 阳性菌阳性菌紫色紫色 阴性菌阴性菌红色红色结晶紫初染碘液媒染乙醇脱色复红复染涂片固定由丹麦医生Hans Christian Gram于1884年创立。革兰染色法（Gram Stain）10步骤： 涂片固定 5%石炭酸复红初染 3%盐酸酒精脱色 美蓝复染 镜检抗酸染色法抗酸染色法结果: 抗酸菌红色； 非抗酸菌蓝色。11特殊染色法l细胞壁染色法细胞壁染色法l荚膜染色法荚膜染色法l芽胞染色法芽胞染色法l鞭毛染色法鞭毛染色法l异染颗粒染色法异染颗粒染色法12（二）分离培养
6、与鉴定（二）分离培养与鉴定液体培养基：液体培养基：增菌培养增菌培养半固体培养基：半固体培养基：查动力或保存菌种查动力或保存菌种固体培养基：固体培养基：平板用于分离培养平板用于分离培养 斜面用于纯培养或保存菌种斜面用于纯培养或保存菌种13菌落菌落colony大小、形状、色泽、边缘、透明度、凹凸、湿润度、溶血现象大小、形状、色泽、边缘、透明度、凹凸、湿润度、溶血现象 14细菌的生长现象细菌的生长现象 固体培养基固体培养基光滑型光滑型粘液型粘液型粗糙型粗糙型15细菌的生长现象细菌的生长现象 固体培养基固体培养基与鉴定细菌有关的菌落特征：与鉴定细菌有关的菌落特征：（1 1）溶血）溶血（2 2）色素）色
7、素（3 3）气味）气味16（三）生化试验（三）生化试验（biological tests）糖类代谢糖类代谢糖类代谢糖类代谢糖发酵试验糖发酵试验VPVP试验（试验（ViVi）甲基红试验（甲基红试验（M M）枸橼酸盐利用试验（枸橼酸盐利用试验（C C）蛋白质代谢蛋白质代谢蛋白质代谢蛋白质代谢靛基质（吲哚）试验（靛基质（吲哚）试验（I I）硫化氢试验硫化氢试验尿素分解试验尿素分解试验17糖发酵试验糖发酵试验产酸产酸产酸产酸产酸产气产酸产气产酸产气产酸产气不产酸不产酸不产酸不产酸不产气不产气不产气不产气原理：不同细菌因酶系统不同，原理：不同细菌因酶系统不同，原理：不同细菌因酶系统不同，原理：不同细菌因
8、酶系统不同，能分解不同的糖；细菌分解糖后能分解不同的糖；细菌分解糖后能分解不同的糖；细菌分解糖后能分解不同的糖；细菌分解糖后能产酸；如某些细菌因具有特殊能产酸；如某些细菌因具有特殊能产酸；如某些细菌因具有特殊能产酸；如某些细菌因具有特殊的解氢酶则进一步分解酸产气。的解氢酶则进一步分解酸产气。的解氢酶则进一步分解酸产气。的解氢酶则进一步分解酸产气。用途：用途：用途：用途：肠杆菌科细菌的鉴定肠杆菌科细菌的鉴定肠杆菌科细菌的鉴定肠杆菌科细菌的鉴定如：大肠埃希菌如：大肠埃希菌如：大肠埃希菌如：大肠埃希菌 伤寒沙门菌伤寒沙门菌伤寒沙门菌伤寒沙门菌 + + 痢疾志贺菌痢疾志贺菌痢疾志贺菌痢疾志贺菌 碳水化
9、合物代谢试验碳水化合物代谢试验18吲哚试验吲哚试验原理：原理：分解分解细菌（含色氨酸酶）细菌（含色氨酸酶）色氨酸色氨酸吲哚（靛基质）吲哚（靛基质）对二甲基氨基苯甲醛对二甲基氨基苯甲醛玫瑰吲哚玫瑰吲哚应用：肠道杆菌鉴定应用：肠道杆菌鉴定如：如： 大肠埃希菌大肠埃希菌+ 沙门菌属沙门菌属 蛋白质和氨基酸代谢试验蛋白质和氨基酸代谢试验19（四）血清学鉴定（四）血清学鉴定（serological tests） 已知抗体（抗血清）已知抗体（抗血清）待检抗原待检抗原（未知菌）（未知菌）直接法直接法玻片凝集试验（玻片凝集试验（定性试验定性试验）20（五）动物试验（五）动物试验 主要用于分离、鉴定致病菌，测定
10、菌株产毒性等主要用于分离、鉴定致病菌，测定菌株产毒性等2122（六）药物敏感试验（六）药物敏感试验 纸片琼脂法纸片琼脂法纸片琼脂法纸片琼脂法测量抑菌环直径测量抑菌环直径测量抑菌环直径测量抑菌环直径2324（1 1 1 1）沉淀反应（）沉淀反应（）沉淀反应（）沉淀反应（precipitationprecipitationprecipitationprecipitation） 可可溶溶性性抗抗原原（细细菌菌可可溶溶性性抗抗原原、免免疫疫球球蛋蛋白白、细细胞胞裂裂解解物物、组组织织浸浸液液等等）与与相相应应抗抗体体结结合合， 形形成成不不溶溶性性免免疫疫复复合合物物，出出现现不不透透明明的的沉沉淀淀
11、物物。多多在在半半固固体体琼琼脂脂凝凝胶胶上上进进行，形成白色的沉淀。行，形成白色的沉淀。 可可分分为为单单向向免免疫疫扩扩散散试试验验、双双向向免免疫疫扩扩散散试试验验、免免疫疫电泳、免疫比浊法等。电泳、免疫比浊法等。（七）病原菌的抗原检测（七）病原菌的抗原检测25沉淀环沉淀环环的直径与抗原环的直径与抗原含量成正相关含量成正相关抗体混于琼脂凝胶中制板抗体混于琼脂凝胶中制板对流免疫电泳对流免疫电泳26（2 2）协协同同凝凝集集：用用SPASPA测测脑脑膜膜炎炎奈奈瑟瑟菌菌、痢痢疾疾杆杆菌菌、伤伤寒寒杆菌可溶性抗原作早期诊断。杆菌可溶性抗原作早期诊断。（3 3）免疫荧光法）免疫荧光法： 痢疾杆菌
12、荧光痢疾杆菌荧光AbAb培养基培养基+ +粪便标本粪便标本荧光菌球荧光菌球（5 5）免疫印迹技术：）免疫印迹技术：对细菌蛋白的检测对细菌蛋白的检测（4 4）酶免疫测定）酶免疫测定：ELISAELISA测淋球菌、肠道菌抗原检测。测淋球菌、肠道菌抗原检测。27协同凝集试验：协同凝集试验：葡萄球菌葡萄球菌SPA IgG抗体抗体抗原抗原SPA-IgGFc段段-Ag28 荧光显微镜荧光显微镜29二、致病菌的检验程序二、致病菌的检验程序形态学检查形态学检查分离培养分离培养生化试验生化试验血清学试验血清学试验动物实验动物实验药敏试验药敏试验快速检测方法快速检测方法初步诊断初步诊断明确诊断明确诊断30标本：标
13、本：双份血清标本，恢复期血清中抗体效价比急性期血双份血清标本，恢复期血清中抗体效价比急性期血清中抗体效价升高清中抗体效价升高44倍者方有意义倍者方有意义种类：种类：凝集试验：凝集试验：肥达试验（诊断伤寒、副伤寒）、外斐试验、肥达试验（诊断伤寒、副伤寒）、外斐试验、 显微镜凝集试验等显微镜凝集试验等沉淀试验：沉淀试验：梅毒梅毒VDRLVDRL、RPRRPR试验等试验等三、血清学诊断（双份血清）三、血清学诊断（双份血清）原理：用已知的细菌或其特异性抗原检测患者体液中有无原理：用已知的细菌或其特异性抗原检测患者体液中有无相应相应特异性抗体和其效价特异性抗体和其效价的动态变化，可作为某些传染病的动态变
14、化，可作为某些传染病的辅助诊断。的辅助诊断。31补体结合试验：补体结合试验：诊断诊断Q Q热（热（Q Q热柯克斯体抗体检测）；热柯克斯体抗体检测）；中和试验：中和试验：诊断链球菌后风湿热的抗诊断链球菌后风湿热的抗O O试验试验 链球菌溶血素链球菌溶血素O+SRBCO+SRBC溶血（毒性）溶血（毒性） 病人血清病人血清+ +链球菌溶血素链球菌溶血素O+SRBCO+SRBC不溶血（中和）不溶血（中和）ELISA:ELISA:间接法查病人血清中病原体抗体（间接法查病人血清中病原体抗体（HBVHBV）；）； 双抗体夹心法测病原体抗原（双抗体夹心法测病原体抗原（HBVHBV）。）。32(direct a
15、gglutination)(direct agglutination)(direct agglutination)(direct agglutination) （乳胶颗粒）（乳胶颗粒） streptolysinO anti- slo （抗（抗O试验）试验）33补体结合试验：补体结合试验：诊断诊断Q热；热；Ab?+ -34( (一一) )人工主动免疫人工主动免疫(artificial active immunization)(artificial active immunization)1.1.疫苗疫苗: : （1 1）死）死疫苗：疫苗：如白百破、伤寒、流脑、乙脑、流感、钩端如白百破、伤寒、流脑
16、、乙脑、流感、钩端螺旋体等。安全、方便；但抗原性改变，效果差，需多次注螺旋体等。安全、方便；但抗原性改变，效果差，需多次注射；反应重）。射；反应重）。（2 2）活疫苗：活疫苗：如如BCGBCG、鼠疫、炭疽等。、鼠疫、炭疽等。 多由减毒病原菌制成；偶可发生回复突变，毒力回升，多由减毒病原菌制成；偶可发生回复突变，毒力回升，接种后发病。联合疫苗在试用中。接种后发病。联合疫苗在试用中。（3 3）基因工程疫苗、重组载体疫苗、合成疫苗、亚单位疫）基因工程疫苗、重组载体疫苗、合成疫苗、亚单位疫苗、苗、 DNA DNA疫苗疫苗2.2.类毒素：类毒素：细菌外毒素细菌外毒素+0.3%+0.3%0.4%0.4%甲
17、醛处理后毒性消失甲醛处理后毒性消失, ,保保留抗原性的生物制剂，如白百破疫苗留抗原性的生物制剂，如白百破疫苗. .第二节第二节细菌感染的特异性预防细菌感染的特异性预防351.1.抗毒素抗毒素(antitoxin)(antitoxin)2.2.抗菌血清抗菌血清3.3.丙球丙球4.4.其他免疫制剂（其他免疫制剂（IFN-IFN-、IFN-IFN-、ILIL、CSFCSF、LAKLAK细胞）。细胞）。( (二二) )人工被动免疫人工被动免疫36区别要点区别要点人工主动免疫人工主动免疫人工被动免疫人工被动免疫免疫物质免疫物质接种次数接种次数抗原抗原1-3次次抗体或细胞因子等抗体或细胞因子等1次次免疫出现时间免疫出现时间满，满，24周周快，立即快，立即免疫维持时间免疫维持时间长，数年长，数年数月数月短，短，23周周主要用途主要用途预防预防治疗或紧急预防治疗或紧急预防37思考题思考题1.1.鉴定细菌的基本程序有那些鉴定细菌的基本程序有那些? ?2.2.人工主动免疫与人工被动免疫的比较？人工主动免疫与人工被动免疫的比较？3.3.何谓类毒素？何谓类毒素？38
