DNA重组技术的基本工具1实用教案

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1、你还记得你还记得你还记得你还记得(jde)(jde)我们吗？我们吗？我们吗？我们吗？ 氢键氢键(qnjin)(qnjin) 磷酸二酯键磷酸二酯键 DNADNA聚合酶聚合酶第1页/共47页第一页，共48页。第2页/共47页第二页，共48页。别名：操作环境(hunjng)：原理：操作水平：结果： 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于(yuy)基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术或基因拼接技术。基因(jyn)拼接技术或DNA重组技术生物体外基因重

2、组基因重组DNA分子水平定向地改造生物的遗传性状，获得人类所需要的品种。基因工程的概念：基因工程的概念：第3页/共47页第三页，共48页。基因工程(jyn gngchng)的产物第4页/共47页第四页，共48页。普通普通(ptng)(ptng)棉花棉花抗虫棉抗虫棉第5页/共47页第五页，共48页。基因工程培育(piy)抗虫棉的简要过程：普通(ptng)棉花(无抗虫基因)苏云金芽孢(ybo)杆菌提取提取抗虫基因与运载体DNA拼接拼接导入棉花细胞棉花细胞( (含抗虫基因)转基因棉花植株第6页/共47页第六页，共48页。 1 .1、DNA重组技术(jsh)的基本工具“分子(fnz)手术刀”-“分子(

3、fnz)缝合针”-“分子(fnz)运输车”-限制性核酸(h sun)内切酶DNA连接酶运载体第7页/共47页第七页，共48页。1、简称(jinchng)：2、分布：一、限制性核酸(hsun)内切酶“分子手术刀”主要(zhyo)在原核生物中限制酶寻根问底(P4) 你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？第8页/共47页第八页，共48页。原核生物易受自然界外源原核生物易受自然界外源DNADNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防

4、御性工具，当外源防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNADNA侵侵入时，会利用限制酶将外源入时，会利用限制酶将外源DNADNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要主要(zhyo)(zhyo)起到切割外源起到切割外源DNADNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。、使之失效，从而达到保护自身的目的。限制(xinzh)酶在原核生物中的作用第9页/共47页第九页，共48页。3、特点(tdin):一、限制性核酸(hsun)内切酶“分子手术刀”识别特定(tdng)核苷酸列,特定(tdng)位点切割（

5、专一性）断裂：磷酸二酯键第10页/共47页第十页，共48页。第11页/共47页第十一页，共48页。限制(xinzh)酶的识别特点以中轴线双侧的DNA上碱基呈反向对称(duchn)，重复排列如：GAATTCCCCGGGCTTAAGGGGCCC第12页/共47页第十二页，共48页。第13页/共47页第十三页，共48页。EcoR黏性末端黏性末端(m (m dun)dun)黏性末端(mdun)GobackGoback第14页/共47页第十四页，共48页。 什么什么(shnme)(shnme)叫黏性末端？叫黏性末端？被限制酶切开的被限制酶切开的DNADNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正

6、好互两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补补(hb)(hb)配对，这样的切口叫黏性末端。配对，这样的切口叫黏性末端。第15页/共47页第十五页，共48页。Sma平末端平末端(mdun)(mdun)平末端平末端(mdun)(mdun)第16页/共47页第十六页，共48页。作用(zuyng)：结果：一、限制性核酸(hsun)内切酶“分子手术刀”切割(qig)DNA产生黏性未端和平末端第17页/共47页第十七页，共48页。3、特点(tdin):4、作用(zuyng)：5、结果：1、简称(jinchng)：2、分布：工具1：限制性核酸内切酶主要在原核生物中限制酶识别特定核苷酸列,切割特

7、定切点（专一性）切割DNA产生黏性未端或平末端第18页/共47页第十八页，共48页。 要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生(chnshng)(chnshng)几个黏性几个黏性( (平平) )末端？末端？要切两个切口，产生要切两个切口，产生(chnshng)(chnshng)四个黏性四个黏性( (平平) )末端。末端。 如果如果(rgu)(rgu)把两种来源不同的把两种来源不同的DNADNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生会产生相同的黏性相同的黏性( (平平) )末端末端，然后让

8、两者的黏性，然后让两者的黏性( (平平) )末端末端黏合黏合起来，就似乎可起来，就似乎可以合成重组的以合成重组的DNADNA分子了。分子了。思考?第19页/共47页第十九页，共48页。GobackGobackGAATTCGAATTCCTTAAGCTTAAGGAATTCGAATTCCTTAAGEcoRG GAATTCCTTAACTTAAG GG GAATTCAATTCCTTAACTTAAG G不同来源不同来源(liyun)(liyun)的的DNADNA片段混合片段混合将不同种来源将不同种来源(liyun)(liyun)的的DNADNA片段连接起片段连接起来来生物生物A A基因基因(jyn)(jy

9、n)片片段段生物生物B基因片段基因片段GAATTCAATTCCTTAACTTAAG GG GAATTCAATTCCTTAAG G酶切酶切第20页/共47页第二十页，共48页。思考(sko)与探究 P72 2、为什么限制酶不剪切细菌、为什么限制酶不剪切细菌(xjn)(xjn)本身的本身的DNADNA？ 通过长期的进化，含有某种限制酶的细胞，其通过长期的进化，含有某种限制酶的细胞，其DNADNA分子中或者不具备分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细

10、菌中含有某种限制酶也不会碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的使自身的DNADNA被切断，并且可以被切断，并且可以(ky)(ky)防止外源防止外源DNADNA的入侵。的入侵。 第21页/共47页第二十一页，共48页。1 1、作用、作用(zuyng):(zuyng):把把DNADNA片段片段(pindun)(pindun)拼接成新的拼接成新的DNADNA，2 2、作用、作用(zuyng)(zuyng)原理：原理：催催化化磷磷酸酸二二酯酯键键形形成成,不不是氢键是氢键二、DNA连接酶“分子缝合针”第22页/共47页第二十二页，共48页。可把黏性末端之间的缝隙可把

11、黏性末端之间的缝隙(fngx)“(fngx)“缝合缝合” ”起来，起来，即恢复被限制即恢复被限制(xinzh)(xinzh)酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键第23页/共47页第二十三页，共48页。T T4 4DNADNA连接酶连接酶第24页/共47页第二十四页，共48页。3、类型(lixng)：类型EcoliDNA连接酶连接酶T4 4DNADNA连接酶连接酶来源(liyun)功能(gngnng)大肠杆菌T T4噬菌体噬菌体只能连接只能连接黏性末端能连接能连接黏性末端黏性末端和和平末端第25页/共47页第二十五页，共48页。DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA

12、连接酶连接酶用途用途寻根问底(xn gn wn d) (P6) DNADNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶是一回事聚合酶是一回事(hush)(hush)吗吗? ?为什么为什么? ?将单个核苷酸连接到将单个核苷酸连接到已有的核酸已有的核酸(h sun)(h sun)片段上，形成磷酸二片段上，形成磷酸二酯键酯键在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键作用对象DNA复制基因重租基因重租4、 DNADNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶比较聚合酶比较第26页/共47页第二十六页，共48页。3、类型(lixng)EcoliDNA连接酶来源(liyun)：大肠杆菌作用(zuyng)特点：只连接黏性末端T4

13、DNA连接酶来源：T4噬菌体作用特点：连接黏性末端和平末端2、作用原理：、作用原理：催化催化磷酸二酯键磷酸二酯键形成形成1 1、作用、作用: :：工具2：DNA连接酶把把DNADNA片段片段拼接成新的拼接成新的DNADNA，4、 DNADNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶比较聚合酶比较第27页/共47页第二十七页，共48页。 P7.思考(sko)与讨论：限制酶在DNA的任何部位都能将DNA切开吗？以下是四种不同限制酶切割形成的DNA片段:你是否能用DNA连接酶将它们连接起来？ CTGCAGACTGCGGCGCTTAAGACGTCGCCGGTCAAATTCG和能连接(linji)形成ACTG

14、GTCA和能连接(linji)形成GCTTAAAATTCGCGGCGCCG和能连接形成和能连接形成CTGCAGGACGTC反反向向对对称称第28页/共47页第二十八页，共48页。4 4、DNADNA连接连接(linji)(linji)酶有连接酶有连接(linji)(linji)单链单链DNADNA的本领吗？的本领吗？ 迄今为止，所发现的迄今为止，所发现的DNADNA连接酶都不具有连接单链连接酶都不具有连接单链DNADNA的能力，至于原因，现在的能力，至于原因，现在(xinzi)(xinzi)还不清楚，也许将来会发现可以连接单链还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNADNA的酶。的酶。思考(s

15、ko)与探究 P7第29页/共47页第二十九页，共48页。 1、载体必须具备的条件：能够在宿主细胞中复制或整合到受体细胞的染色体DNA上复制具有一至多个限制酶切点，以便与 外源基因连接(linji)具有某些标记基因，便于进行筛选。对受体细胞无害 三、基因(jyn)进入受体细胞的载体 “分子运输车”第30页/共47页第三十页，共48页。2、常用(chnyn)的载体：质粒（最常用(chnyn)噬菌体的衍生物，动植物病毒等第31页/共47页第三十一页，共48页。能复制并带着能复制并带着插入插入(ch r)(ch r)的目的基因一的目的基因一起复制起复制有切割(qig)位点有标记有标记(bioj)(b

16、ioj)基因基因3、质粒本质：小型本质：小型环状DNA分子。分布：许多细菌分布：许多细菌第32页/共47页第三十二页，共48页。工具工具(gngj)3(gngj)3：运载体：运载体1、需要(xyo)的条件：有1多个限制酶切点能在受体细胞中自我复制，或整合到受体细胞的 染色体DNA上复制有某些标记基因，便于筛选 对受体细胞无害2、常用运载体： 质粒、噬菌体的衍生物或某些动植物病毒3、质粒 第33页/共47页第三十三页，共48页。3 3、天然的、天然的DNADNA分子分子(fnz)(fnz)可以直接用做基因工程载体吗？为什么？可以直接用做基因工程载体吗？为什么？不可以，作为基因工程使用(shyng

17、)的载体必需满足一定条件,且都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。思考(sko)与探究 P7第34页/共47页第三十四页，共48页。1、在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段，需使用（）同种(tnzhn)限制酶B.两种限制酶同种(tnzhn)连接酶D.两种连接酶反馈反馈(fnku)练习：练习：第35页/共47页第三十五页，共48页。2 2、不属于质粒被选为基因运载体的理由是、不属于质粒被选为基因运载体的理由是AA、能复制、能复制（）BB、有多个限制、有多个限制(xinzh)(xinzh)酶切点酶切点 CC、具有标记基因、具有标记基因DD、它是环状、它是环状DNADNAD第36页/

18、共47页第三十六页，共48页。3 3、下列不适合用于基因工程的运载体、下列不适合用于基因工程的运载体是（是（ ） A A、质粒、质粒 B B、噬菌体、噬菌体 C C、细菌、细菌 D D、病毒、病毒选我C4、下列说法正确的是：（、下列说法正确的是：（ ） A、限制、限制(xinzh)酶的切口一定是酶的切口一定是GAATTC碱基序列碱基序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、重组技术所用的工具酶是限制、重组技术所用的工具酶是限制(xinzh)酶、酶、 连接酶、运载体连接酶、运载体 D、利用运载体在宿主细胞内对目的基因、利用运载体在宿主细胞内对目的基因 进行大量复制

19、的过程可称为进行大量复制的过程可称为“克隆克隆”选我D审题审题第37页/共47页第三十七页，共48页。5、以下是两种限制、以下是两种限制(xinzh)酶切割后形成的酶切割后形成的DNA片段，片段，试分析：试分析：GC AATTC GC CTTAA CG G CG G (1)其中其中和和 是由一种限制酶切割是由一种限制酶切割(qig)形成的形成的 末端，两者要重组成一个末端，两者要重组成一个DNA 分子，所用分子，所用DNA连接酶通连接酶通常是常是 。 （2） 和和 是由另一种限制酶切割是由另一种限制酶切割(qig)形成的形成的 末端，两者要形成重组末端，两者要形成重组DNA片段，所用的连接酶通

20、常是片段，所用的连接酶通常是 。反馈反馈(fnku)练习：练习：第38页/共47页第三十八页，共48页。再见再见(zijin)第39页/共47页第三十九页，共48页。1)基因转移载体的发现2)工具酶的发现3)DNA合成(hchng)和测序技术的发明技术发明命使基因工程的实施成为(chngwi)可能1967年年罗罗思思和和赫赫林林斯斯基基发发现现细细菌菌质质粒粒有有自自我我复复制制能能力力,为为基基因因(jyn)转移找到一种运载工具转移找到一种运载工具.1970年年阿阿尔尔伯伯(W.Arber)、内内森森斯斯(D,Nathans)、史史密密斯斯(H.C.Smith)细菌中细菌中发现了第一个限制酶

21、发现了第一个限制酶1977年科学家又年科学家又发明了发明了DNA序列分析方法序列分析方法1965年桑格年桑格发明了氨基酸序列分析技术发明了氨基酸序列分析技术第43页/共47页第四十三页，共48页。4)DNA体外重组(zhnz)的实现1972年年伯伯格格(P.Berg)首首先先在在体体外外进进行行了了DNA改改造造的的研研究究(ynji),成成功功地地构构建了第一个人工体外重组建了第一个人工体外重组DNA分子分子.第44页/共47页第四十四页，共48页。1973年年博博耶耶和和科科恩恩使使重重组组DNA转转入入大大肠肠杆杆菌菌中中,转转录录出出相相应应的的mRNA,并并使使外外源源基基因因可可以

22、以在在原原核核细细胞胞中中成成功功表表达达(biod),至此表明基因工程正式问世至此表明基因工程正式问世.1973年科学家才将质粒作为基因的载体年科学家才将质粒作为基因的载体(zit)使使用用这是基因工程这是基因工程(jyn gngchng)发展史上第一个成发展史上第一个成功的基因克隆实验功的基因克隆实验1973年科恩第一个建成年科恩第一个建成“基因工程菌基因工程菌”，并创立，并创立基因工程模式基因工程模式1973年称这年称这“基因工程元年基因工程元年”，科恩被称为基因工程发展史上的创始人科恩被称为基因工程发展史上的创始人科恩并向美国申报了世界上第一个基因工程的科恩并向美国申报了世界上第一个基

23、因工程的专利技术专利技术5)重组DNA表达实验的成功第45页/共47页第四十五页，共48页。1980年年 第第 一一 个个 转转 基基 因因 小小 鼠鼠 问问 世世(wnsh)1982年采用显微注射技术年采用显微注射技术(jsh)培养目出培养目出”超级小鼠超级小鼠”1983年年培培育育出出第第一一例例转转基基因因烟烟草草(ynco)1988年年穆穆里里斯斯发发明明了了PCR技技术术,使使基基因因工工程程技技术术得得到到了了进进一一步步的的发发展展和和完完善善.获获1993年年诺诺贝贝尔尔化学奖化学奖1993年年中中国国农农业业科科学学院院的的科科学学成成功功之之路路地地培培育育出出抗抗棉棉铃铃

24、虫的转基因抗虫棉虫的转基因抗虫棉6)第一例转基因动物问世7)PCR技术的发明第46页/共47页第四十六页，共48页。感谢您的欣赏(xnshng)！第47页/共47页第四十七页，共48页。内容(nirng)总结你还记得我们吗。第1页/共47页。1 .1、DNA重组技术的基本工具。你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗。要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口。作用特点：连接黏性末端和平末端。能够(nnggu)在宿主细胞中复制或整合到受体细胞的染色体DNA上复制。能复制并带着插入的目的基因一起复制。不可以，作为基因工程使用的载体必需满足一定条件,且都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。第46页/共47页。感谢您的欣赏第四十八页，共48页。