j第八章目的基因的表达

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1、遗传信息从遗传信息从DNA到蛋白质到蛋白质的传递过程的传递过程中心法则中心法则（central dogma）。）。 一、基因表达：一、基因表达：二、克隆基因的表达：二、克隆基因的表达：外源基因在宿主细胞中表达。外源基因在宿主细胞中表达。外源基因外源基因表达载体表达载体重组载体重组载体导入宿主细胞导入宿主细胞在宿主细胞中在宿主细胞中表达出蛋白质表达出蛋白质提取蛋白提取蛋白宿主细胞：宿主细胞：原核细胞或真核细胞。原核细胞或真核细胞。用原核生物作宿主用原核生物作宿主A dividing E. coli第一节第一节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达原核或噬菌体启动子原核或噬菌体启动

2、子MCSSD序列序列终止子终止子识别原核细胞的识别原核细胞的启动子启动子，催化所有的，催化所有的RNA合成。合成。数个相关的结构基因与其调控区结合形数个相关的结构基因与其调控区结合形成一个表达的协同单位。成一个表达的协同单位。一、原核生物基因表达的特点一、原核生物基因表达的特点2. 以操纵子为单位以操纵子为单位1. 只有一种只有一种RNA聚合酶聚合酶53转录转录mRNA53翻译翻译蛋白质蛋白质NC533. 转录和翻译偶联、连续进行。转录和翻译偶联、连续进行。4. 不含内含子，缺乏转录后的加工系统。不含内含子，缺乏转录后的加工系统。5. 调控主要在转录水平上。调控主要在转录水平上。 含有一个启始

3、密码子和一段同核糖体含有一个启始密码子和一段同核糖体16SrRNA3末端碱基互补的序列，叫末端碱基互补的序列，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列）序列。6. mRNA的核糖体结合位点的核糖体结合位点Shine-Dalgarno（S-D）sequence:二、原核表达系统的注意事项二、原核表达系统的注意事项!1.外源基因不能带有内含子。外源基因不能带有内含子。2. 必须用必须用cDNA3. 不能直接用真核基因组不能直接用真核基因组DNA。4. 必须利用原核细胞的调控原件（启动子等）必须利用原核细胞的调控原件（启动子等）5. 防止外源基因产物对宿主细胞的毒害。防止外源基因产物对宿主细胞的

4、毒害。是是DNA上的能与上的能与RNA聚合酶结合并能起始聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。合成的序列。大大肠肠杆杆菌菌的的所所有有启启动动子子中中都都有有两两段段一一致致顺序（顺序（consensus sequence）。三、原核生物基因表达的调控三、原核生物基因表达的调控1. 启动子启动子-35 Box 和和 -10 Box（1） 启动子序列启动子序列 consensus sequences5-TTGACA-35-TATAAT-3 -10box（Pribnow Box）TTGACATATAAT转录起始位点转录起始位点17bp5核糖体结合位点核糖体结合位点RNA聚合酶聚合酶 亚基的识别位点

5、亚基的识别位点 。 -35box原核启动子共有序列的功能原核启动子共有序列的功能（2）翻译的起始位点）翻译的起始位点核糖体结合位点（核糖体结合位点（ RBS）1）Shine-Dalgarno（SD） sequence：mRNA上与核糖体上与核糖体16sRNA结合的序列。结合的序列。ribosome binding siteSDmRNA 5AGGAGGUAUG16S rRNA3UCCUCCAS-DS-D序列距离序列距离AUGAUG的距离也影响翻译的距离也影响翻译AUG（91%）GUG（8%）UUG（1%）位于位于SD序列下游。序列下游。ii）起始密码：）起始密码：2. 转录终止子转录终止子内终止

6、子内终止子 intrinsic terminator：E.coli中促使转录终止的中促使转录终止的DNA位置有位置有一段一段反向回文顺序反向回文顺序，其后紧接一串，其后紧接一串A，称为内终止子，形成终止信号。，称为内终止子，形成终止信号。在表达载体克隆位点的下游一般设计一在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子。段转录终止子。启动子启动子操纵子操纵子S-D序列序列目的基因目的基因终止子终止子由于茎环由于茎环3段紧接一串段紧接一串A/U的配对，稳定性的配对，稳定性比较差，有利于转录物脱落而不利于转录比较差，有利于转录物脱落而不利于转录延续。延续。 原因：原因：反向回文顺序被转录后，立即形成

7、一个茎反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎环结构，使转录物与模板之间配对的碱基环结构，使转录物与模板之间配对的碱基数降低，整个减弱了数降低，整个减弱了RNA 与与DNA的互作的互作 茎环结构茎环结构 多聚多聚A/UA/U5-CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAA CT TCT TTCT-33-GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAGAAAGA-5(模板模板)转录转录5-CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-OH-3(RNA)RNA折叠折叠mRNAmRNA折叠折叠U CU CC CU GU GGCGCA

8、UAUCGCGCGCGGCGCCGCGCGCGGCGCA AA ACCCAC UUUU3CCCAC UUUU3DNARNA聚合酶聚合酶脱落脱落大肠杆菌偏爱大肠杆菌偏爱UAA。一般安置上。一般安置上全部的三个全部的三个终止密码终止密码防止核糖体跳跃（防止核糖体跳跃（skipping）。）。4. 翻译增强子翻译增强子Translation enhancer能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率的特殊序列。中的表达效率的特殊序列。T7噬菌体基因噬菌体基因10前导序列（简称前导序列（简称g10-L序列）序列）;大肠杆菌大肠杆菌atpE基因基因mRNA5-UTR

9、中富含中富含U的区段。的区段。213 .翻译终止密码翻译终止密码 必须是一种强启动子必须是一种强启动子能使外源基因的蛋白产量达到细胞能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的总蛋白的10%-30%以上。以上。应是可诱导型的应是可诱导型的用温度或化学试剂诱导。用温度或化学试剂诱导。（1）最佳启动子必须具备的条件）最佳启动子必须具备的条件5. 基因工程常用的原核启动子基因工程常用的原核启动子 p87来自大肠杆菌的来自大肠杆菌的乳糖操纵子。乳糖操纵子。用乳糖或其类似用乳糖或其类似物物IPTG充当诱导充当诱导物，与阻遏蛋白物，与阻遏蛋白结合，解除抑制。结合，解除抑制。Plac O目的基因目的基因（2） 乳

10、糖启动子乳糖启动子lac（3）色氨酸启动子）色氨酸启动子trptrpRP1O trpEtrpDP2trpCtrpB trpAtrpR阻遏蛋白基因；阻遏蛋白基因；P1P2启动子；启动子；O操纵基因；操纵基因； 衰减子衰减子来自大肠杆菌的色氨酸操纵子。来自大肠杆菌的色氨酸操纵子。trpRP1O trpEtrpDP2trpCtrpB trpA邻氨基苯甲邻氨基苯甲酸合成酶酸合成酶吲哚甘油吲哚甘油硼酸合成酶硼酸合成酶色氨酸色氨酸合成酶合成酶 链链 链链分支酸分支酸邻氨基邻氨基苯甲酸苯甲酸磷酸核糖基磷酸核糖基邻氨基苯甲酸邻氨基苯甲酸CDRP吲哚甘吲哚甘油油-磷酸磷酸色氨酸色氨酸阻遏物阻遏物转录转录（P1P

11、1是主要启动子，是主要启动子，P2P2的作用只有的作用只有3%3%。）。）没有色氨酸时，阻遏蛋白不能与操纵基因没有色氨酸时，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，能转录合成色氨酸所需要的酶。结合，能转录合成色氨酸所需要的酶。trpRP1O trpEtrpDP2trpCtrpB trpA阻遏物阻遏物色氨酸色氨酸结合结合不转录不转录用于表达载体的用于表达载体的trp启动子一般只包含启动基因、启动子一般只包含启动基因、操纵基因、和部分操纵基因、和部分trpE基因。基因。P1OtrpE目的基因目的基因有色氨酸时，阻遏蛋白与色氨酸结合后才有色氨酸时，阻遏蛋白与色氨酸结合后才能与操纵基因结合，从而阻止色氨酸合成能与

12、操纵基因结合，从而阻止色氨酸合成酶类的转录（称为酶类的转录（称为corepressor）。）。四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位1. 细胞质中表达细胞质中表达（1）包涵体（）包涵体（inclusion body） P93是存在于细胞质中的一种是存在于细胞质中的一种不溶性蛋白不溶性蛋白质质聚集折叠而成的晶体结构物。聚集折叠而成的晶体结构物。形成原理未知。形成原理未知。在大肠杆菌细胞内表达人生长激素在大肠杆菌细胞内表达人生长激素（human growth hormone, hGH）。）。例：例：使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解

13、、不损害寄主细胞不损害寄主细胞回收的蛋白生物活性差。回收的蛋白生物活性差。 缺点缺点 优点优点2. 周质中表达周质中表达（1）周质（）周质（periplasm）格兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间格兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。的细胞结构部分。蛋白质从细胞质转运到周质的复杂蛋白质从细胞质转运到周质的复杂机理目前不完全清楚机理目前不完全清楚优点：优点：容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少。被降解的少。phoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、-内内酰酰胺胺酶酶（lactamase）、）、肠肠毒素（毒素（enterotoxin）

14、ST-II、LT-B等等（3）常用的原核信号肽）常用的原核信号肽大肠杆菌的信号肽：大肠杆菌的信号肽：能带领蛋白穿过膜到达周质。但以后需能带领蛋白穿过膜到达周质。但以后需要正确切割掉。要正确切割掉。（2）信号肽（）信号肽（signal peptide）鼠源鼠源RNase、人生长激素信号肽。、人生长激素信号肽。也能在细菌中起作用。也能在细菌中起作用。（2 2）真核信号肽真核信号肽胡萝卜欧氏杆菌的胡萝卜欧氏杆菌的PelB蛋白。蛋白。金黄色葡萄球菌的蛋白金黄色葡萄球菌的蛋白A。枯草芽孢杆菌的内切葡聚糖酶枯草芽孢杆菌的内切葡聚糖酶 （endoglucanase）。）。由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分由

15、于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不太理想。太理想。用溶血素（用溶血素（hemolysin）基因构建分泌性）基因构建分泌性融合蛋白；融合蛋白；使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白分分泌到细胞外泌到细胞外的培养基中。的培养基中。3. 胞外表达胞外表达或与细菌素释放蛋白（或与细菌素释放蛋白（bacteriocin release protein)共表达。共表达。载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。任何蛋白质融合在一起。S-D序列序列 ATG-外源基因

16、外源基因-TAG优点优点五、几种类型的原核表达载体五、几种类型的原核表达载体1. 非融合型表达载体非融合型表达载体产物结构接近于真核细胞体内的蛋产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。白质结构。缺点：缺点：容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。哈佛大学的哈佛大学的Gilbert实验室建立的。实验室建立的。表达能力强。表达能力强。（1）pKK223-3 载体载体P87组成结构：组成结构： 强启动子强启动子: tac（trp-lac）:trp的的-35区区lacUV5的的-10区区lac操纵基因操纵基因操纵基因：操纵基因：乳糖操纵子系统。乳糖操纵子系统。终止子：终止子：调节基因：

17、调节基因：Lac I宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统。宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统。 如如JM105菌。菌。rrnB的强终止子的强终止子rrnB强终止子强终止子S-D插入位点区插入位点区S-D序列和插入位点区：序列和插入位点区：tac PLac O S-D 插入位点区插入位点区rrnB T宿主宿主lac I载体的其余部分：载体的其余部分：来自来自pBR322质粒。质粒。表达诱导物：表达诱导物： IPTG（乳糖的类似物，不会被降解）（乳糖的类似物，不会被降解）阻遏物阻遏物IPTG必须选择一个有必须选择一个有lacI的宿主菌。的宿主菌。条件：条件：载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信载体表达出的外

18、源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。质中。如：如：pIN III系列：系列： 2. 分泌型表达载体分泌型表达载体P92pIN III-comA1, pIN III-comA2, pIN III-comA3,（1）组成结构）组成结构Ipplac P lac O S-D/ATG ompa插入位点插入位点Ipp（脂蛋白基因启动子）和（脂蛋白基因启动子）和lacUV5启动子。启动子。调节基因：调节基因：lac IS-D序列和起始密码序列和起始密码ATG。分泌信号肽：分泌信号肽：大肠杆菌外膜蛋白基因大肠杆菌外膜蛋白基因ompa。插入位点区（

19、多克隆位点）。插入位点区（多克隆位点）。 强启动子：强启动子：pIN III-comA1以以pBR322为为基础构建的。基础构建的。调节基因不必调节基因不必借助于宿主的借助于宿主的lacI.表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。体上的菌体蛋白连接在一起的。启动子：启动子：tac操纵基因：操纵基因：lacP调节基因：调节基因：lacIS-D序列序列3. 融合蛋白表达载体系统融合蛋白表达载体系统-pGEX系列系列P90（1）优点）优点（2）组成结构）组成结构便于融合蛋白的分离和纯化。便于融合蛋白的分离和纯化。22lacItac lac O

20、S-D/ATG GST 插入位点插入位点 TGAlacPori：pBR322 ori融合肽：融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶）谷胱甘肽巯基转移酶）GST融合蛋白用融合蛋白用Glutathione Sepharose亲和层析柱亲和层析柱分离纯化。分离纯化。（3）产物提纯）产物提纯（4）产物分离）产物分离用凝血酶或用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋因子可以把外源蛋白从白从GST上切下来。上切下来。柱（柱（column） GST 外源蛋白外源蛋白凝血酶凝血酶外源蛋白外源蛋白柱（柱（column） GSTGST洗脱洗脱柱（柱（column）可再利用可再利用pGEX插入区：插入区：pGEX-1 TCTG

21、GTT CCG CGT GGA TCC CCG GAA TTC ATC GTG ACT GAC TGA CGALeu Val Pro Arg Gly Ser Pro Glu Phe Ile Val Thr AspEcoR IBamH I凝血酶凝血酶 CTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG GGA ATT CAT CGT GAC TGA CTGACGLeu Val Pro Arg Gly Ser Pro Gly Ile His Arg AspEcoR IBamH I凝血酶凝血酶ATC GAA GGT CGT GGG ATC CCC GGG AAT TCA TCG TGA CTGA

22、CTGACIle Giu Gly Arg Gly Ile Pro Gly Asn Ser SerEcoR IBamH IXa因子因子pGEX-2X的插入区：的插入区：pGEX-3X的插入区：的插入区：Sma ISma I（5）其他融合蛋白系统）其他融合蛋白系统P91His-tag（组氨酸标签）：（组氨酸标签）：在外源多肽的在外源多肽的N端或端或C端接上端接上6个组氨酸个组氨酸（His）。）。His-tag能与能与Ni2+柱柱结合，但很容易被结合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脱下来，可以（或咪唑溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。纯化蛋白质。5-TTGACA-35-TATAAT-3 -35bo

23、x -10box（Pribnow Box）六、影响外源基因表达效率的因素六、影响外源基因表达效率的因素1. 启动子的结构对表达效率的影响启动子的结构对表达效率的影响RNA聚合酶聚合酶 亚基的识别位点亚基的识别位点（1）一致顺序）一致顺序（2）-35区与区与-10区之间的距离区之间的距离间隔为间隔为17bp时，启动子最强。时，启动子最强。（3） -35区和区和-10区的碱基顺序区的碱基顺序越接近一致顺序，启动子越强。越接近一致顺序，启动子越强。5-TTGACATATAAT一致顺序一致顺序lactrp PLrecAtac Itac II5-TTTACATATGTT5-TTGACATTAACT5-T

24、TGACAGATACT5-TTGATATATAAT5-TTGACATATAAT5-TTGACATTTAAT-35box-10box5-AGGAGGU-3S-D序列后面的序列后面的4个碱基：个碱基：如果是如果是A（T）, 翻译效率最高；翻译效率最高；如果是如果是G（C）,效率只有效率只有50%或或25%。2. 翻译起始序列对表达效率的影响翻译起始序列对表达效率的影响（1）S-D序列序列？AUG左侧的三个碱基也有影响。左侧的三个碱基也有影响。（2）起始密码）起始密码AUG -半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的mRNA中：中：AUG左侧如果是左侧如果是UAU或或CUU时，最时，最为有效；为有效；如果是如果是U

25、UC、UCA或或AGG时下降时下降20倍。倍。SD序列与翻译起始密码子之间的距离为序列与翻译起始密码子之间的距离为3-9个碱基。个碱基。 在翻译起始区周围的序列不易形成明显的在翻译起始区周围的序列不易形成明显的二级结构。二级结构。（3） 其它其它3. 启动子与外源基因之间的距离启动子与外源基因之间的距离转录终止区的存在保证载体转录终止区的存在保证载体不会转录非必须基不会转录非必须基因因，不必浪费源量和能量、不会干扰正常的表，不必浪费源量和能量、不会干扰正常的表达。达。增加载体的拷贝数会增加转录出的增加载体的拷贝数会增加转录出的mRNA数目。增加表达效率。数目。增加表达效率。4. 转录终止区对表

26、达效率的影响转录终止区对表达效率的影响5.载体拷贝数及稳定性对表达效率的影响载体拷贝数及稳定性对表达效率的影响6.外源蛋白在菌体中的稳定性对表达效率的影响外源蛋白在菌体中的稳定性对表达效率的影响但过度的外源基因的表达会影响宿主的正常生长。但过度的外源基因的表达会影响宿主的正常生长。1.选择强启动子序列，如选择强启动子序列，如tac 等等七、提高表达水平常用的方法七、提高表达水平常用的方法2. 调整调整S-D序列与序列与AUG碱的距离碱的距离距离过长或过短都影响真核基因的表达。距离过长或过短都影响真核基因的表达。根据不同的启动子选择不同的距离。根据不同的启动子选择不同的距离。3. 改变起始密码下

27、面的几组密码子改变起始密码下面的几组密码子一般为一般为3-9bp。能提高翻译的起始效率。能提高翻译的起始效率。4. 增加增加mRNA的拷贝数和稳定性的拷贝数和稳定性5. 减轻宿主细胞的代谢负荷减轻宿主细胞的代谢负荷合理地调节代谢负荷与外源基因高效表合理地调节代谢负荷与外源基因高效表达的关系。达的关系。将宿主生长代谢与外源基因表达分开。将宿主生长代谢与外源基因表达分开。（1）诱导表达）诱导表达 一般采用温度诱导或药物诱导。一般采用温度诱导或药物诱导。去除转录物内的衰减和非特异终止，加入抗终去除转录物内的衰减和非特异终止，加入抗终止的序列元件，加放正常转录终止序列。选用止的序列元件，加放正常转录终

28、止序列。选用RNase缺失的受体菌缺失的受体菌cI857阻遏物有活性，抑制阻遏物有活性，抑制 PL启动子，启动子，外源基因不表达，宿主大量生长。外源基因不表达，宿主大量生长。32C:42C:cI857阻遏物失活，阻遏物失活，PL启动子启动，外启动子启动，外源基因高水平表达，宿主生长受到限源基因高水平表达，宿主生长受到限制。制。cI857PL外源基因外源基因PO PL启动子是温度诱导型启动子是温度诱导型调节基因调节基因lac I（位于宿主基因组内或载体上）（位于宿主基因组内或载体上）始终产生阻遏物。始终产生阻遏物。无无IPTG:阻遏物与阻遏物与lac操纵基因结合，抑制外操纵基因结合，抑制外源基因

29、转录。宿主大量生长。源基因转录。宿主大量生长。有有IPTG:阻遏物与阻遏物与IPTG结合，结合，lac操纵基因解操纵基因解放，外源基因大量转录。宿主生长受放，外源基因大量转录。宿主生长受抑制。抑制。tac启动子是药物诱导型启动子是药物诱导型（2）表达载体诱导复制）表达载体诱导复制 将宿主的生长与载体的复制分开。将宿主的生长与载体的复制分开。当宿主大量当宿主大量生长后生长后，再诱导载体制粒的，再诱导载体制粒的复制，增加拷贝数。复制，增加拷贝数。当需要宿主大量当需要宿主大量生长时生长时，抑制载体质，抑制载体质粒的复制。粒的复制。N末端：由原核基因编码一段多肽，末端：由原核基因编码一段多肽，C末端：

30、是完整的真核外源基因。末端：是完整的真核外源基因。（1）设计成融合蛋白）设计成融合蛋白 这是避免被降解的最好措施。这是避免被降解的最好措施。质粒基因产物质粒基因产物 目的基因产物目的基因产物NC切割切割6. 提高表达产物的稳定性提高表达产物的稳定性防止被宿主的酶降解。防止被宿主的酶降解。使用次黄嘌呤核苷（使用次黄嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，）缺陷型菌株，减少宿主菌的蛋白酶合成。减少宿主菌的蛋白酶合成。大肠杆菌的大肠杆菌的htp R基因突变也减少蛋白酶基因突变也减少蛋白酶的降解作用。的降解作用。T4噬菌体的噬菌体的pin基因产物能抑制细菌的蛋基因产物能抑制细菌的蛋白酶。可把白酶。可把pin增加

31、到载体上。增加到载体上。（2） 使用突变菌株，保护外源蛋白不被降解使用突变菌株，保护外源蛋白不被降解 减少宿主菌本身的蛋白酶的表达。减少宿主菌本身的蛋白酶的表达。（3）表达分泌蛋白）表达分泌蛋白 细胞质细胞质外膜外膜内膜内膜周间质周间质质粒质粒染色体染色体“外排外排”： 蛋白质从细胞质跨过内外膜到培养液中。蛋白质从细胞质跨过内外膜到培养液中。“分泌分泌”： 蛋白质从细胞质跨过内膜到周间质中。蛋白质从细胞质跨过内膜到周间质中。细菌蛋白分泌的条件：细菌蛋白分泌的条件：位于位于N端，一般为端，一般为15-30aa 。真核与原。真核与原核的结构相似核的结构相似, 功能相似，可以互换。功能相似，可以互换

32、。 碱性氨基酸碱性氨基酸N疏水氨基酸核心区疏水氨基酸核心区切割位点切割位点Arg、LysLeu、IleAlaGlySer信号肽酶信号肽酶外源蛋白外源蛋白 有信号肽。有信号肽。 细胞内的转运机制。细胞内的转运机制。真核细胞中的分泌蛋白能在大肠杆菌中真核细胞中的分泌蛋白能在大肠杆菌中很好地分泌表达；很好地分泌表达；但非分泌蛋白很难在大肠杆菌中分泌。但非分泌蛋白很难在大肠杆菌中分泌。信号肽酶信号肽酶I、信号肽酶、信号肽酶II等近等近20多种多种蛋白质的参与。蛋白质的参与。 蛋白质蛋白质内内有与有与分泌相关的分泌相关的aaaa 序列。序列。为蛋白指明目的地。为蛋白指明目的地。九、外源蛋白质表达后的正确

33、修饰九、外源蛋白质表达后的正确修饰分子内二硫键、分子间二硫键。二硫键异构分子内二硫键、分子间二硫键。二硫键异构酶催化。使蛋白质能够正确折叠。酶催化。使蛋白质能够正确折叠。1. 形成正确的二硫键形成正确的二硫键 人胰岛素分子人胰岛素分子抗体分子抗体分子人血红蛋白分子人血红蛋白分子如信号肽、内含肽（如信号肽、内含肽（intein）等序列的切割。）等序列的切割。2. 前体切割前体切割 （1 1）O-糖基化（糖基化（Ser, Thr）增加蛋白质的稳定性和某些特殊性质。增加蛋白质的稳定性和某些特殊性质。3. 蛋白质糖基化蛋白质糖基化 糖基糖基（2）N-糖基化（糖基化（Asn）Dol：长醇：长醇Manno

34、se：甘露糖：甘露糖Glucose：葡萄糖：葡萄糖N-AcGlc：N乙酰氨基葡萄糖乙酰氨基葡萄糖磷酸化、乙酰化、磷酸化、乙酰化、硫酸化、丙烯酸硫酸化、丙烯酸化、羰基化、豆化、羰基化、豆冠酸化、软脂化冠酸化、软脂化4. 氨基酸残基的修饰氨基酸残基的修饰 羟脯氨酸羟脯氨酸甲基组氨酸甲基组氨酸羟赖氨酸羟赖氨酸羧基谷氨酸羧基谷氨酸缺乏蛋白质的加缺乏蛋白质的加工。工。（如糖基化、氨（如糖基化、氨基酸修饰等）。基酸修饰等）。十、原核细胞表达的缺陷十、原核细胞表达的缺陷酵母菌、植物原生质体、动物培养细胞等。酵母菌、植物原生质体、动物培养细胞等。第二节第二节 外源基因在真核细胞中的表达外源基因在真核细胞中的表

35、达真核或病毒启动子真核或病毒启动子 MCS PolyA信号信号 终止子终止子外源基因外源基因 能在能在E.coli中克隆和扩增。中克隆和扩增。1. 酵母克隆载体酵母克隆载体一、在酵母中表达一、在酵母中表达P275Leu2+、His+、Ura3+、Trp1+; 有合适的克隆位点。有合适的克隆位点。 有酵母的选择标记有酵母的选择标记Ori有有大肠杆菌的选择标记大肠杆菌的选择标记Ampr、Tetr。Dividing Saccharomyces cerevisiae (bakers yeast) cells由大肠杆菌质粒和酵母的由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片断（选片断（选择标记）构成。择标记）构成。C

36、olE1 酵母酵母Leu 2+如如 PYeleu10:（1）整合型载体）整合型载体(YIp) 转化率低（转化率低（1-10转化子转化子/微克微克DNA）。）。特点：特点：载体上只有细菌的复制区，没有酵载体上只有细菌的复制区，没有酵母的自主复制区。母的自主复制区。可与受体细胞的染色体可与受体细胞的染色体DNA同源重组，同源重组，随染色体一起复制。随染色体一起复制。不能在酵母细胞中自主复制不能在酵母细胞中自主复制整合到酵母的染色体上整合到酵母的染色体上不能从酵母细胞中提取载体。不能从酵母细胞中提取载体。由大肠杆菌质粒和酵母的由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片断片断(选择标记选择标记和酵母和酵母DNA自

37、主复制顺序自主复制顺序ARS）构成。）构成。大肠杆菌质粒大肠杆菌质粒 酵母酵母ARS（2）复制型载体）复制型载体(YRp) 酵母选择标记酵母选择标记ARSARS（automously replicating sequence）:ATTTTATATTTAT G T250bp保守区保守区特点：特点：转化率高（转化率高（102-103转化子转化子/微克微克DNA) 。不稳定，容易丢失。不稳定，容易丢失。可从大肠杆菌和酵母中提取质粒。可从大肠杆菌和酵母中提取质粒。既能在大肠杆菌中复制，又能在酵母既能在大肠杆菌中复制，又能在酵母细胞中自主复制。细胞中自主复制。穿梭载体（穿梭载体（shuttle vect

38、or）在在YRp质粒中插入酵母染色体的质粒中插入酵母染色体的着丝粒着丝粒区区。特点：特点：YRp质粒质粒 酵母着丝粒酵母着丝粒（3）着丝粒质粒）着丝粒质粒(YCp) 不易从细胞中提取。不易从细胞中提取。行为像染色体，能稳定遗传。行为像染色体，能稳定遗传。单拷贝存在。单拷贝存在。由大肠杆菌质粒、由大肠杆菌质粒、2 m质粒质粒及酵母染色体及酵母染色体DNA选择标记构成。选择标记构成。大肠杆菌质粒大肠杆菌质粒酵母选择标记酵母选择标记2 m质粒质粒如如pYF92:pBR3222 m酵母酵母his 3+（4）附加体型载体）附加体型载体(YEp) 2 m质粒：质粒：酿酒酵母的内源质粒，长度是酿酒酵母的内源

39、质粒，长度是2 m 。含有自主。含有自主复制起始区复制起始区ori和和STB序列（使质粒在供体中维序列（使质粒在供体中维持稳定）。持稳定）。特点：特点：很高的转化活性（很高的转化活性（103-105转化子转化子/微克微克DNA）.拷贝数多（拷贝数多（25-100分子分子/细胞）。细胞）。比比YRp稳定。稳定。YEp24Leu- 酵母酵母原生质体原生质体感受态感受态酶去壁酶去壁CaCl2、PEG整合到染色体上，整合到染色体上，或独立在酵母细胞内或独立在酵母细胞内转化转化Leu营养营养缺陷型缺陷型培养基培养基筛选筛选转化子克隆生长转化子克隆生长酵母载体酵母载体大肠杆菌大肠杆菌提取提取插入外源基因插

40、入外源基因鉴定克隆鉴定克隆发酵表达发酵表达外源基因产物外源基因产物分离、纯化分离、纯化2. 酵母转化和表达的一般过程酵母转化和表达的一般过程 （1）优点优点对其遗传学和生理学的研究比较深入。对其遗传学和生理学的研究比较深入。小量培养和大规模反应器中都能生长。小量培养和大规模反应器中都能生长。已经分离出很强的启动子。已经分离出很强的启动子。有有翻译后的加工翻译后的加工。本身自然分泌很少，便于胞外蛋白的纯本身自然分泌很少，便于胞外蛋白的纯 化。化。安全性高（安全性高（FDA确认的安全生物），不确认的安全生物），不 需要宿主的安全性检验。需要宿主的安全性检验。3. 酵母表达系统的特点酵母表达系统的特

41、点 常常发生质粒丢失。常常发生质粒丢失。重组蛋白常常超糖基化重组蛋白常常超糖基化表达量普遍低。表达量普遍低。（2）缺点）缺点每个每个N-寡糖链上含有寡糖链上含有100多个甘露糖，多个甘露糖，分泌困难。分泌困难。正常的高甘露糖寡糖链上仅有正常的高甘露糖寡糖链上仅有8-138-13个甘露糖。个甘露糖。分泌型蛋白有时会留在分泌型蛋白有时会留在壁膜壁膜间隙，间隙，诊断试剂诊断试剂丙肝病毒蛋白丙肝病毒蛋白HIV-1抗原抗原种类种类名称名称疫苗疫苗乙肝病毒表面抗原乙肝病毒表面抗原疟原虫环子孢子蛋白疟原虫环子孢子蛋白HIV-1外壳蛋白外壳蛋白4. 在啤酒酵母中表达的重组蛋白在啤酒酵母中表达的重组蛋白人类治疗

42、用蛋白药物人类治疗用蛋白药物上皮生长因子上皮生长因子胰岛素胰岛素类胰岛素生长因子类胰岛素生长因子血小板源生长因子血小板源生长因子胰岛素前体胰岛素前体成纤维细胞生长因子成纤维细胞生长因子集落刺激因子集落刺激因子 1抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶凝血因子凝血因子VIIIa24（1）细胞质内表达）细胞质内表达例：人例：人Cu/Zn-SOD在酵母中表达：在酵母中表达：5. 在啤酒酵母中表达外源蛋白的方式在啤酒酵母中表达外源蛋白的方式超氧化物超氧化物H+H2O2H2O过氧化物酶过氧化物酶表达出的表达出的SOD修饰正确：修饰正确：起始氨基酸被切掉，起始氨基酸被切掉，第二个氨基酸丙氨酸也被乙酰化。第二个氨基酸丙氨酸也

43、被乙酰化。SOD(SOD(超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶) )宿主：宿主：亮氨酸合亮氨酸合成缺陷型成缺陷型酵母。酵母。GAPD：甘油醛磷甘油醛磷酸脱氢酶酸脱氢酶（2 2）表达分泌型蛋白）表达分泌型蛋白在啤酒酵母中，只有分泌型的蛋白质才能被在啤酒酵母中，只有分泌型的蛋白质才能被糖基化。糖基化。需要糖基化的重组蛋白必须是分泌蛋白。需要糖基化的重组蛋白必须是分泌蛋白。方法：方法：构建载体构建载体在重组蛋白的前面加一段编码酵母菌交在重组蛋白的前面加一段编码酵母菌交配类型因子配类型因子a1的前导肽，与重组蛋白的的前导肽，与重组蛋白的N端通过端通过Lys-Arg相连。相连。前导肽（前导肽（leader pe

44、ptide）：）：蛋白质分泌到壁膜间隙时，酵母菌的蛋白质分泌到壁膜间隙时，酵母菌的内内切蛋白酶切蛋白酶识别这个切点信号，把重组蛋识别这个切点信号，把重组蛋白正确切下来。白正确切下来。信号肽的切割：信号肽的切割：前导肽前导肽 Lys-Arg 重组蛋白（水蛭素）重组蛋白（水蛭素）内切蛋白酶内切蛋白酶6.6.其它酵母表达系统其它酵母表达系统（1 1）乙肝表面抗原在嗜甲烷酵母中表达乙肝表面抗原在嗜甲烷酵母中表达在大型发酵反应器中容易生长；在大型发酵反应器中容易生长；以甲醇作唯一的碳源和能源，成本低。以甲醇作唯一的碳源和能源，成本低。有甲醇时，表达的有甲醇时，表达的乙醇氧化酶乙醇氧化酶高达胞高达胞内总蛋

45、白的内总蛋白的40%！嗜甲烷酵母（嗜甲烷酵母（Pichia pastoris）的特点）的特点HBsAg: 乙肝表面抗原。可以作为疫苗。乙肝表面抗原。可以作为疫苗。Aox1：乙醇氧化酶基因：乙醇氧化酶基因1启动子（受甲醇激活调控）。启动子（受甲醇激活调控）。His4：组氨酸合成所需的组氨酸脱氢酶基因。：组氨酸合成所需的组氨酸脱氢酶基因。3-aox1：整合到特定染色体的位点序列。：整合到特定染色体的位点序列。表达载体构建（整合型）：表达载体构建（整合型）：诱导物：甲醇。诱导物：甲醇。产量：产量：9106剂疫苗剂疫苗/240L发发酵罐。酵罐。整整合合到到染染色色体体中中（2 2）牛溶菌酶）牛溶菌酶C

46、2C2在嗜甲醇酵母中的表达在嗜甲醇酵母中的表达作为饲料作为饲料添加剂促添加剂促进反刍动进反刍动物消化。物消化。产量：产量：10L，200h连续连续发酵产出发酵产出50g溶菌酶。溶菌酶。二、昆虫培养细胞表达系统二、昆虫培养细胞表达系统1. 杆状病毒（杆状病毒（Baculovirus）广泛侵染包括许多昆虫在内的无脊椎动物。广泛侵染包括许多昆虫在内的无脊椎动物。（1）侵染周期：）侵染周期：两种形式两种形式单独病毒粒子形式单独病毒粒子形式病毒病毒粒子粒子宿主细胞宿主细胞病毒病毒粒子粒子侵染侵染释放释放病毒病毒粒子粒子宿主细胞宿主细胞侵染侵染宿主细胞宿主细胞侵染侵染合成多合成多角体蛋白角体蛋白裂解裂解释

47、放释放多面体溶解多面体溶解一般使用苜蓿银纹夜蛾细胞核型多角体病毒一般使用苜蓿银纹夜蛾细胞核型多角体病毒（Autographa california multiple nuclear polyhedrosis virus，AcMNPV）多面体形式多面体形式（2 2）杆状病毒的表达特点）杆状病毒的表达特点感染后感染后36-48h，病毒开始合成大量的，病毒开始合成大量的 多角蛋白。多角蛋白。多角蛋白的启动子特别强。多角蛋白的启动子特别强。多角蛋白基因可以被替换掉而不影响多角蛋白基因可以被替换掉而不影响 病毒的繁殖。病毒的繁殖。多角体基因被外源基因取代后，病毒仍然多角体基因被外源基因取代后，病毒仍然能

48、形成有感染能力的病毒粒子，但不能形能形成有感染能力的病毒粒子，但不能形成多面体。成多面体。3. 转化子筛选转化子筛选通过显微镜检查看是否有多面体形成。通过显微镜检查看是否有多面体形成。源自草地夜蛾的细胞株，在这种细胞中，源自草地夜蛾的细胞株，在这种细胞中，多角蛋白的多角蛋白的启动子特别活跃启动子特别活跃。2. 最普遍应用的宿主细胞株最普遍应用的宿主细胞株（1 1）转移载体的构建转移载体的构建大肠杆菌质粒大肠杆菌质粒，插入两段，插入两段AcMNPV序列以供同源重组。序列以供同源重组。4. 4. 杆状病毒转化载体杆状病毒转化载体杆状病毒的基因组太大（杆状病毒的基因组太大（13kb环状环状DNA），

49、），不能直接插入。不能直接插入。必须使用同源重组的办法。必须使用同源重组的办法。多角蛋白的启动子和终止子及多角蛋白的启动子和终止子及polyA加加尾信号。尾信号。启动子与终止子之间插入多克隆位点启动子与终止子之间插入多克隆位点转移载转移载体体（2 2）杆状病毒载体转化过程杆状病毒载体转化过程 转移载体中插入外源基因转移载体中插入外源基因 转移载体与野生型转移载体与野生型AcMNPV DNA共同转共同转染宿主细胞染宿主细胞 转移载体与病毒基因组发生双交换转移载体与病毒基因组发生双交换 外源基因被交换转入病毒基因组中外源基因被交换转入病毒基因组中 重组病毒侵染宿主重组病毒侵染宿主4-5天后即可收获

50、重天后即可收获重组蛋白。组蛋白。4.4.目前已经用杆状病毒在真核生物细胞中目前已经用杆状病毒在真核生物细胞中表达的外源蛋白表达的外源蛋白外源蛋白外源蛋白外源蛋白外源蛋白外源蛋白外源蛋白外源蛋白外源蛋白 干干干干扰扰扰扰素素素素腺苷酸脱氢酶腺苷酸脱氢酶腺苷酸脱氢酶腺苷酸脱氢酶 淀粉淀粉淀粉淀粉酶酶酶酶前体蛋白前体蛋白前体蛋白前体蛋白 干干干干扰扰扰扰素素素素Blue tongue virusBlue tongue virus中和抗原中和抗原中和抗原中和抗原红细胞生成素红细胞生成素红细胞生成素红细胞生成素HIV-1HIV-1外壳蛋白外壳蛋白外壳蛋白外壳蛋白流感病毒凝集素流感病毒凝集素流感病毒凝集素

51、流感病毒凝集素白细胞介素白细胞介素白细胞介素白细胞介素2 2Lassa virusLassa virus蛋白蛋白蛋白蛋白鼠单克隆抗体鼠单克隆抗体鼠单克隆抗体鼠单克隆抗体脊髓灰质炎病毒蛋白脊髓灰质炎病毒蛋白脊髓灰质炎病毒蛋白脊髓灰质炎病毒蛋白类狂犬病病毒蛋白类狂犬病病毒蛋白类狂犬病病毒蛋白类狂犬病病毒蛋白狂犬病病毒糖蛋白狂犬病病毒糖蛋白狂犬病病毒糖蛋白狂犬病病毒糖蛋白Simian rotavirusSimian rotavirus外壳蛋白外壳蛋白外壳蛋白外壳蛋白抗原抗原抗原抗原组织型纤溶酶原激活组织型纤溶酶原激活组织型纤溶酶原激活组织型纤溶酶原激活剂剂剂剂5. 5. 杆状病毒大规模表达存在的问题

52、杆状病毒大规模表达存在的问题杆状病毒侵染昆虫幼虫，在幼虫体内表达外杆状病毒侵染昆虫幼虫，在幼虫体内表达外源蛋白，成为源蛋白，成为“低成本蛋白工厂低成本蛋白工厂”。2222只粉蚊夜蛾幼虫只粉蚊夜蛾幼虫4 4天后表达的人腺苷酸脱氢天后表达的人腺苷酸脱氢酶占幼虫总蛋白的酶占幼虫总蛋白的2%-5%2%-5%。共产出。共产出9mg9mg很纯的很纯的产物。产物。（1）寿命短）寿命短感染感染4-5天后宿主细胞裂解或幼虫死亡。天后宿主细胞裂解或幼虫死亡。（2）共同转染率低）共同转染率低重组率更低。重组率更低。0.1%-1%。三、外源基因在植物中表达三、外源基因在植物中表达根瘤存在于能引起植物形成冠瘿瘤的土壤农

53、存在于能引起植物形成冠瘿瘤的土壤农杆菌中，诱导冠瘿瘤形成，又称肿瘤诱杆菌中，诱导冠瘿瘤形成，又称肿瘤诱导质粒（导质粒（tumor inducing plasmid）。）。1. Ti质粒质粒: Ti plasmid环状双链环状双链DNA，1.5105-2.0105bp（185kb）(相当于细菌染色体的相当于细菌染色体的3%-5%）。）。（1）Ti质粒的结构质粒的结构 转移转移DNA，编码冠瘿碱的合成，能随机整，编码冠瘿碱的合成，能随机整合到植物的染色体上。长度一般为合到植物的染色体上。长度一般为12-24kb，是，是Ti质粒最重要的部分。质粒最重要的部分。左边界左边界右边界右边界生长素生长素基因

54、基因细胞分裂细胞分裂素基因素基因冠瘿碱冠瘿碱合成合成T-DNA（transfer-DNA）生长素基因生长素基因:iaaM（tms1）和）和iaaH（tms2）编码合成）编码合成吲哚吲哚乙酸乙酸（植物生长激素）的酶（植物生长激素）的酶iaaM: 色氨酸色氨酸-2-单加氧酶单加氧酶色氨酸色氨酸-2-单加氧酶单加氧酶色氨酸色氨酸吲哚吲哚-3-乙酰胺乙酰胺iaaH:吲哚吲哚-3-乙酰胺水解酶乙酰胺水解酶吲哚吲哚-3-乙酰胺水解酶乙酰胺水解酶吲哚吲哚-3-乙酰胺乙酰胺吲哚乙酸吲哚乙酸细胞分裂素基因细胞分裂素基因tmr（ipt）：异戊烯转移酶）：异戊烯转移酶, 催化：催化：二磷酸异戊烯（二磷酸异戊烯（IP

55、P）异戊烯酰嘌呤单异戊烯酰嘌呤单磷酸（磷酸（IPA）5-AMP章鱼碱（章鱼碱（octopine)胭脂碱（胭脂碱（nopaline）NH-(CH2)3-CH-COOHNHCH3-CH-COOHHN=CNH2NH-(CH2)3-CH-COOHNHHOOC-(CH2)2-CH-COOHHN=CNH2Arg与丙酮酸缩合成与丙酮酸缩合成Arg与与 酮戊二醛缩合成酮戊二醛缩合成冠瘿碱（冠瘿碱（opine）的）的类型和类型和化学结构化学结构农杆碱（农杆碱（agropine）冠瘿碱（冠瘿碱（opine）的作用）的作用冠瘿碱是在冠瘿瘤内合成并分泌出来的，冠瘿碱是在冠瘿瘤内合成并分泌出来的，是农杆菌的碳源和氮源。

56、大部分其他土壤是农杆菌的碳源和氮源。大部分其他土壤微生物都不能利用冠瘿碱。微生物都不能利用冠瘿碱。Glu的二环糖衍生物。的二环糖衍生物。毒性基因（毒性基因（vir）决定土壤农杆菌对植物的感染和决定土壤农杆菌对植物的感染和T-DNA的的转移，转移， 进入和整合进入和整合。vir的产物能诱导的产物能诱导Ti质粒产生质粒产生T-DNA区域的区域的单链拷贝。单链拷贝从单链拷贝。单链拷贝从Ti质粒脱离后，可质粒脱离后，可与与vir的产物的产物VIR D2蛋白结合，并在蛋白结合，并在VIR D4和和VIR B蛋白的帮助下穿过浓杆菌内膜、蛋白的帮助下穿过浓杆菌内膜、外膜、壁和植物细胞壁、细胞膜及核膜，外膜、

57、壁和植物细胞壁、细胞膜及核膜，最后整合到植物染色体上。最后整合到植物染色体上。单链的单链的5端是右边界区域，含有端是右边界区域，含有25bp重复重复序列，参与整合。序列，参与整合。章鱼碱代谢基因和胭脂碱代谢基因：章鱼碱代谢基因和胭脂碱代谢基因： 冠瘿碱代谢基因冠瘿碱代谢基因分别编码代谢这两种冠瘿碱分别编码代谢这两种冠瘿碱的酶。维持农杆菌生长。的酶。维持农杆菌生长。（1）第一步）第一步:植物受伤植物受伤植物受伤后能分泌植物受伤后能分泌酚类化合物酚类化合物（如乙（如乙酰丁香酮、酰丁香酮、 羟基乙酰丁香酮），诱导羟基乙酰丁香酮），诱导Ti质粒上的质粒上的毒性基因表达毒性基因表达。2. 农杆菌的感染和

58、生存农杆菌的感染和生存（1）第二步）第二步 感染植物感染植物（3）第三步）第三步 毒性基因（毒性基因（vir）表达）表达T-DNA上的产物催化产生过量的生长上的产物催化产生过量的生长素和细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。素和细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。脓杆菌吸附于植物的表面伤口部位（常脓杆菌吸附于植物的表面伤口部位（常在茎的基部）。在茎的基部）。virA、virG、virD、virB（4）第四步）第四步 T-DNA转移转移T-DNA被被vir基因产物切下来，并运送到植基因产物切下来，并运送到植物细胞核里，整合到植物基因组中。物细胞核里，整合到植物基因组中。（5）第五步）第五步 诱导冠瘿瘤诱导冠瘿瘤（

59、6）第六步）第六步 土壤农杆菌代谢冠瘿碱。土壤农杆菌代谢冠瘿碱。3. Ti质粒的种类质粒的种类根据所编码的冠瘿碱（根据所编码的冠瘿碱（opine），分为），分为（1）章鱼碱（）章鱼碱（octopine)型质粒型质粒（3）农杆碱（）农杆碱（agropine）型质粒）型质粒（2）胭脂碱（）胭脂碱（nopaline）型质粒）型质粒裸子植物、双子叶被子植物、禾谷类单子叶裸子植物、双子叶被子植物、禾谷类单子叶植物（玉米）。植物（玉米）。（1）能够自发地整合到植物的染色体上。）能够自发地整合到植物的染色体上。（2）能转化多种植物。）能转化多种植物。（3）强启动子）强启动子4. Ti质粒转化的对象质粒转化的

60、对象5. Ti质粒作为载体的可能性质粒作为载体的可能性T-DNA的的opine合成酶基因上有一个强合成酶基因上有一个强启动子，能启动外源基因的表达。启动子，能启动外源基因的表达。25（1）分子量太大（）分子量太大（120kb）！）！（2）限制性酶切位点太多。）限制性酶切位点太多。（3）被转化的植物细胞成为肿瘤，不能）被转化的植物细胞成为肿瘤，不能 再分化。再分化。（4）在大肠杆菌中不能复制。）在大肠杆菌中不能复制。6. 天然天然Ti质粒作载体的缺点质粒作载体的缺点（4）冠瘿碱合成对于植物无意义。应剔除掉。）冠瘿碱合成对于植物无意义。应剔除掉。（5）加入大肠杆菌的加入大肠杆菌的ori和选择标记和

61、选择标记。（6）加上真核生物的）加上真核生物的转录信号转录信号和和结束信号结束信号以以 及及添加添加polyA的信号序列的信号序列。（1）保留）保留T-DNA的转移功能部分（的转移功能部分（vir基因，基因， 左右边界左右边界）。）。（2）减少限制性酶切位点，引入）减少限制性酶切位点，引入单一插入位单一插入位 点点。（3）取消）取消T-DNA的致瘤基因，使被转化的植的致瘤基因，使被转化的植 物细胞不再成为肿瘤，能正常物细胞不再成为肿瘤，能正常分化分化。7. Ti质粒的改造质粒的改造改造后的改造后的Ti质粒载体模式质粒载体模式leftrightMCSAMProriVirselect8. Ti8.

62、 Ti载体的类型载体的类型（1）共整合载体（）共整合载体（cointegrate vectors）最早获得广泛应用的最早获得广泛应用的Ti质粒是比利时质粒是比利时科学家科学家P.Zambrisky等等1983年改造的年改造的pGV3850需要同源重组才能插入外源基因。需要同源重组才能插入外源基因。 pGV3850的特点：的特点：是一种受体质粒，外源基因不能直接插是一种受体质粒，外源基因不能直接插入，而是需要借助于入，而是需要借助于pBR322质粒作为中质粒作为中间载体。间载体。宿主土壤农杆菌的选择标记是位于中间宿主土壤农杆菌的选择标记是位于中间载体载体pBR322上的上的卡那霉素抗性卡那霉素抗

63、性（Kanr）基因。）基因。1 1）脓杆菌选择标记）脓杆菌选择标记2 2）最终受体植物的选择标记）最终受体植物的选择标记 选择标记选择标记卡那霉素抗性卡那霉素抗性（ Kanr ）基因（卡那霉）基因（卡那霉素对植物有剧毒！）素对植物有剧毒！） 外源基因插入外源基因插入pGV3850的过程的过程转化后可诱导愈伤组织分化成转基因植物转化后可诱导愈伤组织分化成转基因植物（2）双元载体（）双元载体（binary vectors）既有大肠杆菌复制起点也有农杆菌复制既有大肠杆菌复制起点也有农杆菌复制起点，是个起点，是个穿梭载体穿梭载体。Ti质粒被剔除了质粒被剔除了T-DNA、冠瘿碱代谢、冠瘿碱代谢基因、基因

64、、vir基因。基因。大幅度减小质粒的体积。（大幅度减小质粒的体积。（10kb）双元载体的结构双元载体的结构Ti的精髓：的精髓：Vir基因（转移）和左右界（整合）基因（转移）和左右界（整合）双元载体的转化双元载体的转化转化农杆菌之前，所有的克隆步骤都转化农杆菌之前，所有的克隆步骤都在大肠杆菌里操作。在大肠杆菌里操作。受体农杆菌内要求带有整套受体农杆菌内要求带有整套vir基因基因（但缺失（但缺失T-DNA及左右边界）的及左右边界）的“帮助帮助质粒质粒”提供提供vir产物。产物。1）基因插入）基因插入2）帮助质粒帮助质粒（ helper plasmid）Vir产物使双元载体上的产物使双元载体上的T-

65、DNA左右左右边界及其外源基因转入到植物细胞，边界及其外源基因转入到植物细胞，并整合到植物染色体上。并整合到植物染色体上。左左右右外源基因外源基因双元载体双元载体Vir帮助质粒帮助质粒农杆菌农杆菌Vir农杆菌农杆菌左左右右外源基因外源基因感染植物感染植物转化转化左左右右外源基因外源基因进入植物细胞核，进入植物细胞核，整合，表达整合，表达E.coli（3）三亲融合法）三亲融合法(triparental matig)含双元载体的大肠杆菌：含双元载体的大肠杆菌：含有含有外源基因外源基因和和左右边界左右边界。含有帮助质粒的辅助细菌：含有帮助质粒的辅助细菌：含含vir基因基因。受体农杆菌（空）：受体农杆

66、菌（空）：三种菌混合培养，然后通过各自的抗三种菌混合培养，然后通过各自的抗菌素抗性标记选择吸收了菌素抗性标记选择吸收了外源基因外源基因、左右界左右界、和、和Vir的农杆菌。的农杆菌。三亲三亲四、在哺乳动物细胞中表达四、在哺乳动物细胞中表达1.动物细胞基因克隆和表达载体动物细胞基因克隆和表达载体-SV40病毒病毒常用的常用的SV40载体，是从猿猴空泡病毒载体，是从猿猴空泡病毒SV40（simian vacuolating virus40）改）改造而来的。造而来的。 20面体外壳：面体外壳：由由VP1、VP2和和VP3三种病毒外三种病毒外壳蛋白构成。壳蛋白构成。5243bp的环状双链。的环状双链。

67、 DNA：（1） SV40病毒的结构病毒的结构SV40猿猴细胞猿猴细胞细胞裂解细胞裂解释放释放SV40啮齿类细胞啮齿类细胞细胞癌变细胞癌变SV40DNA整合整合到寄主染色体上到寄主染色体上permissivenonpermissive（2）SV40感染和生存方式感染和生存方式T-抗原（抗原（tumor antigen）:两个两个6 6聚体的聚体的T T抗原结合在抗原结合在SV40 DNASV40 DNA的复的复制起始点上，分别向相反方向移动，将制起始点上，分别向相反方向移动，将双链双链DNADNA解螺旋。解螺旋。随后单链随后单链DNADNA结合蛋白（结合蛋白（ssBssB）与解开的）与解开的单

68、链单链DNADNA结合维持解旋状态。结合维持解旋状态。(3) SV40 DNA的复制的复制解链解链SV40编码的蛋白。功能是在编码的蛋白。功能是在SV40 DNA复制的时候解开复制的时候解开DNA双链。双链。T抗原抗原SV40 DNA双链双链 SV40 复制起始位点复制起始位点5-CTCACTACTTCTGGAATAGC3-GAGTGATGAAGACCTTATCG120早期回文序列早期回文序列TCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCCTCTAGTCTCCGGCTCCGCCGGAGCCGGAGA2147T抗原结合位点抗原结合位点GCATAAATAAAAAAAATTAGTCCGTATT TA

69、TTTT TTTTAATCAG富含富含AT区区4869早期表达区：早期表达区：(4) SV40病毒的转录和翻译病毒的转录和翻译编码大编码大T抗原抗原（控制（控制DNA复制）和小复制）和小t抗原抗原。晚期表达区：晚期表达区：在在DNA复制一段时间复制一段时间后表达，产物是后表达，产物是VP1、VP2和和VP3三种外壳三种外壳蛋白蛋白。对非受纳细胞（对非受纳细胞（non permissive cells），只有），只有T 抗原表达，随后病毒基因组随机整合到宿抗原表达，随后病毒基因组随机整合到宿主染色体上。主染色体上。SV40整合整合(5) SV40病毒的整合病毒的整合有严格的包装限制有严格的包装限

70、制。如果插入的外源基因。如果插入的外源基因过大，就无法包装。过大，就无法包装。(6) SV40病毒的包装病毒的包装去掉一部分去掉一部分DNA(T抗原或者抗原或者VP基因）。基因）。助手型助手型SV40去掉去掉T抗原基因的病毒，抗原基因的病毒，保留晚期复制保留晚期复制启动子启动子。提供外壳蛋白。提供外壳蛋白。(7) SV40基因组的改造基因组的改造不能复制，但能包装。不能复制，但能包装。需要这两种缺陷型病毒混合感染，才能需要这两种缺陷型病毒混合感染，才能互补。既能使插入互补。既能使插入SV40的外源基因复的外源基因复制，又能使外源基因被包装进病毒颗粒，制，又能使外源基因被包装进病毒颗粒，得以扩增

71、。得以扩增。去掉去掉VP基因，插入基因，插入外源基因外源基因的病毒，的病毒，保留保留早期表达启动子早期表达启动子。不能包装，但能复制。不能包装，但能复制。重组型重组型SV40包装重组型包装重组型SV40SV40提供重组提供重组DNA和和T抗原。抗原。助手型助手型SV40: 提供提供VP外壳蛋白。外壳蛋白。重组型重组型SV40： 提供提供T抗原。抗原。包装成的病毒颗粒包装成的病毒颗粒中，中，既有含外源基既有含外源基因的重组型因的重组型，又有，又有助手型助手型DNA。(8) SV40混合传染过程混合传染过程感染细胞，整合感染细胞，整合用复制起点有缺陷的用复制起点有缺陷的SV40病毒侵染的病毒侵染的

72、猴细胞株猴细胞株CV-1得到的。所以称得到的。所以称COS（CV-1，Origin, SV40）病毒不能复制，但能产生病毒不能复制，但能产生T抗源（类似重抗源（类似重组型组型SV40）。）。DNA整合整合到猴染色体上。所以到猴染色体上。所以COS细胞中细胞中只有只有T抗原，无游离的抗原，无游离的SV40DNA。(9) COS细胞细胞 COS细胞的特点：细胞的特点：有有SV40的的T抗原抗原。有利于。有利于SV40来源的来源的载体复制载体复制利利用用COS细胞细胞扩增扩增外源外源基因基因只保留只保留SV40的的复制起始区复制起始区（ori）、早期区）、早期区域（域（T抗原）的抗原）的启动子启动子

73、、Poly A化位置以化位置以及及t抗原的内含子。如抗原的内含子。如pSV2:a区区: 1-323bp，SV40的的复制起始区、复制起始区、T抗原启抗原启 动子、转录起始区动子、转录起始区。b区：区：324-3369bp，pBR322的的复制起始区、复制起始区、 氨苄青霉素抗性氨苄青霉素抗性基因。基因。c区：区：3370-4217bp，t抗原内含子（拼接信抗原内含子（拼接信 号）、号）、 Poly A化位置化位置。d区：外源基因插入位置。区：外源基因插入位置。(10) SV40 DNA载体载体电刺激或脂质体转化法送入动物细胞。电刺激或脂质体转化法送入动物细胞。不需要包装，可插入不需要包装，可插

74、入10kb以上的外源基因。以上的外源基因。既能在大肠杆菌中增殖，又能转染哺乳动物既能在大肠杆菌中增殖，又能转染哺乳动物细胞。细胞。受感染的动物细胞不会裂解，能建立稳定的受感染的动物细胞不会裂解，能建立稳定的细胞株。细胞株。pSV2的特点：的特点：不能在猴细胞中复制（没有不能在猴细胞中复制（没有T抗原）。抗原）。在哺乳动物中存在的途径是整合到染色体上。在哺乳动物中存在的途径是整合到染色体上。GPT：Glutamic-Pyruvic Transferase（谷氨（谷氨酸酸-丙酮酸转氨酶，丙酮酸转氨酶，谷丙转氨酶谷丙转氨酶）pcDNA3Invitrogen Corporation CAT：chlor

75、amphenicol acetyl transferase（氯霉素乙酰转移酶）（用于分析表达量）（氯霉素乙酰转移酶）（用于分析表达量）pcDNA3.1pcDNA3.1CAT2. 人乳多空人乳多空BK病毒载体病毒载体人乳多空人乳多空BK病毒（病毒（human papova BK virus）能以多拷贝（多于）能以多拷贝（多于500拷贝）的染色拷贝）的染色体外双链体外双链DNA形式在培养的哺乳动物细胞中形式在培养的哺乳动物细胞中持续存在多代。持续存在多代。（1）构建穿梭载体）构建穿梭载体删除编码病毒核心蛋白和外壳蛋白的基因。删除编码病毒核心蛋白和外壳蛋白的基因。把病毒复制功能的基因插入到大肠杆菌把

76、病毒复制功能的基因插入到大肠杆菌 质粒中。质粒中。加入加入SV40的新霉素抗性基因的新霉素抗性基因Neor。加入一个受细胞色素加入一个受细胞色素P450 dioxin诱导的增强诱导的增强子（子（doxin-responsive enhancer，DRE）。）。加入一个加入一个DRE调控的小鼠乳腺癌启动子调控的小鼠乳腺癌启动子（MMTP）。）。TCDD（2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-doxin）诱导）诱导表达。表达。基因工程总结基因工程总结目的基因的获得目的基因的获得载体的提纯载体的提纯重组载体的构建重组载体的构建(酶切酶切/连接）连接）转化转化/转染细胞的筛选转染细

77、胞的筛选宿主细胞的转化宿主细胞的转化/转染转染宿主细胞的培养宿主细胞的培养目的基因的诱导表达目的基因的诱导表达1.下列哪一种酶作用时需要引物？（）下列哪一种酶作用时需要引物？（）A限制酶限制酶B末端转移酶末端转移酶C反转录酶反转录酶DDNA连接酶连接酶2.逆转录酶也称为反转录酶，是一种（）逆转录酶也称为反转录酶，是一种（）A依赖于依赖于DNA的的DNA聚合酶聚合酶B依赖于依赖于RNA的的DNA聚合酶聚合酶C依赖于依赖于DNA的的RNA聚合酶聚合酶DDNA聚合酶或聚合酶或RNA聚合酶聚合酶3.下列哪些属于重组下列哪些属于重组DNA分子？（）分子？（）APCR扩增的扩增的DNA片段片段B单链单链R

78、NA与单链与单链DNA杂交得到的产物杂交得到的产物C人基因组片段与质粒载体连接的产物人基因组片段与质粒载体连接的产物D存在于细菌细胞内的噬菌体染色体存在于细菌细胞内的噬菌体染色体1.已知某一内切核酸酶在一线状已知某一内切核酸酶在一线状DNA 上有上有3 个切点，用此酶切割该线状个切点，用此酶切割该线状DNA,可可得到得到3 个片段。个片段。2.迄今发现的质粒迄今发现的质粒DNA都是环状的。都是环状的。3所谓穿梭质粒载体是能够在两种以上的不同宿主细胞中复制的质粒，所用的所谓穿梭质粒载体是能够在两种以上的不同宿主细胞中复制的质粒，所用的复制起点不同。复制起点不同。4取代型载体取代型载体(repla

79、cement vector)是指同一种限制性内切核酸酶在是指同一种限制性内切核酸酶在DNA 中具有中具有两个切点，外源两个切点，外源DNA 通过取代这两个切点间的片段被克隆。通过取代这两个切点间的片段被克隆。5PCR既能用于扩增任何天然存在的核苷酸序列，又能重新设计任何天然核苷既能用于扩增任何天然存在的核苷酸序列，又能重新设计任何天然核苷酸序列的两个末端。因此，任意两个天然存在的酸序列的两个末端。因此，任意两个天然存在的DNA序列都能快速有效的扩增，序列都能快速有效的扩增，并拼接在一起。并拼接在一起。6不匹配的粘性末端是不能通过粘性末端连接的。不匹配的粘性末端是不能通过粘性末端连接的。7同聚物接尾法构建重组体，不仅效率高，而且也很容易回收插入的片段。同聚物接尾法构建重组体，不仅效率高，而且也很容易回收插入的片段。8.Northern印迹和印迹和 Southern印迹的基本原理是一样的，都是用于检测结构基因的印迹的基本原理是一样的，都是用于检测结构基因的表达。表达。