第二章微生物发酵产酶

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1、第二章第二章 微生物发酵产酶微生物发酵产酶重点：重点： 微生物细胞中酶生物合成的调节，酶生物微生物细胞中酶生物合成的调节，酶生物合成的模式，酶发酵生产的工艺条件及其控合成的模式，酶发酵生产的工艺条件及其控制，提高酶产率的措施，固定化微生物发酵制，提高酶产率的措施，固定化微生物发酵产酶。产酶。微生物发酵产酶微生物发酵产酶是指在人工控制的条件下，有目的地利用微生是指在人工控制的条件下，有目的地利用微生物培养来生产所需的酶，其技术包括培养基和物培养来生产所需的酶，其技术包括培养基和发酵方式的选择，以及发酵条件的控制管理等发酵方式的选择，以及发酵条件的控制管理等方面的内容。方面的内容。在一定的条件下，

2、酶可以催化各种生化反应，在一定的条件下，酶可以催化各种生化反应，并且具有催化效率高、转一性强和作用条件稳并且具有催化效率高、转一性强和作用条件稳定等特点，所以酶在医药、食品、轻工、化工、定等特点，所以酶在医药、食品、轻工、化工、环保、能源和生物工程等领域广泛应用。环保、能源和生物工程等领域广泛应用。微生物发酵产酶的工艺流程微生物发酵产酶的工艺流程产酶菌种的筛选产酶菌种的筛选 含菌样品的采集含菌样品的采集, ,菌种分离菌种分离, ,产酶性能测定及复产酶性能测定及复筛等全过程。筛等全过程。 一个优良的产酶菌种应具备以下几点：一个优良的产酶菌种应具备以下几点： a a 繁殖快繁殖快, ,产酶量高，有

3、利于缩短生产周期产酶量高，有利于缩短生产周期 b b 容易培养和管理容易培养和管理 c c 产酶性能稳定，菌株不易退化，不易受噬菌体侵袭产酶性能稳定，菌株不易退化，不易受噬菌体侵袭 d d 产生的酶容易分离纯化产生的酶容易分离纯化 e e 安全可靠、无毒性安全可靠、无毒性微生物酶的类型微生物酶的类型 1.1.胞外酶：细胞内合成而在细胞外起作用的胞外酶：细胞内合成而在细胞外起作用的酶。包括位于细胞外表面或细胞外质空间的酶。包括位于细胞外表面或细胞外质空间的酶，也指酶，也指释放入培养基释放入培养基的的酶酶。大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、 纤维素纤维素酶、果胶酶），

4、是微生物为了利用环境中的酶、果胶酶），是微生物为了利用环境中的大分子而释放到细胞外的。大分子而释放到细胞外的。2.2.胞内酶：指合成后仍留在细胞内发挥作用胞内酶：指合成后仍留在细胞内发挥作用的酶的酶，这些酶在细胞内常与颗粒体结合并有这些酶在细胞内常与颗粒体结合并有着一定的分布。着一定的分布。 如线粒体上分布着三羧酸循环酶系和氧化如线粒体上分布着三羧酸循环酶系和氧化磷酸化酶系，而蛋白质合成的酶系则分布在磷酸化酶系，而蛋白质合成的酶系则分布在内质网的核糖体上。内质网的核糖体上。 酶的发酵生产方式酶的发酵生产方式 固体培养发酵固体培养发酵: :把菌种接入固体培养基中把菌种接入固体培养基中, ,保温数

5、天保温数天, ,用水或缓冲液浸泡培养基用水或缓冲液浸泡培养基, ,将酶抽将酶抽提提, ,测定酶活力测定酶活力, ,这种方法主要适用于霉菌这种方法主要适用于霉菌. . 适合于传统发酵工艺及乡镇企业用来生产比较适合于传统发酵工艺及乡镇企业用来生产比较简单的产品。简单的产品。液体深层发酵液体深层发酵: :采用液体培养基采用液体培养基, ,置于生物置于生物反应器中，经过灭菌、冷却后，接种产酶细反应器中，经过灭菌、冷却后，接种产酶细胞，在一定条件下，进行发酵，生产得到所胞，在一定条件下，进行发酵，生产得到所需的酶需的酶. . 适合于大规模工业化生产。适合于大规模工业化生产。液体深层发酵液体深层发酵优点优

6、点液体悬浮状态是很多微生物的最适生长条件液体悬浮状态是很多微生物的最适生长条件在液体中菌体、营养物、产物易于扩散，便于控制在液体中菌体、营养物、产物易于扩散，便于控制液体输送方便，易于机械化操作液体输送方便，易于机械化操作占地面积小，生产效率高，易进行自动化控制占地面积小，生产效率高，易进行自动化控制产品易于提取和精制等产品易于提取和精制等固定化微生物细胞发酵和固定化微生物原生质体发酵固定化微生物细胞发酵和固定化微生物原生质体发酵前者是前者是2020世纪世纪7070年代后期，在固定化酶的基础上发展起年代后期，在固定化酶的基础上发展起来的发酵技术。是固定在水不溶性的载体上，在一定的来的发酵技术。

7、是固定在水不溶性的载体上，在一定的空间范围内进行生命活动的细胞。空间范围内进行生命活动的细胞。后者是后者是2020世纪世纪8080年代中期发展起来的技术。是固定在载年代中期发展起来的技术。是固定在载体上，在一定的空间范围内进行生命活动的原生质体。体上，在一定的空间范围内进行生命活动的原生质体。固定化酶的优缺点固定化酶的优缺点优点优点多次使用多次使用 可以连续反应可以连续反应纯化简单纯化简单提高产物质量提高产物质量应用范围广应用范围广固定化原生质体的优点固定化原生质体的优点属于胞内产物的胞内酶等分泌到胞外属于胞内产物的胞内酶等分泌到胞外稳定性较好，可以连续或重复使用较长时间稳定性较好，可以连续或

8、重复使用较长时间第一节第一节 酶生物合成的基本理论酶生物合成的基本理论 提取分离法提取分离法 微生物细胞发酵产酶微生物细胞发酵产酶 酶的生产方法酶的生产方法 生物合成法生物合成法 植物细胞发酵产酶植物细胞发酵产酶 化学合成法化学合成法 动物细胞发酵产酶动物细胞发酵产酶 一、酶的生物合成一、酶的生物合成 遗传信息传递的中心法则遗传信息传递的中心法则 蛋白质蛋白质翻译翻译转录转录逆转录逆转录复制复制复制复制DNARNA （一）（一）RNARNA的生物合成的生物合成-转录转录(transcription) 定义定义 以以DNADNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在为模板，以核苷三磷酸为底物，在RNAR

9、NA聚合酶（转录酶）的作用下，生成聚合酶（转录酶）的作用下，生成RNARNA分分子的过程。子的过程。转录模板转录模板 启动子（启动子（promotor) 终止子终止子(terminator)模板链（模板链（template strand）反意义链反意义链(antisense strand)编码链编码链 (coding strand)有意义链有意义链(sense strand)DNADNA5533反意义链反意义链: :指导转录作用的一条指导转录作用的一条DNADNA链链有意义链有意义链: :无转录功能的一条无转录功能的一条DNADNA链链. .T C G A G T A CA G C T C A

10、 T GC G A G U A CG C A URNA聚合酶聚合酶有意义链有意义链反意义链反意义链RNAPPi5 55 53 3GTPUTPCTPATPUTPRNA在在DNA模板上的生物合成模板上的生物合成3 33 35 5RNARNA的转录过程的转录过程( (三步三步) )1.1.起始起始2.2.延长延长3.3.终止终止 原核生物的原核生物的RNA聚合酶聚合酶(DDRP)E. coliE. coli的的RNARNA聚合酶是由四种亚基组成的五聚体（聚合酶是由四种亚基组成的五聚体（ 2 2 ） 起始因子RNARNA合成过程合成过程起始起始双链双链DNA局部解开局部解开磷酸二酯磷酸二酯键形成键形成

11、终止阶段终止阶段解链区到达解链区到达基因终点基因终点延长阶段延长阶段5 3 RNA 启动子启动子（promotor) 终止子终止子(terminator)5 RNA聚合酶聚合酶 5 3 5 3 5 5 3 离开离开RNA链的延伸图解链的延伸图解35RNA-DNA杂交螺旋杂交螺旋聚合酶的移动方向聚合酶的移动方向新生新生RNA复链复链解链解链有义链有义链模板链（反义链）模板链（反义链）延长部位延长部位启动子：在启动子：在DNADNA分子上，分子上，RNARNA聚合酶识别和结合的聚合酶识别和结合的 核苷酸序列，即转录作用起始的部位。核苷酸序列，即转录作用起始的部位。终止子：终止子：DNADNA上的一

12、段核苷酸序列，给上的一段核苷酸序列，给RNARNA聚合酶聚合酶 提供终止转录的信号，也称终止序列。提供终止转录的信号，也称终止序列。操纵子：转录的功能单位。操纵子：转录的功能单位。 （调控系统和结构基因的综合）。（调控系统和结构基因的综合）。原核生物的基因组成原核生物的基因组成（1 1）基因区：操纵子形式存在，但各基因分别有）基因区：操纵子形式存在，但各基因分别有 ATGATG的起始密码子和的起始密码子和TAATAA（TAGTAG、TGATGA）的终止密）的终止密 码子。码子。（2 2）启动区：）启动区：RNApolRNApol识别、结合和开始转录的一识别、结合和开始转录的一 段段DNADNA

13、核苷酸序列。核苷酸序列。5TTGACATATAATA/G33AACTGTATATTAT/C5-35序列序列-10序列序列识别序列识别序列Pribnow框框转录起点转录起点1619bp59bp（3 3）SDSD区：在起始密码子区：在起始密码子ATGATG上游约上游约10bp10bp处，有处，有一个富含嘌呤的保守序列，其与一个富含嘌呤的保守序列，其与16S rRNA316S rRNA3端序端序列互补。列互补。SD序列：序列：5AGGAGGU33UCCUCCA516SrRNA（4 4）转录终止子和终止因子）转录终止子和终止因子转录终止子：一个基因或一个操纵子转录终止子：一个基因或一个操纵子33端，提

14、供转录停止信号端，提供转录停止信号的的DNADNA核苷酸序列。核苷酸序列。终止因子：协助终止因子：协助mRNAmRNA聚合酶识别终止信号的辅助因子的蛋白。聚合酶识别终止信号的辅助因子的蛋白。A. -independent真核生物基因组成真核生物基因组成（1 1）基因区：）基因区：（2 2）转录启动区：）转录启动区：mRNArDNAmDNAtDNArRNAtRNARNApoLIRNApoLIIIRNApoLIIaa35构成核糖体构成核糖体NmRNAproteinP1P3P2DNA（3 3）转录终止子：）转录终止子：对真核生物转录的终止子信号和终止过程了解对真核生物转录的终止子信号和终止过程了解甚

15、少。但在高等真核生物的细胞中，甚少。但在高等真核生物的细胞中，mRNAmRNA在靠在靠近近3 3端区有一段非常保守的序列端区有一段非常保守的序列 AAUAAAAAUAAA，这，这一序列为链的切断和一序列为链的切断和poly(A)poly(A)化提供了某些终化提供了某些终止信号。止信号。 定义定义 以以mRNAmRNA为模板，以氨基酸为底物，在核糖为模板，以氨基酸为底物，在核糖体上通过各种体上通过各种tRNAtRNA、酶和辅助因子的作用，合、酶和辅助因子的作用，合成多肽链的过程。成多肽链的过程。（二）蛋白质的生物合成（二）蛋白质的生物合成（二）蛋白质的生物合成（二）蛋白质的生物合成-翻译翻译翻译

16、翻译(translation)(translation) 酪酪5 55 53 3AUGGUU UAC ACA酪氨酰酪氨酰- tRNA反密码反密码mRNA密码与反密码的碱基配对密码与反密码的碱基配对AUG ACA5 5蛋蛋苏苏UGUGUU3 3受受 位位(A位位)给给 位位(P位位)大亚基大亚基小亚基小亚基原核生物真核生物核蛋白体小亚基大亚基核蛋白体小亚基大亚基S70S30S50S80S40S60SrRNA16S-rRNA5S-rRNA23S-rRNA18S-rRNA28S-rRNA5S-rRNA5.8S-rRNA蛋白质rpS 21种rpL 36种rpS 33种rpL 49种 不同细胞核糖体的组

17、成不同细胞核糖体的组成 核核蛋蛋白白体体的的组组成成 小亚基貌似一个动物胚胎，由头部、基部和平台组成，平小亚基貌似一个动物胚胎，由头部、基部和平台组成，平台与头部之间有一个裂隙；大亚基很像一个沙发，有一个柄、台与头部之间有一个裂隙；大亚基很像一个沙发，有一个柄、一个中央凸出部和一个脊；一个中央凸出部和一个脊； 二者组装成核糖体时，小亚基头部与大亚基凸出部之间形二者组装成核糖体时，小亚基头部与大亚基凸出部之间形成一个隧道，在蛋白质合成中成一个隧道，在蛋白质合成中mRNAmRNA很可能从这里通过。很可能从这里通过。大肠杆菌核糖体三维结构模型大肠杆菌核糖体三维结构模型 蛋白质的合成过程蛋白质的合成过

18、程 （大肠杆菌）（大肠杆菌）v 氨基酸的活化氨基酸的活化v 肽链合成的起始肽链合成的起始v 肽链的延伸肽链的延伸v 肽链合成的终止与释放肽链合成的终止与释放氨基酸的活化与转运氨基酸的活化与转运氨基酸的活化与转运氨基酸的活化与转运反应式：反应式：AA + tRNA + ATPAA + tRNA + ATP氨酰氨酰-tRNA-tRNA合成酶合成酶氨酰氨酰-tRNA-tRNA+AMP+PPi +AMP+PPi 对于对于E.coliE.coli而言，肽链合成时的第一个而言，肽链合成时的第一个氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（fMetfMet）。）。在核糖体上合成多肽（三阶段）在核糖体上合

19、成多肽（三阶段）在核糖体上合成多肽（三阶段）在核糖体上合成多肽（三阶段）1 1、起始阶段、起始阶段2 2、延伸阶段、延伸阶段3 3、终止阶段、终止阶段肽链合成的起始阶段肽链合成的起始阶段1.1.mRNAmRNA与小亚基结合：与小亚基结合：形成形成30S-mRNA-IF30S-mRNA-IF3 3复合物复合物2.2.AUGAUG与蛋氨酰与蛋氨酰- -tRNAtRNA结合：结合： 30S-mRNA-IF30S-mRNA-IF3 3 fMet-tRNA-IFfMet-tRNA-IF2 2-GTP-GTP fMet-tRNA fMet-tRNA正好位于正好位于mRNAmRNA的起始密码子上（的起始密码

20、子上（AUGAUG）。）。3.3.大小亚基结合大小亚基结合 IF130S30S起始复合物起始复合物AUG ACA5 53 3AUG ACA5 53 3UACUACAUG ACA5 53 3小亚基小亚基mRNA蛋氨酰蛋氨酰tRNA GTP大亚基大亚基GDP+Pi受位受位给位给位蛋蛋蛋蛋肽链合成的起始阶段肽链合成的起始阶段肽链合成的延伸阶段肽链合成的延伸阶段1.1.进位进位: :氨基酰氨基酰-tRNA-tRNA进入受位进入受位; ;2.2.转肽转肽: :形成肽键形成肽键, ,在转肽酶作用下在转肽酶作用下, ,给位与给位与 受位结合受位结合; ;3.3.移位移位: :核蛋白体向核蛋白体向3 3端移动

21、一个密码子的端移动一个密码子的 位置位置, ,空出受位空出受位, ,不断地进位、转肽、不断地进位、转肽、 移位移位, ,使肽链延长。使肽链延长。AUG ACA5 53 3UAC蛋蛋苏苏UGUAUG ACA5 5UAC蛋蛋苏苏UGUGUUAUG ACA5 5UAC蛋蛋苏苏UGUGUUAUG ACA5 5蛋蛋苏苏UGUGUU3 33 33 3GTP GDP+PiGDP+PiGTP起始复合体起始复合体进位进位转肽转肽移位移位Mg+K+肽链合成的终止阶段肽链合成的终止阶段1.1.出现终止密码并与终止因子结合出现终止密码并与终止因子结合; ;2.2.肽键水解肽键水解, ,多肽释放多肽释放; ;3.3.t

22、RNA,mRNAtRNA,mRNA, ,大小亚基解离大小亚基解离. . AUG UAA5 5UACAUG UAA5 5UAC3 33 3终终终终AUG UAA5 5UAC3 3终终5 53 3UAC终终肽链肽链二、酶生物合成的调节二、酶生物合成的调节二、酶生物合成的调节二、酶生物合成的调节定义：定义：通过调节酶合成的量来控制微生物通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制，是在基因转录水平上代谢速度的调节机制，是在基因转录水平上进行的。进行的。意义：意义：通过阻止酶的过量合成，节约生物通过阻止酶的过量合成，节约生物合成的原料和能量。合成的原料和能量。 操纵子操纵子基因表达的协同单位基因表

23、达的协同单位操纵子操纵子结构基因结构基因（编码蛋白质（编码蛋白质, , structural gene, S）控制部位控制部位操纵基因操纵基因（operator gene, O）启动子启动子（promotor gene, P）（一）基因调控理论（一）基因调控理论 Jacob and Monod的的操纵子学说操纵子学说（operon theoryoperon theory） 调节基因调节基因(regulator gene)： 可产生一种组成型可产生一种组成型调节蛋白调节蛋白(regulatory protein) ，通，通过与效应物过与效应物(effector) （包括诱导物或辅阻遏物）的（包括

24、诱导物或辅阻遏物）的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基因特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基因的结合力。的结合力。 调节基因常位于调控区的上游。调节基因常位于调控区的上游。基因操纵子调节系统示意图基因操纵子调节系统示意图 调节基因调节基因 启动基因启动基因 操纵基因操纵基因 结构基因结构基因 DNA 转录转录 （-） RNA聚合酶聚合酶 （+） 转录转录 翻译翻译 mRNA 翻译翻译 阻遏蛋白阻遏蛋白 蛋白质蛋白质 诱导剂诱导剂 控制区控制区 信息区信息区操纵子操纵子 cAMP-CRP复合物的作用示意图 启动基因启动基因（promotor gene）（）（启动子）：启动子）： 有

25、两个位点：有两个位点： （1 1）RNARNA聚合酶的结合位点聚合酶的结合位点（2 2）cAMP-CAPcAMP-CAP的结合位点。的结合位点。CAPCAP：分解代谢产物基因活化蛋白：分解代谢产物基因活化蛋白（catabolite gene activator protein），），又称环腺苷酸受体蛋白又称环腺苷酸受体蛋白(cAMP receptor protein，CRP）。）。 只有只有cAMP-CRPcAMP-CRP复合物结合到启动子的位点上，复合物结合到启动子的位点上，RNARNA聚合酶才能结合到其在启动子的位点上，酶的合成才聚合酶才能结合到其在启动子的位点上，酶的合成才能开始。能开始

26、。 操纵基因操纵基因（Operater gene）: : 位于启动基因和结构基因之间的一段碱位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。结构基因结构基因（Structural gene）: : 决定某一多肽的决定某一多肽的DNADNA模板，与酶有各自的模板，与酶有各自的对应关系，其中的遗传信息可转录为对应关系，其中的遗传信息可转录为mRNAmRNA，再翻译为蛋白质。再翻译为蛋白质。( (二二) ) 酶合成调节的类型酶合成调节的类型 1.1.诱导诱导 (induc

27、tion) 组成酶：细胞固有的酶类。组成酶：细胞固有的酶类。 诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似 物而临时合成的一类酶。物而临时合成的一类酶。 2.2.阻遏阻遏 (repression) 分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏(catabolite repression) 反馈阻遏反馈阻遏(feedback repression)（三）酶合成的调节机制（三）酶合成的调节机制（三）酶合成的调节机制（三）酶合成的调节机制 1. 1. 1. 1. 酶合成的诱导酶合成的诱导酶合成的诱导酶合成的诱导加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。加进某种物质，使酶生物合成开

28、始或加速进行。加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。 酶合成诱导的现象：酶合成诱导的现象： 已知分解利用乳糖的酶有：已知分解利用乳糖的酶有： - -半乳糖苷酶；半乳糖苷酶； 透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。实验：实验：（1 1）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成；上述三种酶合成；（2 2）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有上述三种）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成；酶合成； 表明菌体生物合成的经济原则：表明菌体生物合成的经济原则：需要时

29、才合成需要时才合成。调节调节基因基因操纵操纵基因基因乳糖结构基因乳糖结构基因PLacZLacYLacamRNA 阻遏蛋白阻遏蛋白（有活性）（有活性）基基 因因 关关 闭闭启启动动子子ORPLacZLacYLaca调节调节基因基因操纵操纵基因基因乳糖结构基因乳糖结构基因启启动动子子ORmRNAZmRNAYmRNAa 阻遏蛋白阻遏蛋白（无活性）（无活性） 基基 因因 表表达达mRNAA、乳糖操纵子的结构、乳糖操纵子的结构B、乳糖酶的诱导、乳糖酶的诱导 乳糖乳糖 阻遏蛋白阻遏蛋白（有活性）（有活性） 2. 2.末端产物阻遏末端产物阻遏 由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏由某代谢途径末端产物的过

30、量累积引起的阻遏。 酶合成阻遏的现象：酶合成阻遏的现象： 实验：实验： （1 1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时， 检测检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在；到细胞内有色氨酸合成酶的存在； （2 2）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。合成酶的活性降低，直至消失。 表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌体生长的经济原则体生长的经济原则: :不需要就不合成不需要就不合成。 色氨酸操纵子色氨酸操纵子酶的

31、阻遏酶的阻遏调节基因调节基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因mRNAmRNA酶蛋白酶蛋白阻遏蛋白不能与操纵基因结合，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，结构基因表达结构基因表达调节基因调节基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因辅阻遏物辅阻遏物代谢产物与阻遏蛋白结代谢产物与阻遏蛋白结合，使之构象发生变化合，使之构象发生变化与操纵基因结合，结构基与操纵基因结合，结构基因不能表达因不能表达酶酶的的诱诱导导和和阻阻遏遏操操纵纵子子模模型型B.有活性阻遏蛋白加诱导剂有活性阻遏蛋白加诱导剂A.有活性阻遏蛋白有活性阻遏蛋白C.无活性阻遏蛋白无活性阻遏蛋白D.无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂操纵基因操纵

32、基因启动基因启动基因调节基因调节基因结构基因结构基因 阻遏蛋白阻遏蛋白(有活性有活性)阻遏蛋白阻挡操纵基因阻遏蛋白阻挡操纵基因结构基因不表达结构基因不表达诱导物诱导物诱导物与阻遏蛋白结合诱导物与阻遏蛋白结合,使阻遏蛋白不能起使阻遏蛋白不能起到阻挡操纵基因的作用到阻挡操纵基因的作用,结构基因可以表达结构基因可以表达酶蛋白酶蛋白mRNA阻遏蛋白不能跟操纵基因结合阻遏蛋白不能跟操纵基因结合, 结构基因可以表达结构基因可以表达阻遏蛋白阻遏蛋白(无活性无活性)酶蛋白酶蛋白mRNA代谢产物与阻遏蛋白结合代谢产物与阻遏蛋白结合,从而使阻遏蛋从而使阻遏蛋白能够阻挡操纵基因白能够阻挡操纵基因,结构基因不表达结构

33、基因不表达代谢产物代谢产物调控方式调控方式 阻遏蛋白阻遏蛋白 添加物添加物 与操纵基与操纵基因结合因结合阻遏效应阻遏效应举例举例酶的诱导酶的诱导有活性有活性不转录，不转录，继而不翻译继而不翻译诱导物诱导物转录，转录，继而翻译继而翻译乳糖操乳糖操纵子纵子酶的阻遏酶的阻遏无活性无活性阻遏物阻遏物不转录，不转录，继而不翻译继而不翻译色氨酸色氨酸操纵子操纵子酶合成的诱导与阻遏操纵子模型调控作用对比酶合成的诱导与阻遏操纵子模型调控作用对比3.3.分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏n指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻源）存在时，利用快的那

34、种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。n分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。分解代谢物阻遏现象：分解代谢物阻遏现象： 实验：实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利

35、用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象二次生长现象”(diauxie(diauxie或或biphasic growthbiphasic growth）。）。 这一现象又称葡萄糖效应，产这一现象又称葡萄糖效应，产生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。了分解乳糖酶系的合成。此调节基此调节基因的产物是环腺苷酸受体蛋白因的产物是环腺苷酸受体蛋白（CRPCRP）, ,亦称亦称降解物基因活化蛋白降解物基因活化蛋白（CAPCAP）。）。分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏RLacZLacYLacamRNAmRNAZmR

36、NAYmRNAa基基 因因 表表达达CAP基因基因结构基因结构基因TCAPOCAP结结合部位合部位 RNA聚合酶聚合酶TcAMP -CAPP葡萄糖葡萄糖分解代分解代谢产物谢产物腺苷酸腺苷酸环化酶环化酶磷酸二酯磷酸二酯酶酶ATPcAMP5-AMP抑制抑制激活激活葡萄糖降解物与葡萄糖降解物与cAMP的关系的关系cAMPCAP：降解物基因活化蛋白（：降解物基因活化蛋白（catabolic gene activation protein）降低降低cAMP浓度浓度使使CAP呈失活状态呈失活状态真真核核生生物物酶酶生生物物合合成成的的调调节节细胞分化改变酶的生物合成细胞分化改变酶的生物合成基因扩增加速酶的

37、生物合成基因扩增加速酶的生物合成增强子促进酶的生物合成增强子促进酶的生物合成抗原诱导抗体酶的生物合成抗原诱导抗体酶的生物合成 1010月月4 4日，在瑞典首都斯德哥尔摩的卡罗林斯卡医学院，诺贝尔奖评审日，在瑞典首都斯德哥尔摩的卡罗林斯卡医学院，诺贝尔奖评审委员会宣布，委员会宣布，英国生理学家罗伯特英国生理学家罗伯特爱德华兹获得爱德华兹获得20102010年诺贝尔生理学或年诺贝尔生理学或医学奖。医学奖。 今年岁的爱德华兹因创立今年岁的爱德华兹因创立体外受精技术体外受精技术而获得这一奖项。爱德华兹现在是而获得这一奖项。爱德华兹现在是英国剑桥大学的名誉教授。英国剑桥大学的名誉教授。体外受精技术俗称体

38、外受精技术俗称试管婴儿技术试管婴儿技术。医学统计显示，世界上每十对夫妇中就有一。医学统计显示，世界上每十对夫妇中就有一对有生育问题，而试管婴儿技术可以帮助其中绝大多数夫妇实现有自己后代的对有生育问题，而试管婴儿技术可以帮助其中绝大多数夫妇实现有自己后代的梦想。自年第一个试管婴儿路易丝梦想。自年第一个试管婴儿路易丝布朗呱呱坠地，全球已有万布朗呱呱坠地，全球已有万人通过试管婴儿技术出生，其中许多人通过自然受精方式生育了下一代。人通过试管婴儿技术出生，其中许多人通过自然受精方式生育了下一代。试管婴儿之父试管婴儿之父爱德华兹爱德华兹 北京时间北京时间1010月月5 5日下午日下午1717时时3030分

39、，分，20092009年度诺贝尔生理学或医学年度诺贝尔生理学或医学奖在瑞典卡罗林斯卡医学院揭晓，三位美国科学家共同获得该奖在瑞典卡罗林斯卡医学院揭晓，三位美国科学家共同获得该奖项。发现了奖项。发现了端粒和端粒酶端粒和端粒酶保护染色体的机理保护染色体的机理 杰克绍斯塔克杰克绍斯塔克 （Jack W.Szostak） 卡罗尔格雷德卡罗尔格雷德 （Carol W.Greider） 伊丽莎白布赖克本伊丽莎白布赖克本 （Elizabeth H.Blackburn） 08/10/608/10/6，瑞典，瑞典， “诺贝尔路号诺贝尔路号”的卡罗林斯卡医学的卡罗林斯卡医学院院“诺贝尔论坛楼诺贝尔论坛楼”内举行，

40、诺贝尔奖评审委员会成员内举行，诺贝尔奖评审委员会成员走上讲台，宣布了走上讲台，宣布了0808年诺贝尔生理学或医学奖得主。年诺贝尔生理学或医学奖得主。 德国德国哈拉尔德哈拉尔德楚尔楚尔豪森豪森Harald zur Hausen法国法国巴尔巴尔- -西诺西西诺西Franoise Barr-Sinoussi法国法国吕克吕克- -蒙塔尼蒙塔尼Luc Montagnier他们分别在他们分别在宫颈癌致病因子和艾滋病病毒宫颈癌致病因子和艾滋病病毒研究上有突出成就研究上有突出成就（德国科学家因发现人乳突淋瘤病毒引发子宫颈癌获此殊荣，（德国科学家因发现人乳突淋瘤病毒引发子宫颈癌获此殊荣，两名法国科学家因发现人类

41、免疫缺陷病毒获此殊荣。）两名法国科学家因发现人类免疫缺陷病毒获此殊荣。） 诺贝尔奖正式颁奖典礼每年诺贝尔奖正式颁奖典礼每年1212月月1010日在诺贝尔逝世纪念日这一日在诺贝尔逝世纪念日这一天分别在瑞典首都斯德哥尔摩和挪威首都奥斯陆举行。天分别在瑞典首都斯德哥尔摩和挪威首都奥斯陆举行。本年度诺贝尔奖各奖项得主将独享或分享总额为万瑞本年度诺贝尔奖各奖项得主将独享或分享总额为万瑞典克朗（约合万美元）的奖金。典克朗（约合万美元）的奖金。 07/10/807/10/8，瑞典，诺贝尔生理学和医学组委会及评审委，瑞典，诺贝尔生理学和医学组委会及评审委员会秘书汉斯员会秘书汉斯约纳沃博士宣布约纳沃博士宣布20

42、072007年诺奖医学奖得主年诺奖医学奖得主 马里奥马里奥卡佩卡佩奇奇（美国）（美国）马丁马丁埃文埃文斯斯（英国）（英国）奥利弗奥利弗史密史密斯（美国）斯（美国） 他们在改造活体内特定基因的他们在改造活体内特定基因的“基因靶向基因靶向” 技术技术等方面做出了奠基性贡献。等方面做出了奠基性贡献。基因靶向技术是指利用细胞脱氧核糖核酸基因靶向技术是指利用细胞脱氧核糖核酸(DNA)(DNA)可与可与外源外源DNADNA同源序列发生同源重组的性质，定向改造生同源序列发生同源重组的性质，定向改造生物某一基因的技术。物某一基因的技术。它可用于有针对性地寻找某些遗传性疾病的疗法。它可用于有针对性地寻找某些遗传

43、性疾病的疗法。第二节第二节 常用的产酶微生物常用的产酶微生物一、一、 用于酶的生产的细胞必须具备以下几个条件：用于酶的生产的细胞必须具备以下几个条件： a a 产酶量高产酶量高 b b 容易培养和管理容易培养和管理 c c 产酶稳定性好产酶稳定性好 d d 利于酶的分离纯化利于酶的分离纯化 e e 安全可靠、无毒性安全可靠、无毒性二、常用的微生物二、常用的微生物细菌细菌放线菌放线菌酵母菌酵母菌霉菌霉菌农田上层农田上层农田上层农田上层15cm15cm15cm15cm处微生物的数量处微生物的数量处微生物的数量处微生物的数量微生物微生物 每克土壤中的数量每克土壤中的数量细菌细菌 9.89.81010

44、7 7放线菌放线菌 2.02.010106 6真菌真菌 1.21.210105 5藻菌藻菌 2.52.510104 4原生动物原生动物 3.03.010104 4菌落数与空气清洁度的关系菌落数与空气清洁度的关系菌落数与空气清洁度的关系菌落数与空气清洁度的关系空气清洁度空气清洁度 菌落数菌落数最清洁的空气最清洁的空气 1-21-2洁净空气洁净空气 3030个以下个以下普通空气普通空气 30-15030-150轻度污染空气轻度污染空气 300300以下以下严重污染空气严重污染空气 301301以上以上人体微生态中微生物的含量人体微生态中微生物的含量人体微生态中微生物的含量人体微生态中微生物的含量部

45、位部位 含量含量部位部位 含量含量眼睛眼睛 1g1g 肺肺 20g20g鼻腔鼻腔 10g10g肠道肠道 1000g1000g口腔口腔 20g20g生殖道生殖道20 g20 g皮肤皮肤 200g200g总量总量 1271g1271g人体消化系统中微生物群体人体消化系统中微生物群体人体消化系统中微生物群体人体消化系统中微生物群体 ( ( ( (个个个个/g)/g)/g)/g) 回肠回肠 结肠结肠 直肠或粪便直肠或粪便双歧杆菌双歧杆菌10104 4 10 107 7 10 101010拟杆菌拟杆菌10103 3 10 108 8 10 101010肠杆菌肠杆菌10103 3 10 106 6 10

46、106 6肠球菌肠球菌 10107 7 乳杆菌乳杆菌 10104 4细菌的结构细菌的结构细菌的繁殖：细菌的繁殖：细菌主要是以二分裂的方式进行繁殖细菌主要是以二分裂的方式进行繁殖细菌主要是以二分裂的方式进行繁殖细菌主要是以二分裂的方式进行繁殖细菌的菌落细菌的菌落 定义：单个或者少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，定义：单个或者少数细菌在固体培养基上大量繁殖时， 会形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子会形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子 细胞群体。细胞群体。特征：大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等。特征：大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等。功能：每种细菌在一定条件下所形成的菌落

47、可以作为菌功能：每种细菌在一定条件下所形成的菌落可以作为菌 种鉴定的重要依据。种鉴定的重要依据。大肠杆菌大肠杆菌枯草杆菌枯草杆菌放线菌菌落及形态放线菌菌落及形态气气生生菌菌丝丝孢孢子子丝丝孢子孢子基内菌丝基内菌丝培养基培养基放线菌的结构放线菌的结构放线菌的分布放线菌的分布放线菌在自然界分布很广，在土壤、堆肥和湖底、河底放线菌在自然界分布很广，在土壤、堆肥和湖底、河底的淤泥等处，尤其在土壤中种类和数量很多。的淤泥等处，尤其在土壤中种类和数量很多。放线菌的繁殖放线菌的繁殖主要通过形成无性抱子形式进行无性繁殖，成熟的生孢主要通过形成无性抱子形式进行无性繁殖，成熟的生孢子或孢囊孢子在适宜环境里发芽形成

48、新的菌丝体。子或孢囊孢子在适宜环境里发芽形成新的菌丝体。链霉菌链霉菌酵母菌酵母菌主要分布于含糖质较多偏酸性环境中，如水果、蔬菜、花蜜主要分布于含糖质较多偏酸性环境中，如水果、蔬菜、花蜜和植物叶片上，果园土壤中，石油酵母多分布在油田周围的和植物叶片上，果园土壤中，石油酵母多分布在油田周围的土壤中。土壤中。多数为腐生，常以单个细胞存在，以发芽形式进行繁殖。多数为腐生，常以单个细胞存在，以发芽形式进行繁殖。啤酒酵母菌啤酒酵母菌霉菌霉菌分布很广分布很广 土壤、空气、水和生物体内大量存在土壤、空气、水和生物体内大量存在偏酸性环境中多数以无性孢子繁殖为主。偏酸性环境中多数以无性孢子繁殖为主。米曲霉米曲霉木

49、霉木霉青霉青霉红曲霉红曲霉毛霉毛霉根霉根霉担子菌及藻类担子菌及藻类菌种的来源菌种的来源根据需要直接从有关科研单位、高等院校、根据需要直接从有关科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门购买；工厂或菌种保藏部门购买；从大自然中分离筛选新的微生物菌种。从大自然中分离筛选新的微生物菌种。 新菌种分离与筛选的步骤新菌种分离与筛选的步骤定方案：先要查阅资料了解所需菌种的生长培养特性定方案：先要查阅资料了解所需菌种的生长培养特性采样：有针对性地采集样品采样：有针对性地采集样品增殖：通过控制养分或培养条件，使所需菌种增殖培养增殖：通过控制养分或培养条件，使所需菌种增殖培养分离：利用分离技术得到纯种分离：利用分离

50、技术得到纯种发酵性能测定：进行生产性能测定发酵性能测定：进行生产性能测定采样对象采样对象一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。从自然界筛选从自然界筛选采样季节：以温度适中，雨量不多的采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初秋初为好。为好。采土方式：在选好适当地点后，取离地面采土方式：在选好适当地点后，取离地面5-15cm5-15cm处处的土约的土约10

51、g10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记。好，标记。记录记录采样时间、地点、环境条件等。采样时间、地点、环境条件等。增殖培养增殖培养为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物至少是在数量上不要增加，可以通过配制至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择选择性培养基性培养基，选择一定的培养条件来控制。，选择一定的培养条件来控制。培养分离培养分离尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。纯种分离的方法有

52、划线分离法、稀释分离法。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。 筛选筛选 采用与生产相近的培养基和培养条件，通采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。适合于工业生产用菌种。毒性试验毒性试验据据国国家家规规定定，微微生生物物中中除除啤啤酒酒酵酵母母、脆脆壁壁酵酵母母、黑黑曲曲霉霉、米米曲曲霉霉和和枯枯草草杆杆菌菌无无须须做做毒毒性性试试验验外外，其他微生物均需通过两年以上的毒性试验。其他微生物均需通过两年以上的毒性试验。从自然界分离的菌种从自然界分离的菌种从自然界分离的菌种从自然界分离的菌种产 品基因

53、工程基因工程基因工程基因工程诱变育种诱变育种诱变育种诱变育种诱变育种诱变育种诱变育种诱变育种生产用菌种生产用菌种生产用菌种生产用菌种扩大培养扩大培养扩大培养扩大培养原原原原 料料料料微生物菌体微生物菌体微生物菌体微生物菌体代谢产物代谢产物代谢产物代谢产物分离提纯分离提纯分离提纯分离提纯接种接种接种接种培养基配置培养基配置培养基配置培养基配置灭菌灭菌灭菌灭菌工业发酵的目的工业发酵的目的大量地积累人们所需要的微生物代谢产物。大量地积累人们所需要的微生物代谢产物。 在正常生理条件下在正常生理条件下 微生物通过其代谢调节系统吸收利用营养物质用于合微生物通过其代谢调节系统吸收利用营养物质用于合成细胞结构

54、，进行生长和繁殖，它们通常不浪费原料和成细胞结构，进行生长和繁殖，它们通常不浪费原料和能量，也不积累中间代谢产物能量，也不积累中间代谢产物 代谢的人工控制代谢的人工控制 人为地打破微生物的代谢控制体系，就有可能使代谢朝人为地打破微生物的代谢控制体系，就有可能使代谢朝着人们希望的方向进行着人们希望的方向进行 人工控制代谢的手段：人工控制代谢的手段： 改变微生物遗传特性改变微生物遗传特性( (遗传学方法）；遗传学方法）； 控制发酵条件（生物化学方法）；控制发酵条件（生物化学方法）； 改变细胞膜透性；改变细胞膜透性；诱变育种诱变育种 (1) (1) 使诱导型变为组成型使诱导型变为组成型选育组成型突变

55、株选育组成型突变株如果调节基因发生突变，以至产生无效的阻遏物而不能和操如果调节基因发生突变，以至产生无效的阻遏物而不能和操纵基因结合，或操纵基因突变，从而造成结构基因不受控制纵基因结合，或操纵基因突变，从而造成结构基因不受控制的转录，酶的转录，酶 的生成将不再需要诱导剂或不再被末端产物或的生成将不再需要诱导剂或不再被末端产物或分解代谢物阻遏，这样的突变株称为分解代谢物阻遏，这样的突变株称为 组成型突变株。少数组成型突变株。少数情况下，组成型突变株可产生大量的、比亲本高的多的酶，情况下，组成型突变株可产生大量的、比亲本高的多的酶，这种突变株称为超产突变株。这种突变株称为超产突变株。组成型突变株组

56、成型突变株 结构基因不受控制地转录，酶的结构基因不受控制地转录，酶的生成将不再需要诱导剂或不再被生成将不再需要诱导剂或不再被末端产物或分解代谢物阻遏。末端产物或分解代谢物阻遏。 调节基因发生突变调节基因发生突变产生无效的阻遏物而不产生无效的阻遏物而不能与操纵基因结合能与操纵基因结合操纵基因突变操纵基因突变突变操纵基因不突变操纵基因不能与阻遏物结合能与阻遏物结合组成型突变组成型突变(2)(2)使阻遏型变为去阻遏型使阻遏型变为去阻遏型 选育营养缺陷型突变株选育营养缺陷型突变株解除反馈阻遏解除反馈阻遏 选育结构类似物抗性突变株选育结构类似物抗性突变株解除分解代谢物阻遏解除分解代谢物阻遏选育抗分解代谢

57、阻遏突变株选育抗分解代谢阻遏突变株第三节第三节 发酵工艺条件及其控制发酵工艺条件及其控制 在酶的发酵生产中，除了选择性能优良的产酶在酶的发酵生产中，除了选择性能优良的产酶细胞外，还必须控制好各种工艺条件，并且在细胞外，还必须控制好各种工艺条件，并且在发酵过程中根据情况变化进行调节，以满足细发酵过程中根据情况变化进行调节，以满足细胞生长、繁殖和产酶的需要。胞生长、繁殖和产酶的需要。微生物发酵的一般工艺流程微生物发酵的一般工艺流程一、细菌活化与扩增培养一、细菌活化与扩增培养一、细菌活化与扩增培养一、细菌活化与扩增培养活化活化活化活化 一般保存于冷冻管及砂土管或冰箱中的优良一般保存于冷冻管及砂土管或

58、冰箱中的优良生产菌种和选育的新菌种，在正式使用前要先生产菌种和选育的新菌种，在正式使用前要先接种到新鲜斜面培养基上，在一定的条件下进接种到新鲜斜面培养基上，在一定的条件下进行培养，使细胞的生命活性得以恢复。行培养，使细胞的生命活性得以恢复。扩大培养扩大培养扩大培养扩大培养 是指菌种活化后经过摇瓶或种子罐逐步扩大培是指菌种活化后经过摇瓶或种子罐逐步扩大培是指菌种活化后经过摇瓶或种子罐逐步扩大培是指菌种活化后经过摇瓶或种子罐逐步扩大培养，获得一定数量和质量的纯种的全过程。养，获得一定数量和质量的纯种的全过程。养，获得一定数量和质量的纯种的全过程。养，获得一定数量和质量的纯种的全过程。二、培养基二、

59、培养基孢子培养基孢子培养基种子培养基种子培养基发酵培养基发酵培养基种类种类组成组成碳源和氮源碳源和氮源无机盐和微量元素无机盐和微量元素生长因子生长因子水水产物形成的诱导物、前体和促进剂产物形成的诱导物、前体和促进剂(1)(1)用作培养菌种及扩大生产的发酵罐的培养基的配制用作培养菌种及扩大生产的发酵罐的培养基的配制(2)(2)培养基、发酵罐以及辅助设备的消毒灭菌培养基、发酵罐以及辅助设备的消毒灭菌(3)(3)将已培养好的有活性的纯菌株以一定量转接到发酵罐中将已培养好的有活性的纯菌株以一定量转接到发酵罐中(4)(4)接种到发酵罐中的菌株控制在最适条件下生长并形成代谢产物接种到发酵罐中的菌株控制在最

60、适条件下生长并形成代谢产物(5)(5)将产物抽提并进行精制将产物抽提并进行精制 (6)(6)回收或处理发酵过程中产生的废物和废水回收或处理发酵过程中产生的废物和废水工业发酵步骤和工艺流程工业发酵步骤和工艺流程工业发酵步骤和工艺流程工业发酵步骤和工艺流程发酵的流程发酵的流程空气空气空气净化处理空气净化处理保藏菌种保藏菌种斜面活化斜面活化扩大培养扩大培养种子罐种子罐主发酵主发酵碳源、氮源、碳源、氮源、无机盐等营养无机盐等营养物质物质灭菌灭菌产物分离纯化产物分离纯化成品成品菌种筛选菌种筛选摇瓶试验摇瓶试验发酵罐试验发酵罐试验三、发酵工艺控制三、发酵工艺控制 发酵过程中，为了能对生产过程进行必要的控发

61、酵过程中，为了能对生产过程进行必要的控制，需要对有关工艺参数进行定期取样测定或进制，需要对有关工艺参数进行定期取样测定或进行连续测量。行连续测量。参数中，对发酵过程影响较大的有参数中，对发酵过程影响较大的有温度、温度、溶解氧浓度溶解氧浓度等。等。 1.1.温度温度 温度对发酵的影响是多方面的，主要表现在对细温度对发酵的影响是多方面的，主要表现在对细胞生长、产物形成、发酵液的物理性质和生物合成胞生长、产物形成、发酵液的物理性质和生物合成方面。方面。 最适发酵温度是适合菌体生长、又适合代谢产物最适发酵温度是适合菌体生长、又适合代谢产物合成的温度，它随菌种、培养基成分、培养条件和合成的温度，它随菌种

62、、培养基成分、培养条件和菌体生长阶段不同而改变。菌体生长阶段不同而改变。2.pH2.pH发酵过程中发酵过程中pHpH的变化取决于所用的菌种、培养基的的变化取决于所用的菌种、培养基的成分和培养条件。成分和培养条件。微生物生长和生物合成都有其最适和能够耐受的微生物生长和生物合成都有其最适和能够耐受的pHpH范围，大多数微生物生长的最适范围，大多数微生物生长的最适pH6.3-7.5pH6.3-7.5，霉菌和，霉菌和酵母生长的最适酵母生长的最适pH4-6pH4-6，放线菌生长的最适，放线菌生长的最适pH7-8pH7-8。几种抗生素发酵的最适几种抗生素发酵的最适pHpH范围范围3.3.溶解氧浓度溶解氧浓

63、度 对于好氧发酵，溶解氧浓度是最重要的参数之一。对于好氧发酵，溶解氧浓度是最重要的参数之一。好氧性微生物深层培养时，需要适量的溶解氧以维持好氧性微生物深层培养时，需要适量的溶解氧以维持其呼吸代谢和某些产物的合成，氧的不足会造成代谢其呼吸代谢和某些产物的合成，氧的不足会造成代谢异常，产量降低。异常，产量降低。四、提高酶产量的措施四、提高酶产量的措施 在酶的发酵生产过程中，为了提高酶的产量，在酶的发酵生产过程中，为了提高酶的产量，除了选育优良的产酶细胞外，还可以采取一些除了选育优良的产酶细胞外，还可以采取一些与酶发酵工艺有关的措施，例如添加诱导物、与酶发酵工艺有关的措施，例如添加诱导物、控制阻遏物

64、浓度、添加表面活性剂等。控制阻遏物浓度、添加表面活性剂等。1.1.添加诱导物添加诱导物酶的作用底物：如青霉素是青霉素酰化酶的诱导物。酶的作用底物：如青霉素是青霉素酰化酶的诱导物。酶的反应产物：如纤维素二糖可诱导纤维素酶的产生。酶的反应产物：如纤维素二糖可诱导纤维素酶的产生。酶的底物类似物：如异丙基酶的底物类似物：如异丙基- - -硫代半乳糖苷（硫代半乳糖苷（IPTGIPTG）对对- -半乳糖苷酶的诱导效果比乳糖高几百倍。半乳糖苷酶的诱导效果比乳糖高几百倍。 2. 2.控制阻遏物浓度控制阻遏物浓度 微生物酶的生产受到代谢末端产物的阻遏和分解微生物酶的生产受到代谢末端产物的阻遏和分解代谢物阻遏的调

65、节。为避免分解代谢物的阻遏作代谢物阻遏的调节。为避免分解代谢物的阻遏作用，可采用难于利用的碳源，如在用，可采用难于利用的碳源，如在- -半乳糖苷酶半乳糖苷酶的生产中，只有在培养基中不含葡萄糖时，才能的生产中，只有在培养基中不含葡萄糖时，才能大量诱导产酶。大量诱导产酶。 3. 3.添加表面活性剂添加表面活性剂/(/(产酶促进剂）产酶促进剂） 改变细胞的通透性或对酶分子有一定的稳定作用改变细胞的通透性或对酶分子有一定的稳定作用如在霉菌的发酵生产中添加如在霉菌的发酵生产中添加 1%1%的吐温可使纤维素的吐温可使纤维素酶的产量提高几倍到几十倍。酶的产量提高几倍到几十倍。第四节第四节 酶发酵动力学酶发酵

66、动力学 主要研究发酵过程中细胞生长速度，产物主要研究发酵过程中细胞生长速度，产物生成速度，基质消耗速度以及环境因素对这生成速度，基质消耗速度以及环境因素对这些速度的影响等。些速度的影响等。 一、细胞生长动力学一、细胞生长动力学 研究细胞生长速率以及外界环境因素对研究细胞生长速率以及外界环境因素对细胞生长速率影响的规律。细胞生长速率影响的规律。在培养成分一定时，微生物的生长一般分五个阶段在培养成分一定时，微生物的生长一般分五个阶段在培养成分一定时，微生物的生长一般分五个阶段在培养成分一定时，微生物的生长一般分五个阶段延缓期（适应期）延缓期（适应期）对数生长期对数生长期减速期减速期静止期（平衡期）

67、静止期（平衡期）衰退期（死亡期）衰退期（死亡期） 营养物浓度（生长限制基质浓度）和生长速率之间的营养物浓度（生长限制基质浓度）和生长速率之间的动力学关系：动力学关系：MonodMonod模型模型n: :比生长速率（比生长速率（1/1/h h） （specific growth ratespecific growth rate）nm m：最大比生长速率（最大比生长速率（1/1/h h）nS S：营养物浓度（营养物浓度（生长限制基质浓度生长限制基质浓度） 克克/ /L LnKsKs：莫诺德常数或莫诺德常数或饱和常数或营养物利用常数克饱和常数或营养物利用常数克/L/L，或，或 mol/Lmol/L

68、二、二、 酶生物合成的模式酶生物合成的模式 根据酶的合成与细胞生长之间的关系，可将酶根据酶的合成与细胞生长之间的关系，可将酶的生物合成分为的生物合成分为3 3种模式，即：种模式，即： 同步合成型同步合成型 生长偶联型生长偶联型 中期合成型中期合成型 部分生长偶联型部分生长偶联型延续合成型延续合成型 非生长偶联型非生长偶联型 滞后合成型滞后合成型1. 1. 生长偶联型（又称同步合成型）生长偶联型（又称同步合成型） 酶的生物合成与细胞生长同步。酶的生物合成与细胞生长同步。特点：特点：酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和产物的酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和产物的反馈阻遏。反馈阻遏。 当

69、去除诱导物、细胞进入平衡期后，酶的合成立即停止。当去除诱导物、细胞进入平衡期后，酶的合成立即停止。生长偶联型中的特殊形式生长偶联型中的特殊形式中期合成型中期合成型 酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止入平衡期以后，酶的合成也随着停止。特点：特点：酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。 枯草杆菌碱性磷酸酶合成曲线枯草杆菌碱性磷酸酶合成曲线 2.2.部分生长偶联型（又称延续合成型）部分生长偶联型（又称延续合成型） 酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入

70、平衡期酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。后，酶还可以延续合成较长一段时间。特点：特点：可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。 黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲线黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲线3. 3. 非生长偶联型（又称滞后合成型）非生长偶联型（又称滞后合成型） 只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并大量积累。只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型许多水解酶的生物合成都属于这一类型。特点特点：受分解代谢物的阻遏作用。：受分解代谢物的阻遏作用。 黑曲霉酸性蛋

71、白酶合成曲线黑曲霉酸性蛋白酶合成曲线 酶生产中最理想的合成模式：酶生产中最理想的合成模式：延续合成型：延续合成型：发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞开始生长就有酶的产生，直至细胞生长进入平衡期后，细胞开始生长就有酶的产生，直至细胞生长进入平衡期后，酶还可以继续生成一段时间。酶还可以继续生成一段时间。 对于：对于：同步合成型：同步合成型：提高对应的提高对应的mRNAmRNA的稳定性，如降低发酵温度的稳定性，如降低发酵温度 。滞后合成型：滞后合成型：尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使 酶的合成提早开始。酶的合成提早

72、开始。中期合成型：中期合成型：要在提高要在提高mRNAmRNA稳定性以及解除阻遏两方稳定性以及解除阻遏两方 面努力面努力。三、三、 产酶动力学产酶动力学 主要研究在发酵过程中细胞产酶速度以及各种主要研究在发酵过程中细胞产酶速度以及各种环境因素对产酶速度的影响规律。环境因素对产酶速度的影响规律。 产酶动力学根据研究的着眼点不同，可分为：产酶动力学根据研究的着眼点不同，可分为： 宏观产酶动力学（非结构动力学）宏观产酶动力学（非结构动力学）: :研究群体细胞的产研究群体细胞的产酶速度及其影响因素（酶速度及其影响因素（整个发酵系统的角度整个发酵系统的角度）。）。 微观产酶动力学（结构动力学）微观产酶动

73、力学（结构动力学）: :研究细胞中酶合成速研究细胞中酶合成速率及其影响因素（率及其影响因素（细胞内部的角度细胞内部的角度）。）。 一般产酶动力学方程可表达为：一般产酶动力学方程可表达为：式中式中 X X细胞浓度细胞浓度(g /L)(g /L) 细胞比生长速率细胞比生长速率(h(h-1-1) ) 生长偶联的比产酶系数生长偶联的比产酶系数(IU/g)(IU/g) 非生长偶联的比产酶速率非生长偶联的比产酶速率(IU/(g(IU/(g h)h) E E酶浓度酶浓度(IU/L)(IU/L) t t时间时间(h)(h)生长偶联型生长偶联型部分生长偶联型部分生长偶联型 非生长偶联型非生长偶联型 第五节第五节

74、 固定化微生物细胞发酵产酶固定化微生物细胞发酵产酶 又称固定化活细胞或固定化增殖细胞，用各种又称固定化活细胞或固定化增殖细胞，用各种方法固定在载体上，在一定的空间范围内生长、方法固定在载体上，在一定的空间范围内生长、繁殖和新陈代谢的细胞繁殖和新陈代谢的细胞. . 在发酵生产淀粉酶在发酵生产淀粉酶, ,蛋白酶蛋白酶, ,纤维素酶等胞外酶方纤维素酶等胞外酶方面取得了成功面取得了成功. . 一、固定化细胞发酵产酶的特点一、固定化细胞发酵产酶的特点1.1.提高产酶率提高产酶率2.2.可在高稀释度下连续发酵可在高稀释度下连续发酵3.3.基因工程菌的质粒稳定基因工程菌的质粒稳定, ,不易丢失不易丢失; ;

75、4.4.发酵稳定性好发酵稳定性好5.5.缩短发酵周期缩短发酵周期, ,提高设备利用率提高设备利用率; ;6.6.产品容易分离纯化产品容易分离纯化; ;7.7.适于胞外酶等胞外产物的生产适于胞外酶等胞外产物的生产. . 二、固定化细胞发酵产酶的工艺条件控制二、固定化细胞发酵产酶的工艺条件控制与游离细胞发酵大同小异与游离细胞发酵大同小异, ,需特别注意的几个问题需特别注意的几个问题: :1.1.固定化细胞的预培养固定化细胞的预培养先预培养先预培养, ,使固定在载体上的细胞生长繁殖使固定在载体上的细胞生长繁殖, ,长好后长好后, ,再用于发酵产酶再用于发酵产酶. .2.2.溶解氧的供给溶解氧的供给由

76、于受到载体的影响由于受到载体的影响, ,使氧的供给成为主要的限制性因素使氧的供给成为主要的限制性因素. .解决办法解决办法: :(1)(1)加大通气量加大通气量( (强烈搅拌会破坏固定化细胞强烈搅拌会破坏固定化细胞););(2)(2)改变固定化载体改变固定化载体, ,如少用琼脂等对氧扩散不利的载体如少用琼脂等对氧扩散不利的载体; ;(3)(3)过氧化氢酶与细胞共固定化过氧化氢酶与细胞共固定化, ,培养基加入适量的培养基加入适量的H H2 2O O2 2; ;(4)(4)降低培养基的浓度降低培养基的浓度, ,以降低培养基的粘度以降低培养基的粘度. . 3.3.温度的控制温度的控制连续发酵时连续发

77、酵时, ,由于稀释率较高由于稀释率较高, ,反应器内温度变化较大反应器内温度变化较大, ,先预先预调加液温度调加液温度. .4.4.培养基成份的控制培养基成份的控制某些固定化载体的结构会受到某些成份的影响某些固定化载体的结构会受到某些成份的影响, ,如过量的磷如过量的磷酸盐会破坏海澡酸钙凝胶制备的固定化细胞酸盐会破坏海澡酸钙凝胶制备的固定化细胞. .三、固定化细胞生长和产酶动力学三、固定化细胞生长和产酶动力学固定化细胞体系中细胞生长和产酶的动力学描述基固定化细胞体系中细胞生长和产酶的动力学描述基本与游离细胞体系相同。本与游离细胞体系相同。 在固定化细胞体系中细胞分两部分在固定化细胞体系中细胞分

78、两部分, ,一部分是固一部分是固定在载体上的细胞定在载体上的细胞, ,浓度基本稳定，另一部分是泄浓度基本稳定，另一部分是泄漏到培养液中的细胞。漏到培养液中的细胞。 1. 1.固定化细胞生长动力学固定化细胞生长动力学 固定在凝胶中的细胞的产酶模式为非生固定在凝胶中的细胞的产酶模式为非生长偶联型长偶联型; ;游离细胞的产酶速率依细胞产游离细胞的产酶速率依细胞产酶模式不同而不同。酶模式不同而不同。2.2.固定化细胞产酶动力学固定化细胞产酶动力学在固定化细胞发酵过程中，固定在载体上的细胞和培养液在固定化细胞发酵过程中，固定在载体上的细胞和培养液中的游离细胞都可以产酶，其产酶速率也有两部分组成中的游离细

79、胞都可以产酶，其产酶速率也有两部分组成dE/dt = (dE/dt)f +(dE/dt)g dE/dt = (dE/dt)f +(dE/dt)g =(+ )xf+xg=(+ )xf+xg=fxf+ gxg =fxf+ gxg f :f :游离细胞的比产酶速率游离细胞的比产酶速率g:g:固定化细胞的比产酶速率固定化细胞的比产酶速率3.3.固定化细胞连续产酶动力学固定化细胞连续产酶动力学文献查阅文献查阅产糖化酶黑曲霉固定化方法比较的研究等产糖化酶黑曲霉固定化方法比较的研究等第六节第六节 固定化微生物原生质体发酵产酶固定化微生物原生质体发酵产酶 固定化原生质体是固定在载体上，在一定固定化原生质体是固

80、定在载体上，在一定的空间范围内进行生命活动的原生质体。的空间范围内进行生命活动的原生质体。由于原生质体不稳定由于原生质体不稳定, ,通过凝胶包埋法可使通过凝胶包埋法可使之稳定性提高之稳定性提高; ;一、固定化原生质体的特点一、固定化原生质体的特点1.1.变胞内产物为胞外产物变胞内产物为胞外产物; ;2.2.提高产酶率提高产酶率; ;3.3.稳定性较好稳定性较好; ;4.4.易于分离纯化易于分离纯化. .二、固定化原生质体发酵产酶的工艺条件及其控制二、固定化原生质体发酵产酶的工艺条件及其控制(1)(1)渗透压的控制渗透压的控制; ;(2)(2)防止细胞壁的再生防止细胞壁的再生; ;(3)(3)保证原生质体的浓度保证原生质体的浓度. . 思考题：思考题：1.1.简述酶生物合成的调节类型及其原理？简述酶生物合成的调节类型及其原理？2.2.如何控制微生物发酵产酶的工艺条件如何控制微生物发酵产酶的工艺条件？3.3.提高酶产量的措施主要有哪些？提高酶产量的措施主要有哪些？50504.4.酶的生物合成有哪几种模式？酶的生物合成有哪几种模式？27275.5.何谓产酶动力学？简述其动力学模型？何谓产酶动力学？简述其动力学模型？5252