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1、第五章第五章 PCR引物设计引物设计w研究领域：基因克隆、测序、重组w疾病诊断w法医鉴定w亲子鉴定w古生物学研究PCR技术的应用PCR及其衍生技术w兼并引物PCRwRACEw反向PCR（IP-CR）w差异展示PCR(DD-PCR)w多重PCRwTD-PCRwPCR-SSCPwNet-PCRwIC-PCRwHotstartPCRwSPAwRAPDwRealtimePCRwLD-PCRwTall-PCRwMarathonPCRw原位PCRwRT-PCRw不对称PCRwOverlappingPCRw.PCR原理w高温变性w低温退火w适温延伸理论上，只要知道任何一段模板序列，就能按其设计互补的寡核苷酸
2、链做引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。引物是PCR特异性反应的关键。PCR引物 是人工合成的两段寡核苷酸。一个与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。 引物最好在模板cDNA的保守区内设计保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。同时应预测将扩增的片段单链是否形二级结构。如这个区域单链能形二级结构，就避开它。如这一段不能形二级结构，那就可以在这一
3、区域设计引物。w若不能避开这一区域时，用7-deaza-2-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。1、引物设计的原则引物要跟模板紧密结合；引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在；引物不能在别的非目的位点引起高效DNA聚合反应(即错配)。引物设计需要考虑的因素w引物长度（primerlength）w产物长度（productlength）w序列Tm值(meltingtemperature)wG值(internalstability)w引物二聚体及发夹结构（duplexformationandhairpin）w错误引发位点（falseprimingsite）w引物及产物GC含量（co
4、mposition）w有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。引物设计要点（1 1）引物长度:一般，引物的长度引物的长度为16-23bp，常用的长度为18-21bp。PCR产物长度500bp引物长度1618bpPCR产物长度5kb引物长度25bpPCR纪录：23bp长度引物扩增出40kb产物引物设计要点（2 2）w引物引物3端端w引引物物3端端的的碱碱基基一一般般不不用用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高，而其它三种碱基的错误引发效率相对小一些。w3端防止连续三个C或Gw3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，3端不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结
5、构可能，w扩增编码区域，引物3端不要终止于密码子的第3位?w因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。w引物的5端引物的5端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。w引物5端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。 w引物的GC含含量量一一般般为为45-55%，过高或过低都不利于引发反应。上上下下游游引引物物的的GC含量不能相差太大含量不能相差太大。引物设计要点（3 3）w引物的Tm值值。Tm值最好接近72。过高（72）或过低（909009090AscIGGCGCGCCAGGC
6、GCGCCTTTGGCGCGCCAA81012909090909090w先设计引物，对其退火温度和GC含量评价，完后直接在引物前加上酶切位点就OK了w引物是5-GGGGGAAAATTTTTCCCCCCTTTTAAATTT-3wEcoI是GAATTCw保护碱基CCGGAATTCCGGw加酶切位点的引物为w5-CCGGAATTCGGGGGAAAATTTTTCCCCCCTTTTAAATTT-32、引物的自动搜索和评价分析软件的引物设计功能主要体现在2个个方方面面：首先是引引物物分分析析评评价价功功能能，该功能只有少数商业版软件能够做到，其中以“Oligo6”最优秀；其次是引引物物的的自自动动搜搜索索
7、功功能能，各种软件在这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。自动搜索功能以“PremierPrimer”为最强且方便使用，“Oligo 6”其次，其他软件如“VectorNTISuit”、 “Dnasis”、 “Omiga”和“Dnastar”都带有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十分理想。要想得到效果很好的引物，在在自自动动搜搜索索的的基基础础上上还还要要辅辅以以人人工工分分析析。一般认为引物设计软件的最佳搭配是“Oligo”和 “Premier”软 件 合 并 使 用 ， 以“Premier”进行自动搜索，“Oligo”进行分析评价，如此可快速设计出成功率很高的引物。3、引物设计
8、软件常用的引物设计软件常用的引物设计软件Primer Premier 5 Oligo 6WONDERFUL生物信息学系统生物信息学系统PrimerPremier5.0的使用技巧简介v引物设计引物设计v限制性内切酶位点分析限制性内切酶位点分析vmotif查找查找v同源性分析功能同源性分析功能v序列序列“朗读朗读”vDNA与蛋白序列的互换与蛋白序列的互换v简并引物简并引物设计功能设计功能功能：简并引物：简并引物：有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA来设计引物，由于大多数氨基酸的遗传密码不只一种，由氨基酸序列反推DNA序列时，会遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物，
9、它们的序列组成大部分相同，但在某些位点有所变化，称之为简并引物。简并度的计算：简并度的计算：例如“,AlaAsnIleLysMet”的引物Ala=4,Asn=2,Ile=3,Lys=2,Met=142321=48使用步骤及技巧PreimerPremier启动界面复制序列粘贴到此处复制序列粘贴到此处进行引物设计时，点击按钮如果没有特殊要求，建议使用默认设置。引物长度引物类型搜索模式5引物位置范围3引物位置范围产物大小范围手动，自动5对引物对引物每对产物的大小每对产物的大小引物分值引物分值100分为满分分为满分 该图分三部分，最上面是图示PCR模板及产物位置，中间是所选的上下游引物的一些性质，最下
10、面是四种重要指标的分析，包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer），错误引发情况（FalsePriming），及上下游引物之间二聚体形成情况（CrossDimer）。当所分析的引物有这四种结构的形成可能时，按钮由变成。点击该按钮，在左下角的窗口中就会出现该结构的形成情况。一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有，只有。值得注意的是中间一栏的末尾给出该引物的最佳退火温度，可参考应用。5 5加入酶切位点加入酶切位点设计简并引物设计简并引物Premier Primer 5Premier Primer 5提供了提供了提供了提供了8 8种生物遗传密码使种生物
11、遗传密码使种生物遗传密码使种生物遗传密码使用的偏好选择用的偏好选择用的偏好选择用的偏好选择1 1、纤毛虫大核（、纤毛虫大核（、纤毛虫大核（、纤毛虫大核（Ciliate Ciliate MacronuclearMacronuclear）2 2、无脊椎动物线粒体（、无脊椎动物线粒体（、无脊椎动物线粒体（、无脊椎动物线粒体（Invertebrate Invertebrate MitochondrionMitochondrion）3 3、支原体（、支原体（、支原体（、支原体（MycoplasmaMycoplasma）4 4、植物线粒体（、植物线粒体（、植物线粒体（、植物线粒体（Plant Mitoch
12、ondrionPlant Mitochondrion）5 5、原生动物线粒体（、原生动物线粒体（、原生动物线粒体（、原生动物线粒体（Protozoan Protozoan MitochondrionMitochondrion）6 6、一般标准（、一般标准（、一般标准（、一般标准（StandardStandard）7 7、脊椎动物线粒体（、脊椎动物线粒体（、脊椎动物线粒体（、脊椎动物线粒体（Vertebrate Vertebrate MitochondrionMitochondrion）8 8、酵母线粒体（、酵母线粒体（、酵母线粒体（、酵母线粒体（Yeast MitochondrionYeast
13、 Mitochondrion）注意事项注意事项(1) 选择简并性低的氨基酸区域。选择简并性低的氨基酸区域。(2) 根据生物使用密码子的偏性，选择使用率最高的根据生物使用密码子的偏性，选择使用率最高的密码子，进一步限定引物的简并度。密码子，进一步限定引物的简并度。(3) 引物的引物的3端不应存在简并。端不应存在简并。整体评价整体评价 该软件是一款功能全面的引物设计软件，全面地给出了各种参该软件是一款功能全面的引物设计软件，全面地给出了各种参数，并在多个必须的地方给出有效的评价。但是程序在设计中还有数，并在多个必须的地方给出有效的评价。但是程序在设计中还有一些不足。一些不足。如：产物的如：产物的T
14、mTm值和引物的值和引物的TmTm值之间的差异也未能给出评价，值之间的差异也未能给出评价，如果二者差异较大（如果二者差异较大（2222度），则容易造成退火时引物度），则容易造成退火时引物- -模板模板和模板和模板- -模板火之间的竞争。模板火之间的竞争。结果输出方面，只能以图文格式打印，无法转成文本格式结果输出方面，只能以图文格式打印，无法转成文本格式http:/218.242.234.226/wanshan/wlzy.htmw解压密码：w在Win.ini中把vspace=DU改为vspace=PU便可以使用全部功能Oligo6.71使用技巧简介功能在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最著
15、名的。它的使用并不十分复杂，但初学者容易被其复杂的图表吓倒。其初始界面有3个图：Tm图、G图和Frq图（其中Frq是6.22版本的新功能，为邻近6至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性）。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。使用Oligo6.71的启动界面如下：G值值反反映映了了序序列列与与模模板板的的结结合合强强度度，最最好好引引物物的的G值值在在5端端和和中中间间值值比比较较高高，而而在在3端端相相对对低。低。 Tm值值曲曲线线以以选选取取72附附近近为为佳佳，5到到
16、3的的下下降降形状也有利于引物引发聚合反应。形状也有利于引物引发聚合反应。 Frq是是邻邻近近6至至7个个碱碱基基组组成成的的亚亚单单位位在在一一个个指指定定数数据据库库文文件件中中的的出出现现频频率率。Frq曲曲线线揭揭示示了了序序列列片片段段存存在在的的重重复复机机率率大大小小。该该频频率率高高则则增增加加错错误误引引发发的的可可能能性性。选选取取引引物物时时，宜宜选选用用3端端Frq值相对较低的片段。值相对较低的片段。 在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列，如果觉得合适，可点击Tm图块上左下角的Upper按钮，选好上游引物，此时该按钮变成，表示上游引物已选取好。下游引物的选取步骤基
17、本同上，只是按钮变成Lower。当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价。当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价。首先首先，检查引物二聚体尤其是，检查引物二聚体尤其是3端二聚体形成的可能性。端二聚体形成的可能性。第第二二项项检检查查是是发发夹夹结结构构（hairpin）。一一般般来来说说，能能值值以以不不超超过过4.5为好。为好。第第三三项项检检查查为为GC含含量量和和Tm，以以45-55为为宜宜，并并且且应应尽尽量量使使上下游引物的上下游引物的GC含量以及含量以及Tm值保持接近。值保持接近。 如果PCR的模板不是基因组DNA，而是一个特定模板序列，那么最好还进行Falsepriming
18、site的检测。这项检查可以看出引物在非目的位点引发PCR反应的可能性。如果引物在错配位点的引发效率比较高，就可能出假阳性的PCR结果。一般在错配引发效率以不超过100为好，但对于特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为450以上，而在错误位点的引发效率为130，那么这对引物也是可以接受的。 当当我我们们结结束束以以上上四四项项检检测测，按按Alt+P键键弹弹出出PCR窗窗口口，其其中中总总结结性性地地显显示示该该引引物物的的位位置置、产产物物大大小小、Tm值值等等参参数数，最最有有用用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。http:/
