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1、炭疽检验技术炭疽检验技术辽宁省辽宁省cdc 炭疽是由炭疽杆菌引起的人兽共患急性、热性、败血性传染病。其病理变化的特点是脾脏显著肿大，皮下及浆膜下结缔组织出血浸润，血液凝固不良，呈煤焦油样。人感染后多表现为皮肤炭疽、肺炭疽及肠炭疽，偶有伴发败血症。 炭疽炭疽（Anthrax）发病、死亡污染环境形成芽胞经口食入食草动物通过直接接触、消化道、呼吸道等途径感染人类食肉动物偶尔感染革兰氏染色阳性；长而直的大杆菌，菌体两端平直；大小为1.01. 5um35um，致病菌中最大的；无鞭毛，不能运动。一、病原一、病原炭疽杆菌（Bacillusanthracis）荚膜染色在碳酸盐培养基中、厌氧环境下生成荚膜。一、
2、病原一、病原炭疽杆菌（Bacillusanthracis）炭疽杆菌在病人、病畜体内多散在或呈23个短链排列，有荚膜（红色）在活炭疽病畜体或死亡后未经解剖的尸体内，不形成芽胞。一旦体内炭疽杆菌暴露于空气中，接触了游离氧，在一定温度下(12-42)就会形成芽胞。芽胞呈卵圆形或圆形，位于菌体中央或稍偏向一端。一、病原一、病原炭疽杆菌（Bacillusanthracis）A：炭疽芽孢薄片（透射电镜）有致密的胞膜B：炭疽芽孢（扫描电镜）收缩成椭圆形C：炭疽繁殖体薄片（透射电镜） 炭疽杆菌为兼性需氧菌，在1244都能生长，最适生长温度为37。最适pH为7.37.6。在普通琼脂平皿培养基上生长成不透明、灰白
3、色、扁平、表面粗糙的菌落，边缘不整齐，能形成几个或数十个菌体相连的长链，低倍显微镜观察呈卷发状。在血液琼脂平皿培养基上，生长出湿润粘稠的菌落，菌落周围不溶血。二、培养特性二、培养特性光镜下炭疽杆菌菌落边缘呈卷发状在血液琼脂平皿培养基上不溶血或微溶血三、致病性与免疫性三、致病性与免疫性致病物质:主要有二种荚膜:由质粒编码,具有抗吞噬作用炭疽毒素:由质粒编码（致死主要因素）保护性抗原（protective antigen ， PA）水肿因子（edema factor ，EF）致死因子(lethal factor ， LF)四、抵抗力四、抵抗力芽胞抵抗力强煮沸40min或干热140C 3h灭活；在干
4、燥土壤或皮毛中能存活数年至20年；对化学消毒剂抵抗力强(5%石炭酸5d杀死）；对碘及氧化剂较敏感；繁殖体的抵抗力弱对青霉素、红霉素、氯霉素敏感u炭疽病原学检查炭疽病原学检查u炭疽血清学检查炭疽血清学检查五、炭疽实验室检查五、炭疽实验室检查u炭疽病原学检查炭疽病原学检查标本采集和样品处理细菌培养涂片、革兰染色、荚膜染色、光镜检查Ascoli试验动力检查噬菌体裂解和青霉素敏感性试验串珠试验生化试验炭疽PCR基因检测五、炭疽实验室检查五、炭疽实验室检查u炭疽血清学检查炭疽血清学检查标本采集和样品处理血清中抗炭疽芽胞和毒素IgG水平检测 （酶联免疫吸附实验ELISA）血清中抗炭疽荚膜抗体胶体金检测五、
5、炭疽实验室检查五、炭疽实验室检查人间传染的病原微生物名录人间传染的病原微生物名录序号 病原菌名称 危害程度分类 实验活动所需生物安全实验室级别 学名 中文名 大量活菌操作 动物感染实验 样本检测 非感染性材料的实验 1Bacillus anthracis 炭疽芽孢杆菌 第二类 BSL-3 ABSL-3 BSL-2 BSL-1 2Brucella spp 布鲁氏菌属 第二类 BSL-3 ABSL-3 BSL-2 BSL-1 3Burkholderia mallei 鼻疽伯克菌 第二类 BSL-3 ABSL-3 BSL-2 BSL-1 4Coxiella burnetii 伯氏考克斯体 第二类 B
6、SL-3 ABSL-3 BSL-2 BSL-1 大量活菌操作：实验操作涉及大量活菌操作：实验操作涉及“大量大量”病原菌的制备，或易产生气溶胶的实验操病原菌的制备，或易产生气溶胶的实验操作（如病原菌离心、冻干等）。作（如病原菌离心、冻干等）。 动物感染实验：特指以活菌感染的动物实验。动物感染实验：特指以活菌感染的动物实验。 样本检测：包括样本的病原菌分离纯化、药物敏感性实验、生化鉴定、免疫学实样本检测：包括样本的病原菌分离纯化、药物敏感性实验、生化鉴定、免疫学实验、验、PCR核酸提取、涂片、显微观察等初步检测活动。核酸提取、涂片、显微观察等初步检测活动。 非感染性材料的实验：如不含致病性活菌材料
7、的分子生物学、免疫学等实验。非感染性材料的实验：如不含致病性活菌材料的分子生物学、免疫学等实验。炭疽病原炭疽病原检验程序程序标本本处理（方法根据理（方法根据标本情况本情况选择）直接涂片、直接涂片、革兰染色、革兰染色、荚膜染色、荚膜染色、光镜检查光镜检查接种培养接种培养（可用选择性培养基、血培养基）（可用选择性培养基、血培养基）37，1648hAscoli试验基因检测可疑菌落（形可疑菌落（形态）初初检培养性培养性鉴定定试验深入深入鉴定定涂片、革兰涂片、革兰染色、荚膜染色、荚膜染色、染色、光镜检查光镜检查动力力检查液液体体培培养养噬菌体裂解噬菌体裂解和青霉素敏和青霉素敏感性试验感性试验产荚膜培膜培
8、养及光养及光镜检查串串珠珠试验生化试验基因检测酶免疫法测外毒素动物毒性测定采取标本时必须遵循的两条原则采取标本时必须遵循的两条原则1、尽可能的在抗生素治疗前采取标本；2、除必要时并在具备条件的实验室内，不得用解剖的方式获取标本，所需的血液与组织标本，均应以穿刺方式取得。（一）炭疽病原学检查（一）炭疽病原学检查标本采集和样品处理标本采集和样品处理1、血液标本、血液标本 所有的疑似病例和病畜，都应采取血液标本5-10ml，标本量至少应满足下列检查的需要：涂片进行显微镜检查；接种培养基进行细菌分离培养；分离血清检查抗体；常规血液检查。荧光定量PCR检测2、皮肤溃疡标本、皮肤溃疡标本 在皮肤炭疽病人溃
9、疡边缘用棉拭子擦拭，沾取分泌物。（一）炭疽病原学检查（一）炭疽病原学检查标本采集和样品处理标本采集和样品处理3、粪便与呕吐物标本、粪便与呕吐物标本 表现消化道症状的可疑病人收集粪便或呕吐物标本，特别注意选取其中混有血液的部分，置无菌的容器中。4、痰与咳碟标本、痰与咳碟标本 表现为呼吸道症状的可疑病人应收集其痰液标本，无痰液者，应取供细菌分离培养用的培养基，打开平皿盖置病人口鼻10cm处；令病人对平皿咳嗽，然后迅速盖上平皿。（一）炭疽病原学检查（一）炭疽病原学检查标本采集和样品处理标本采集和样品处理5、脑脊液标本、脑脊液标本 表现为脑膜刺激症状的病人，腰椎穿刺获取脑脊液。6、尸体标本、尸体标本
10、食草动物死于炭疽时，通常会从口、鼻、肛门等腔道开口流出血液，这种血液应是首先采取的标本。如果血液已渗入土壤，则应收集混有血液的土壤作为标本。没有血液流出，或已不可能获取血液标本时，可通过穿刺心脏获得血液或穿刺肝脏等实质性脏器获得组织标本。（一）炭疽病原学检查（一）炭疽病原学检查标本采集和样品处理标本采集和样品处理7、肉类标本、肉类标本 如果怀疑罹患炭疽的牲畜已被宰杀，或对商品肉类进行常规检查时，可剪取小块肉类标本。如有可能，特别应剪取肝脏、脾脏等富含血以及含有淋巴组织的标本。8、毛皮或其他可疑污染物品标本、毛皮或其他可疑污染物品标本 剪取小块毛皮或其他可疑物品，剪碎置无菌试管内，加适量的无菌生
11、理盐水浸泡。（一）炭疽病原学检查（一）炭疽病原学检查标本采集和样品处理标本采集和样品处理9、水标本、水标本 检查水体污染时，用广口瓶收集水样。10、土壤标本、土壤标本 在牲畜死亡或宰杀的地点，应取土壤标本以供检查。一般要采集表层土壤（10cm内），每份150g左右。（一）炭疽病原学检查（一）炭疽病原学检查标本采集和样品处理标本采集和样品处理 所有来自病人、病畜、尸体的标本都应首先进行直接涂片镜检。 步骤：步骤： 涂片、革兰染色及荚膜染色、显微镜检查涂片、革兰染色及荚膜染色、显微镜检查 镜检：取末稍血液或其他材料制成涂片后，染色镜检，发现有多量单在、成对或24个菌体相连的短链排列、竹节状有荚膜的
12、粗大杆菌，即可确诊。 （二）炭疽病原学检查（二）炭疽病原学检查显微镜检查显微镜检查革兰染色（二）炭疽病原学检查（二）炭疽病原学检查显微镜检查显微镜检查荚膜染色（二）炭疽病原学检查（二）炭疽病原学检查显微镜检查显微镜检查 采集到的标本均应进行细菌分离培养。 培养基选用血琼脂平板、营养琼脂平板和选择性平板。（三）炭疽病原学检查（三）炭疽病原学检查细菌分离培养细菌分离培养标本处理：标本处理： 无菌的标本，如血液或脑脊液，直接涂布上述两种平板，每平板0.1ml，组织标本应先以无菌剪刀剪开一断面，在培养基表面压印，然后以白金耳涂开。 污染或陈旧的标本，均应首先制成悬液。根据标本中含菌量的多少，可将悬液适
13、当稀释，或经自然沉淀除去粗大沉淀物后，再10000rpm离心1分钟，取富集的沉淀物。将所得的悬液沸水浴15min，冷却后涂布上述两种平板，每平板0.1ml。（三）炭疽病原学检查（三）炭疽病原学检查细菌分离培养细菌分离培养 以上的平皿在37孵育过夜或24小时后，观察培养情况。 粗糙不发光，比较扁平，有点儿象蜡样杆菌的菌落但较小，卷发状。有的菌体形态不规则，有彗星状拖尾，白或灰白色。（三）炭疽病原学检查（三）炭疽病原学检查细菌分离培养细菌分离培养在血平皿上为白色菌落，较粘，不溶血或微溶血 。（三）炭疽病原学检查（三）炭疽病原学检查细菌分离培养细菌分离培养 在静止液体培养基中生长在上层和底部，培养基
14、透明，拿起则呈丝絮状下垂，摇之均匀混浊，无菌膜和壁环 。1、肉汤生长（四）炭疽病原学检查（四）炭疽病原学检查鉴定试验鉴定试验 诊断炭疽简便而快速的方法，其优点是培养失效时，仍可用于诊断，因而适宜于腐败病料及动物皮张或风干、淹浸过肉品的检验。但此法缺乏高度特异性，因为炭疽杆菌耐热抗原在其他腐生芽胞杆菌也共有。 新鲜、陈旧和外环境标本都可采样20-50g，加水5-10倍，煮沸10分钟，用双层滤纸过滤后制成可溶性热沉淀抗原可溶性热沉淀抗原，用于热沉淀反应（Ascoli试验。2、Ascoli试验（四）炭疽病原学检查（四）炭疽病原学检查鉴定试验鉴定试验取一玻璃沉淀管（直径2-4 mm，高20-40 mm
15、），将0.3 ml炭疽菌沉淀血清加于小玻璃管底部，再缓缓加入采集处理的可溶性热沉淀抗原约0.3ml于血清上层，注意勿使液面混合。置37 5 min，于两液面间出现白色沉淀环为阳性。 本实验应有炭疽菌诊断抗原作阳性对照。炭疽菌沉淀血清处理的可溶性热沉淀抗原白色沉淀环（四）炭疽病原学检查（四）炭疽病原学检查鉴定试验鉴定试验2、Ascoli试验 在盖玻片周围涂凡士林，将待检菌的液体培养物或固体培养物用生理盐水制成的均匀悬液滴于中央，再将凹玻片盖于其上。迅速翻过来使盖玻片在上，菌悬液悬成滴。置高倍镜下观察，细菌不应有运动。3、动力试验（四）炭疽病原学检查（四）炭疽病原学检查鉴定试验鉴定试验4、噬菌体裂
16、解和青霉素敏感性将挑取的可疑菌落密集划线接种于平板上，在划线区内一处滴一诊断用炭疽噬菌体，另一处贴一片青霉素纸片。37 孵育824h后，在滴噬菌体处有透明噬菌体斑，青霉素纸片周围有明显的抑菌环，便宜可断定接种物为炭疽芽胞杆菌。（四）炭疽病原学检查（四）炭疽病原学检查鉴定试验鉴定试验4、噬菌体裂解和青霉素敏感性（四）炭疽病原学检查（四）炭疽病原学检查鉴定试验鉴定试验 制备有牛肉消化液琼脂培养基的载玻片，涂种待检菌，在一端加青霉素纸片或纸条。置平皿中于37培养4 6小时后，在低倍镜下观察。在有菌生长和抑菌区的临界线处，应有明显典型串珠形态。5、串珠试验串珠试验时炭疽杆菌的形态：串珠状或长链状（四）
17、炭疽病原学检查（四）炭疽病原学检查鉴定试验鉴定试验葡萄糖麦芽糖蔗糖乳糖甘露醇水杨素MRVP石蕊牛乳+产酸，液化迟缓产酸不产气不产生靛基质和H2S6、生化试验 API 50CH/E鉴定条可以进行炭疽生化鉴定（四）炭疽病原学检查（四）炭疽病原学检查鉴定试验鉴定试验待测模板的制备：待测模板的制备： 模板制备可直接从标本样品，也可从培养物制。标本将炭疽杆菌接种于固体培养基平板上，37培养18h，取培养物悬浮于1ml生理盐水，离心，弃上清，沉淀用ph7.8TE溶液洗起悬浮，于沸水浴中煮15min。离心，上清用0.22um的滤器除菌过滤。滤液即为模板，可置4备用于PCR扩增。（五）炭疽病原学检查（五）炭疽
18、病原学检查PCR鉴定试验鉴定试验cap外F：CCTGGTTGTTCTTTTCGTTGCcap外R：CGGATTGTATATGGAGTGGG 产物大：1242bp rpoB普1F：GTACGCCAATCGATATCATGrpoB普1R：GATCATCGTCATCTTCCGTA 产物大小：618bp pagA普F: ATTTGCGGTAACACTTCACTpagA普R: AGACCGTGACAATGATGGAA 产物大小：923bp引物序列：引物序列：（五）炭疽病原学检查（五）炭疽病原学检查PCR鉴定试验鉴定试验 反应体系反应体系 (50l)10反应缓冲液 5l4dNTP混合物（每种2.5mM）
19、4l引物（上游） 1l引物（下游） 1l待测模板 1l无菌去离子水 37lTaq DNA 聚合酶 1l 反应条件：反应条件： 预变性95 5min；然后95 1 min，55 1 min，72 1 min，30个循环；最后72 5 min。（五）炭疽病原学检查（五）炭疽病原学检查PCR鉴定试验鉴定试验标本采集和样品处理血清中抗炭疽芽胞和毒素IgG水平检测 （酶联免疫吸附实验ELISA）血清中抗炭疽荚膜抗体胶体金检测 炭疽血清学检查炭疽血清学检查根据血清学检验的结果可以对病人做出追溯诊断，由于诊断必须由双份血清做出，需要特别强调急性期血清的采取。首份血清应在检视病人时采取，通常应一次采取血液标本
20、供涂片镜检，细菌分离培养，血清学检查及常规的血液检查使用。血清分离后置4保存，待获得恢复期血清后，一同进行抗体检查。恢复期血清应在发病后15日左右采取。（一）炭疽血清学检查（一）炭疽血清学检查标本采集和样品处理标本采集和样品处理（二）炭疽血清学检查（二）炭疽血清学检查抗炭疽芽胞和毒素抗炭疽芽胞和毒素IgG水平水平ELISA测定定抗炭疽芽胞和毒素抗炭疽芽胞和毒素IgG水平水平ELISA测定程序定程序包被抗原包被抗原：所用各孔加入检测用炭疽标准芽胞抗原液或检测用炭疽毒素抗原液100l，酶标板贴上封口膜，置4过夜。次日，甩干孔内溶液，每孔加洗涤缓冲液100l，甩干，反复洗涤3次，每次3min。待待检
21、血清反血清反应：每种待测血清使用两行，以增加测定结果的可分析性。两行的112孔各加生理氯化钠溶液100l。在第1孔加待测血清100l，从第1孔以倍比稀释法向后至第12孔进行稀释混匀。酶标板贴上封口膜，置3760min。甩干孔内溶液，每孔加洗涤缓冲液100l，甩干，反复洗涤3次，每次3min。(同时做空白、正常血清孔对照)酶酶标抗体反抗体反应：于各反应孔中加入新鲜稀释的工作浓度的辣根过氧化物酶标记的羊（兔）抗人IgG或辣根过氧化物酶标记SPA100l，酶标板贴上封口膜，置3760min。甩干孔内溶液，每孔加洗涤缓冲液100l，甩干，反复洗涤3次，每次3min。显色反色反应：于各反应孔中加入显色底
22、物A、B溶液50l，酶标板贴上封口膜，置暗处20min。终止止显色色：于各反应孔中加入显色终止液100l。OD值读取和取和结果果判定判定：在酶标仪上，于450nm波长处，被检测孔OD值达阴性血清对照孔OD值2.1倍时，可判断为阳性。也可用目测判读，被检测孔显示与阴性对照孔具有明显区别的黄褐色时，可判为阳性。（二）炭疽血清学检查（二）炭疽血清学检查抗炭疽芽胞和毒素抗炭疽芽胞和毒素IgG水平水平ELISA测定测定注意事项：u标本采集时应尽量避免溶血，因红细胞破裂可释放过氧化物酶活性物质,以HRP为标记的ELISA 测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色；菌体中可能含有内源性HRP,长菌的标本同样的
23、道理易产生假阳性。u抗凝不完全的标本因纤维蛋白原的干扰而造成假阳性，建议尽量不用抗凝血尤其是用肝素抗凝剂。u标本在冰箱中保存时间过长易导致血清IgG聚合，一般血清置4冰箱5天内完成测试。如需保存一周以上则要-20冷冻保存，融解时应上下颠倒充分混匀，同时避免气泡。（三）炭疽血清学检查（三）炭疽血清学检查血清中抗炭疽荚膜抗体胶体金检测血清中抗炭疽荚膜抗体胶体金检测检测对象为抗荚膜抗体，疫苗株不带有荚膜，因此可以鉴别免疫接种与感染。 可以检测循环总抗体，即IgG、IgM均可检出。 检测方法：将人活动物血清标本1：40稀释后，取150ul加入加样孔，2分钟后开始观察，15分钟终止观察。阴性阴性阳性阳性 Thank You ！
