第三章高效液相色谱分析课件

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1、3.1高效液相色谱分析法的特点高效液相色谱分析法的特点1. 高高压压 采采用用高高压压泵泵使使流流动动液液能能迅迅速速通通过过色色谱谱柱柱，一般达一般达150105 350 105 Pa。2. 高速高速 高压带来高速，分析时间一般少于高压带来高速，分析时间一般少于lh。3. 高高效效 柱柱效效能能约约可可达达3万万塔塔板板/米米（GC的的柱柱效效约约为为2000/米）。米）。4. 高高灵灵敏敏度度 由由于于采采用用了了高高灵灵敏敏度度的的检检测测器器，最最小小检测量可达检测量可达10-9 g，甚至甚至10-11 g。5. 可可用用于于高高沸沸点点的的、不不能能气气化化的的、热热不不稳稳定定的的

2、以以及及具有生理活性物质的分析具有生理活性物质的分析 一、一、高效液相色谱法高效液相色谱法二、二、HPLCHPLC与与GCGC差别差别 1 1分析对象的区别分析对象的区别 GCGC： 适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品； 但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型 及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可 检测。(占有机物的20%) HPLC HPLC： 适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶 液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分 子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分 子和离子型样品均可检测用途广泛。（占有机物 的80%）2 2流动相的区别流动相的区别GCGC：流动相为惰性

3、，气体组分与流动相无亲合作用流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用 力，只与固定相有相互作用力，只与固定相有相互作用。 HPLCHPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用 力，力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起 正向作用。正向作用。且流动相种类较多且流动相种类较多，选择余地广，改，选择余地广，改 变流动相极性和变流动相极性和pHpH值也对分离起到调控作用，当值也对分离起到调控作用，当 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 也可以增大分离选择性。也可以增大分

4、离选择性。3 3操作条件差别操作条件差别GCGC：加温操作：加温操作HPLCHPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）三、三、 HPLC的应用的应用 application of HPLC1. 环境中有机氯农药残留量分析环境中有机氯农药残留量分析 固定相：薄壳型硅胶固定相：薄壳型硅胶(37 50 m) 流动相：正己烷流动相：正己烷 流流 速：速：1.5 mL/min 色谱柱：色谱柱：50cm 2.5mm(内径内径) 检测器：差示折光检测器检测器：差示折光检测器 可对水果、蔬菜中的农可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。药残留量进行分析。2. 稠环芳烃的分析

5、稠环芳烃的分析 稠环芳烃多为致癌物质。稠环芳烃多为致癌物质。 固定相：十八烷基硅烷化键合相固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：流动相：20%甲醇甲醇-水水100%甲醇甲醇 线性梯度淋洗，线性梯度淋洗，2%/min 流流 速：速：1mL/min 柱柱 温：温：50 C 柱柱 压：压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器检测器：紫外检测器第二节第二节 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素影响色谱峰扩展及色谱分离的因素 影响分离的主要因素影响分离的主要因素有流动相的流量、有流动相的流量、性质和极性。性质和极性。 在在高高效效液液相相色色谱谱中中, 速速率率方方程程中中的的分分子子扩扩散散项项B/U较较

6、小小，可可以以忽忽略略不不计计，而而只只有有两两项，即：项，即： H = A + C u 故故液液相相色色谱谱H-u曲曲线线与与气气相相色色谱谱的的形形状状不不同，如图所示：同，如图所示：（1）流速：）流速：流速大于流速大于0.5 cm/s时时, Hu曲线是曲线是一段斜率不大的直线。一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重分离度和出峰时间的重要可选择参数。要可选择参数。(2) 液体的粘度比气体大一百倍液体的粘度比气体大一百倍,密度为气体的一千倍密度为气体的一千倍,故降低传质阻

7、力是故降低传质阻力是LC中提高柱效的主要途径中提高柱效的主要途径。 由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。恒温液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。恒温 改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。1分离原理：利用组分分子占据固定相表面吸附分离原理：利用组分分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异活性中心能力的差异 分离前提：分离前提：K不等或不等或k不等不等一、液固吸附色谱法（一、液固吸附色谱法（LSC） 流动相为液体，固定相为固体吸附剂流动相为液体，固定相为

8、固体吸附剂第三节第三节第三节第三节 HPLCHPLC分离类型与原理分离类型与原理分离类型与原理分离类型与原理2 2固定相固定相分为分为极性极性和和非极性非极性两类两类极性固定相极性固定相： 硅胶、氧化铝和氧化镁、硅酸镁分子筛等，其硅胶、氧化铝和氧化镁、硅酸镁分子筛等，其 中中极性硅胶极性硅胶应用最普遍。应用最普遍。非极性固定相非极性固定相： 多孔微粒活性碳、多孔石墨化炭黑，以及高分多孔微粒活性碳、多孔石墨化炭黑，以及高分 子多孔微球等。子多孔微球等。1 1）硅胶：）硅胶： 无定型硅胶无定型硅胶 最早使用，传质慢、柱效低最早使用，传质慢、柱效低薄壳型硅胶薄壳型硅胶 直径为直径为3040m3040

9、m的玻璃珠表面涂布一层的玻璃珠表面涂布一层12m12m 厚的硅胶微粒，孔径均一、渗透性好、传质厚的硅胶微粒，孔径均一、渗透性好、传质 快，但柱容量有限。快，但柱容量有限。全多孔球型硅胶全多孔球型硅胶 粒度一般为粒度一般为510m510m，颗粒和孔径的均一性都比，颗粒和孔径的均一性都比 前两种好，柱容量大，为当今液固色谱固定相前两种好，柱容量大，为当今液固色谱固定相 的主体，也是键合固定相的主要基质。的主体，也是键合固定相的主要基质。原理原理- -吸附吸附 特点特点- -峰易拖尾峰易拖尾 适用适用- -分离极性化合物分离极性化合物2 2）高分子多孔小球：）高分子多孔小球： 特点：柱选择性好，峰形

10、好，柱效低特点：柱选择性好，峰形好，柱效低 适用：分离弱极性化合物适用：分离弱极性化合物3 3流动相流动相 除除了了最最基基本本的的要要求求之之外外，主主要要考考虑虑溶溶剂剂强强度度，溶解度参数溶解度参数及及极性参数极性参数等。等。1 1分离原理：利用组分在两相中溶解度的差异分离原理：利用组分在两相中溶解度的差异2 2固定相：载体固定相：载体+ +固定液（物理或机械涂渍法）缺固定液（物理或机械涂渍法）缺 点是固定液层的耐溶剂冲刷性能差，固点是固定液层的耐溶剂冲刷性能差，固 定液易流失，从而导致柱效降低，被键定液易流失，从而导致柱效降低，被键 合相填料所取代。合相填料所取代。3 3正相色谱正相色

11、谱- -固定液极性固定液极性 流动相极性（流动相极性（NLLCNLLC） 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱，极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱，适于分离极性组分。适于分离极性组分。 反相色谱反相色谱- -固定液极性固定液极性 流动相极性（流动相极性（RLLCRLLC） 极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱适极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱适于分离非极性组分。于分离非极性组分。二、液液分配色谱法二、液液分配色谱法（LLC） 键合相色谱基本上属于分配色谱，与液液分配色谱键合相色谱基本上属于分配色谱，与液液分配色谱固定相不同的是固定相不同的是“固定液固定液”以化学键的形式与载体结合

12、以化学键的形式与载体结合在一起的。在一起的。常规化学键合相常规化学键合相利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面 1 1分离机制：分配分离机制：分配+ +吸附（吸附（以以LLC为基础为基础） 2 2特点：特点： 不易流失不易流失 热稳定性好热稳定性好 化学性能好化学性能好 载样量大载样量大 适于梯度洗脱适于梯度洗脱4.4.化学键合相色谱（化学键合相色谱（CPCCPC）三、离子色谱法（三、离子色谱法（IC）1. 1. 离子交换色谱离子交换色谱 凡在溶液中能够电离的物质，通常都可以用离子交换色谱法进行分离，其主要根据固定相对待测离子对的亲和力的差异来实现

13、分离。固定相类型：强阳离子交换剂（如磺酸基） 强阴离子交换剂（如季胺基） 弱阳离子交换剂（如羧基） 弱阴离子交换剂（如氨基）流动相以水相缓冲液为主，有时加少量有机改性剂。 离离子子色色谱谱是是在在20世世纪纪70年年代代中中期期发发展展起起来来的的一一中中技技术术，其其与与离离子子交交换换色色谱谱的的区区别别是是其其采采用用了了特特制制的的、具具有有极极低低交交换换容容量量的的离离子子交交换换树树脂脂作作为为柱柱填填料料，并并采采用用淋淋洗洗液液抑抑制制技技术术和和电导检测器电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。，是测定混合阴离子的有效方法。2. 2. 离子色谱法离子色谱法是由离子交换色谱法

14、派生出来的一种分离方法。是由离子交换色谱法派生出来的一种分离方法。3. 3. 离子对色谱离子对色谱 离子对色谱是一种分离离子型化合物的特殊分离模式。 采用非极性固定相分离弱酸或弱碱等可离子化的物质时，因其在固定相上的保留作用很弱，不易分离。故在流动相中加一种与被分析物极性相反的离子（离子对试剂），使其与被分析物形成缔合物，从而增加保留，提高分离度。四、排阻色谱色谱四、排阻色谱色谱size- exclusion chromatography 固定相：固定相：凝胶凝胶(具有一定大小孔隙分布具有一定大小孔隙分布)； 原原理理：按按分分子子大大小小分分离离。小小分分子子可可以以扩扩散散到到凝凝胶胶空空

15、隙隙，由由其其中中通通过过，出出峰峰最最慢慢；中中等等分分子子只只能能通通过过部部分分凝凝胶胶空空隙隙，中中速速通通过过；而而大大分分子子被被排排斥斥在在外外，出出峰峰最最快快；溶溶剂剂分分子子小小，故在最后出峰。故在最后出峰。 全部在死体积前出峰；全部在死体积前出峰； 可可对对相相对对分分子子质质量量在在100-105范围内的化合物按质量分离范围内的化合物按质量分离 五、五、 亲和色谱亲和色谱(AC) Affinity chromatograph 原原理理：利利用用生生物物大大分分子子和和固固定定相相表表面面存存在在的的某某种种特特异异性性亲和力，进行选择性分离。亲和力，进行选择性分离。 先

16、先在在载载体体表表面面键键合合上上一一种种具具有有一一般般反反应应性性能能的的所所谓谓间间隔隔臂臂(环环氧氧、联联胺胺等等)，再再连连接接上上配配基基(酶酶、抗抗原原等等)，这这种种固固载载化化的的配配基基将将只只能能和和具具有有亲亲和和力力特特性性吸吸附附的的生生物物大大分分子子作作用用而而被被保保留留。改改变变淋洗液后洗脱。淋洗液后洗脱。六、分离类型选择六、分离类型选择 choice of separation types第四节第四节 高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器一、流程（一、流程（process of HPLC） 首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色首先高压泵将贮液器中流动

17、相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。此得到液相色谱图。 二、主要部件（二、主要部件（二、主要部件（二、主要部件（main assembly of HPLCmain assembly of HPLC） 4 4（6 6）个主要部分：）个主要部分：）个主要部分：）个

18、主要部分： 高压输液系统；高压输液系统；高压输液系统；高压输液系统； 脱气装置；脱气装置；脱气装置；脱气装置； 梯度洗脱；梯度洗脱；梯度洗脱；梯度洗脱； 进样系统；进样系统；进样系统；进样系统； 分离系统；分离系统；分离系统；分离系统； 检测系统；检测系统；检测系统；检测系统； 此外还配有自动进样及数据处理等辅助装置。此外还配有自动进样及数据处理等辅助装置。 仪器组成仪器组成高压输液高压输液系统系统进样系统进样系统分离系统分离系统检测系统检测系统数据处理数据处理系统系统溶剂贮液瓶溶剂贮液瓶v用途：贮存流动相溶剂用途：贮存流动相溶剂v材料：玻璃或塑料，无色或棕色，材料：玻璃或塑料，无色或棕色，v

19、容积：约为容积：约为0.52.0Lv位置：高于泵，以保一定的输液静压差。位置：高于泵，以保一定的输液静压差。 1.高高压输液系液系统 高压输液泵高压输液泵v是是HPLC系统中最重要的部件之一。系统中最重要的部件之一。v输液泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量输液泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。和分析结果的可靠性。输液泵应具备的性能输液泵应具备的性能流量稳定流量稳定。对定性定量的准确性至关重要。对定性定量的准确性至关重要。流量范围宽流量范围宽，分析型应在，分析型应在0.110 ml/min范围内连续可调，范围内连续可调，制备型能达到制备型能达到100ml/min。输出压力

20、高输出压力高，一般可高达，一般可高达400500 kg/cm2。液缸容积小，适于梯度洗脱。液缸容积小，适于梯度洗脱。密封性好，耐腐蚀。密封性好，耐腐蚀。输液泵类型输液泵类型1 螺旋注射泵螺旋注射泵2 往复柱塞泵往复柱塞泵3 往复隔膜泵往复隔膜泵4 气动放大泵气动放大泵目前应用最多的是柱塞往复泵。目前应用最多的是柱塞往复泵。泵的使用与维护泵的使用与维护v防止任何固体微粒进入泵体，因此应过滤流动相。防止任何固体微粒进入泵体，因此应过滤流动相。v流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应停泵过夜或保留在泵内更长时间。必须泵入纯水将泵充应停泵

21、过夜或保留在泵内更长时间。必须泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适合于保存色谱柱和有利于泵维护的溶分清洗后，再换成适合于保存色谱柱和有利于泵维护的溶剂。剂。v防止流防止流动相耗尽空相耗尽空泵运运转，导致柱塞磨致柱塞磨损、缸体或密封、缸体或密封损 坏，最坏，最终产生漏液。生漏液。v输液液泵的工作的工作压力不能超力不能超过规定的最高定的最高压力，否力，否则会使高会使高压密密封封环变形，形，产生漏液生漏液(40 MPa, 400 bar, 5800 psi)。v流流动相相应脱气，以免在脱气，以免在泵内内产生气泡，影响流量的生气泡，影响流量的稳定性，如定性，如果有大量气泡，果有大量气泡，泵就无法正常工作。

22、就无法正常工作。2. 2.脱气装置脱气装置脱气装置脱气装置 流动相溶液往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡。流动相溶液往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡。流动相溶液往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡。流动相溶液往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡。气泡进入检测器后会在色谱图上出现尖锐的噪音峰。小气泡慢气泡进入检测器后会在色谱图上出现尖锐的噪音峰。小气泡慢气泡进入检测器后会在色谱图上出现尖锐的噪音峰。小气泡慢气泡进入检测器后会在色谱图上出现尖锐的噪音峰。小气泡慢慢聚集后会变成大气泡，大气泡进入流路或色谱柱中会使流动慢聚集后会变成大气泡，大气泡进入流路或色谱柱中会使流动慢聚集后会变成大

23、气泡，大气泡进入流路或色谱柱中会使流动慢聚集后会变成大气泡，大气泡进入流路或色谱柱中会使流动相的流速变慢或出现流速不稳定，致使基线起伏。气泡一旦进相的流速变慢或出现流速不稳定，致使基线起伏。气泡一旦进相的流速变慢或出现流速不稳定，致使基线起伏。气泡一旦进相的流速变慢或出现流速不稳定，致使基线起伏。气泡一旦进入色谱柱入色谱柱入色谱柱入色谱柱, ,排出这些气泡则很费时间。在荧光检测中排出这些气泡则很费时间。在荧光检测中排出这些气泡则很费时间。在荧光检测中排出这些气泡则很费时间。在荧光检测中, ,溶解氧还溶解氧还溶解氧还溶解氧还会使荧光淬灭。溶解气体还可能引起某些样品的氧化或使溶液会使荧光淬灭。溶解

24、气体还可能引起某些样品的氧化或使溶液会使荧光淬灭。溶解气体还可能引起某些样品的氧化或使溶液会使荧光淬灭。溶解气体还可能引起某些样品的氧化或使溶液pHpH值发生变化。值发生变化。值发生变化。值发生变化。 目前，液相色谱流动相脱气使用较多的是：目前，液相色谱流动相脱气使用较多的是：目前，液相色谱流动相脱气使用较多的是：目前，液相色谱流动相脱气使用较多的是：离线超声波振荡脱气；离线超声波振荡脱气；离线超声波振荡脱气；离线超声波振荡脱气； 在线惰性气体（氦气）鼓在线惰性气体（氦气）鼓在线惰性气体（氦气）鼓在线惰性气体（氦气）鼓泡吹扫脱气；泡吹扫脱气；泡吹扫脱气；泡吹扫脱气；在线真空脱气。在线真空脱气。

25、在线真空脱气。在线真空脱气。 真空脱气装置：真空脱气装置：真空脱气装置：真空脱气装置： 将流动相通过一段由多孔性合成将流动相通过一段由多孔性合成将流动相通过一段由多孔性合成将流动相通过一段由多孔性合成树脂膜制造的输液管，该输液管外有真空容器，真空树脂膜制造的输液管，该输液管外有真空容器，真空树脂膜制造的输液管，该输液管外有真空容器，真空树脂膜制造的输液管，该输液管外有真空容器，真空泵工作时，膜外侧被减压，分子量小的氧气、氮气、泵工作时，膜外侧被减压，分子量小的氧气、氮气、泵工作时，膜外侧被减压，分子量小的氧气、氮气、泵工作时，膜外侧被减压，分子量小的氧气、氮气、单流路真空脱气装置的原理单流路真

26、空脱气装置的原理二氧化碳就会从膜内二氧化碳就会从膜内二氧化碳就会从膜内二氧化碳就会从膜内进入膜外而被脱除。进入膜外而被脱除。进入膜外而被脱除。进入膜外而被脱除。一般真空脱气装置有一般真空脱气装置有一般真空脱气装置有一般真空脱气装置有多条流路，可同时对多条流路，可同时对多条流路，可同时对多条流路，可同时对多个溶液进行脱气。多个溶液进行脱气。多个溶液进行脱气。多个溶液进行脱气。3. 3.梯度洗脱装置梯度洗脱装置梯度洗脱装置梯度洗脱装置 在进行多成分的复杂样品的分离时，经常会碰到前在进行多成分的复杂样品的分离时，经常会碰到前在进行多成分的复杂样品的分离时，经常会碰到前在进行多成分的复杂样品的分离时，

27、经常会碰到前面的一些成分分离不完全，而后面的一些成分分离度面的一些成分分离不完全，而后面的一些成分分离度面的一些成分分离不完全，而后面的一些成分分离度面的一些成分分离不完全，而后面的一些成分分离度太大，且出峰很晚和峰型较差。为了使保留值相差很太大，且出峰很晚和峰型较差。为了使保留值相差很太大，且出峰很晚和峰型较差。为了使保留值相差很太大，且出峰很晚和峰型较差。为了使保留值相差很大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分离，往往要用到梯度洗脱技术。离，往往

28、要用到梯度洗脱技术。离，往往要用到梯度洗脱技术。离，往往要用到梯度洗脱技术。 HPLCHPLC的梯度洗脱是指流动相梯度，即在分离过程的梯度洗脱是指流动相梯度，即在分离过程的梯度洗脱是指流动相梯度，即在分离过程的梯度洗脱是指流动相梯度，即在分离过程中改变流动相的组成或浓度。中改变流动相的组成或浓度。中改变流动相的组成或浓度。中改变流动相的组成或浓度。 线性梯度线性梯度线性梯度线性梯度; ; 阶梯梯度阶梯梯度阶梯梯度阶梯梯度 高压梯度高压梯度高压梯度高压梯度低压梯度低压梯度低压梯度低压梯度高高压梯度装置梯度装置结构构优点：优点：优点：优点：只要通过梯度程序只要通过梯度程序只要通过梯度程序只要通过梯

29、度程序控制器控制每台泵的输出，控制器控制每台泵的输出，控制器控制每台泵的输出，控制器控制每台泵的输出，就能获得任意形式的梯度就能获得任意形式的梯度就能获得任意形式的梯度就能获得任意形式的梯度曲线，而且精度很高，易曲线，而且精度很高，易曲线，而且精度很高，易曲线，而且精度很高，易于实现自动化控制。于实现自动化控制。于实现自动化控制。于实现自动化控制。缺点：缺点：缺点：缺点：使用了两台高压输使用了两台高压输使用了两台高压输使用了两台高压输液泵，使仪器价格变得更液泵，使仪器价格变得更液泵，使仪器价格变得更液泵，使仪器价格变得更昂贵，故障率也相对较高，昂贵，故障率也相对较高，昂贵，故障率也相对较高，昂

30、贵，故障率也相对较高，而且只能实现二元梯度操而且只能实现二元梯度操而且只能实现二元梯度操而且只能实现二元梯度操作。作。作。作。四元低压梯度系统结构四元低压梯度系统结构 只需一个高压泵，混合只需一个高压泵，混合只需一个高压泵，混合只需一个高压泵，混合就在泵前安装了一个比例就在泵前安装了一个比例就在泵前安装了一个比例就在泵前安装了一个比例阀中完成。因比例阀是在阀中完成。因比例阀是在阀中完成。因比例阀是在阀中完成。因比例阀是在泵之前，所以是在常压泵之前，所以是在常压泵之前，所以是在常压泵之前，所以是在常压（低压）下混合，在常压（低压）下混合，在常压（低压）下混合，在常压（低压）下混合，在常压下混合易

31、形成气泡，常配下混合易形成气泡，常配下混合易形成气泡，常配下混合易形成气泡，常配置在线脱气装置，来自于置在线脱气装置，来自于置在线脱气装置，来自于置在线脱气装置，来自于四种溶液瓶的四根输液管四种溶液瓶的四根输液管四种溶液瓶的四根输液管四种溶液瓶的四根输液管分别与真空脱气装置的四分别与真空脱气装置的四分别与真空脱气装置的四分别与真空脱气装置的四条流路相接，经脱气后进条流路相接，经脱气后进条流路相接，经脱气后进条流路相接，经脱气后进入比例阀，混合后从一根入比例阀，混合后从一根入比例阀，混合后从一根入比例阀，混合后从一根输出管进入泵体。输出管进入泵体。输出管进入泵体。输出管进入泵体。梯度淋洗装置梯度

32、淋洗装置梯度淋洗装置梯度淋洗装置外梯度外梯度外梯度外梯度: : : : 利用两台高压输液泵，利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。混合后进入色谱柱。内梯度内梯度内梯度内梯度: : : : 一台高压泵一台高压泵, 通过比例通过比例调节阀调节阀,将两种或多种不同将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。入高压泵中混合。4.进样系统进样系统v作用：将试样引入色谱柱作用：将试样引入色谱柱v位置：在高压泵和色谱柱之间位置：在高压泵和色谱柱之间v类型：手动或自动类型：手动或

33、自动v进样器：六通阀进样器：六通阀 进样器进样器 手动手动 经注射器进样经注射器进样自动自动 六通阀六通阀 圆盘式自动进样器圆盘式自动进样器 链式自动进样器链式自动进样器六通阀手动进样器原理示意图六通阀手动进样器原理示意图 Load Inject 手动进样器手动进样器v用微量注射器将样品溶液注入六通阀用微量注射器将样品溶液注入六通阀v注意必须使用注意必须使用HPLC专用平头微量注射器，不能使用气专用平头微量注射器，不能使用气相色谱尖头微量注射器，否则会损坏六通阀。相色谱尖头微量注射器，否则会损坏六通阀。v进样方式：有部分装液法和完全装液法进样方式：有部分装液法和完全装液法自动进样器自动进样器v

34、由计算机自动控制进样六通阀、计量泵和进样针的位由计算机自动控制进样六通阀、计量泵和进样针的位置，按预先编制的进样操作程序工作，自动完成定量置，按预先编制的进样操作程序工作，自动完成定量取样、洗针、进样、复位等过程。取样、洗针、进样、复位等过程。5 . 5 . 分离系统分离系统分离系统分离系统色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管柱管与与固定相固定相两部分。两部分。 柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。金属。玻璃管耐压有限

35、，故金属管用得较多。 一般一般色谱柱长色谱柱长530cm，内径为，内径为45mm，凝胶色谱柱内径，凝胶色谱柱内径312mm，制备柱内径较大，可达，制备柱内径较大，可达25mm 以上。以上。 一般在分离前备有一个一般在分离前备有一个前置柱前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离柱的性能不受影响。在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离柱的性能不受影响。 柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料柱子装填得好坏

36、对柱效影响很大。对于细粒度的填料（20m）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。经冲洗后，即可备用。 一般一般柱体为直型不锈钢管，内径柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长，柱长540 cm。发展发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。柱温箱柱温箱v用于使色谱柱恒温的装置，一般其控温范围高于室温，也用于使色谱柱恒温的装置，一般其控温范围高于室温，也可低于室温，可低于室温，通常控制柱温

37、在通常控制柱温在3040。有些柱温箱还。有些柱温箱还具有柱切换装置。具有柱切换装置。v色谱柱的工作温度对保留时间、相对保留时间、溶剂的溶色谱柱的工作温度对保留时间、相对保留时间、溶剂的溶解能力、色谱柱的性能、流动相的粘度都有影响。一般升解能力、色谱柱的性能、流动相的粘度都有影响。一般升高柱温，可增加组分在流动相中的溶解度，减小分配系数高柱温，可增加组分在流动相中的溶解度，减小分配系数K，缩短分析时间；还可降低流动相的黏度，降低柱压与，缩短分析时间；还可降低流动相的黏度，降低柱压与提高柱效。提高柱效。6 6检测系统检测系统检测系统检测系统 在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。在液相色谱中，有两

38、种基本类型的检测器。在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。 一类是一类是一类是一类是溶质性检测器溶质性检测器溶质性检测器溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理，它仅对被分离组分的物理，它仅对被分离组分的物理，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有或化学特性有响应，属于这类检测器的有或化学特性有响应，属于这类检测器的有或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电紫外、荧光、电紫外、荧光、电紫外、荧光、电化学检测器等。化学检测器等。化学检测器等。化学检测器等。 另一类是另一类是另一类是另一类是总体检测器总体检测器总体检测器总体检测器，它

39、对试样和洗脱液总的物，它对试样和洗脱液总的物，它对试样和洗脱液总的物，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有理或化学性质有响应，属于这类检测器的有理或化学性质有响应，属于这类检测器的有理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电示差折光，电示差折光，电示差折光，电导检测器等。导检测器等。导检测器等。导检测器等。 1 1）紫外紫外- -可见吸收检测器可见吸收检测器UV-UV-VisVis： 适用于吸收紫外或可见光的物质适用于吸收紫外或可见光的物质 灵敏度较高，应用范围较广灵敏度较高，应用范围较广 ( (光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器DAD)DAD) 2 2）

40、荧光检测器荧光检测器FLDFLD： 只能分析具有荧光活性的物质只能分析具有荧光活性的物质 灵敏度高，但适用范围有限灵敏度高，但适用范围有限 3 3）示差折光检测器示差折光检测器RIDRID： 利用折光率的差别来检测，为利用折光率的差别来检测，为通用型通用型 检测器检测器，但灵敏度低，温度要求严格，但灵敏度低，温度要求严格 4 4）电化学检测器：）电化学检测器： 常用的有常用的有电导检测器电导检测器和和安培检测器安培检测器 电导检测器电导检测器是测量物质在流动相中电离后所引起的是测量物质在流动相中电离后所引起的电导率的变化，组分浓度越高，电离产生的离子电导率的变化，组分浓度越高，电离产生的离子浓

41、度越高，电导率变化就越大，多用于离子色谱。浓度越高，电导率变化就越大，多用于离子色谱。 安培检测器安培检测器适用于测定所有在工作电极的电压范围适用于测定所有在工作电极的电压范围内发生氧化或还原反应的物质，在生化样品内发生氧化或还原反应的物质，在生化样品分析分析中应用广泛，是迄今最灵敏的中应用广泛，是迄今最灵敏的HPLCHPLC检测器。检测器。5 5）其他检测器）其他检测器 化学发光检测器、质谱检测器等化学发光检测器、质谱检测器等HPLC分析基本操作分析基本操作v1准备：流动相配制、脱气，样品制备。准备：流动相配制、脱气，样品制备。v2开机开机：依次打开：依次打开计算机、泵、检测器、柱温箱电源开

42、计算机、泵、检测器、柱温箱电源开关，仪器自检。关，仪器自检。v3装柱装柱：将吸液头插入已经过滤和脱气处理的甲醇中，：将吸液头插入已经过滤和脱气处理的甲醇中，开启泵，使液体流出，调流速在开启泵，使液体流出，调流速在0.2mL/min，连接色谱柱，连接色谱柱（注意方向），待液体流出色谱柱后，再与检测器连接。（注意方向），待液体流出色谱柱后，再与检测器连接。v4平衡平衡：升高流速（常：升高流速（常规分析柱一般至分析柱一般至1 mL/min），），大大约15min后，后，换上准上准备的流的流动相（若流相（若流动相含相含盐或甲或甲醇比例醇比例较低，中低，中间需适当需适当过渡），待基渡），待基线走走稳。v

43、5仪器面板或色器面板或色谱工作站工作站设置分析条件置分析条件，如，如设置置泵参参数：工作流速、流数：工作流速、流动相比例、高相比例、高压限和低限和低压限；限；设置置检测器参数：如器参数：如检测波波长（nm）、灵敏度（）、灵敏度（AUFS）等；）等；编辑样品名、采集品名、采集时间、进样体体积等。等。HPLC分析基本操作分析基本操作v6待基线走稳后，进样分析，采集图谱。待基线走稳后，进样分析，采集图谱。v7建立数据处理方法，选择峰宽、积分阈值、处理区间、建立数据处理方法，选择峰宽、积分阈值、处理区间、指定最小峰面积和峰高等；处理色谱图，记录色谱信息指定最小峰面积和峰高等；处理色谱图，记录色谱信息

44、（色谱峰面积）。（色谱峰面积）。v8冲洗冲洗 全部测定完毕后，冲洗色谱柱和管路（调节溶剂全部测定完毕后，冲洗色谱柱和管路（调节溶剂洗脱强度从小到大冲洗柱子）。洗脱强度从小到大冲洗柱子）。v9降流速降流速 用面板功能或用色用面板功能或用色谱管理管理软件件调控，流速每控，流速每次降次降0.2mL/min，柱，柱压稳定后再降定后再降0.2mL/min，降到，降到0.0mL/min为止。止。v10退出工作站，关退出工作站，关闭工作站后再关工作站后再关闭计算机。关算机。关闭各各部件部件电源。源。v11登登记使用使用记录。仪器仪器使用注意事项使用注意事项v1HPLC分析所用水均需纯化处理，用新鲜二次蒸馏水或蒸分析所用水均需纯化处理，用新鲜二次蒸馏水或蒸馏水经脱离子处理。馏水经脱离子处理。v2流动相需经过滤、脱气后方可使用。样品需经过滤或高速流动相需经过滤、脱气后方可使用。样品需经过滤或高速离心后方可进样分析。离心后方可进样分析。v3做完实验后，反相色谱柱需用甲醇冲洗做完实验后，反相色谱柱需用甲醇冲洗2030 min。若流。若流动相中含盐类或缓冲溶液，应先配制相同比例的无盐流动相动相中含盐类或缓冲溶液，应先配制相同比例的无盐流动相冲洗，逐渐变化到冲洗，逐渐变化到95%水溶液冲洗，再逐渐变化到用甲醇冲水溶液冲洗，再逐渐变化到用甲醇冲洗，以保护色谱柱和高压输液泵。洗，以保护色谱柱和高压输液泵。