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1、魏氏梭菌及其主要毒素的研究进展魏氏梭菌及其主要毒素的研究进展报告内容报告内容v魏氏梭菌概述魏氏梭菌概述v魏氏梭菌毒素研究魏氏梭菌毒素研究 综述 分型及其依据魏氏梭菌产生的毒素四种主要毒素研究进展纯化及鉴定细菌毒力综述综述v革兰氏阳性有荚膜不运动的厌氧大杆菌，芽孢椭革兰氏阳性有荚膜不运动的厌氧大杆菌，芽孢椭圆形圆形,位于菌体中央或次极端，芽胞直径不大于菌位于菌体中央或次极端，芽胞直径不大于菌体，在一般培养时不易形成芽胞，在无糖培养基体，在一般培养时不易形成芽胞，在无糖培养基中有利于形成芽胞（中有利于形成芽胞（菌体形态菌体形态）v广泛分布于自然界，同时也是肠道中的常见菌之广泛分布于自然界，同时也是
2、肠道中的常见菌之一，在一定条件下，可引起各种严重疾病一，在一定条件下，可引起各种严重疾病v发病急、死亡快，因此对于本病的防制主要用疫发病急、死亡快，因此对于本病的防制主要用疫苗进行免疫预防苗进行免疫预防v危害：猝死症，家禽坏死性肠炎，人食物中毒及危害：猝死症，家禽坏死性肠炎，人食物中毒及气性坏疽气性坏疽 ；家畜肠毒血症、坏死性肠炎，痢疾；家畜肠毒血症、坏死性肠炎，痢疾培养特性培养特性v本菌虽属厌氧性细菌，但对厌氧程度的要本菌虽属厌氧性细菌，但对厌氧程度的要求并不太严，求并不太严，2%10%的的CO2条件下，生长条件下，生长更好更好v在普通培养基上能生长，若加葡萄糖，血在普通培养基上能生长，若加
3、葡萄糖，血液，则生长更好液，则生长更好v生长适宜温度为生长适宜温度为37-47，多认为，多认为43-47为最宜温度，在适宜条件下增代时间为最宜温度，在适宜条件下增代时间仅仅8min培养特性培养特性v血平板血平板：双层溶血环：双层溶血环 内环完全溶血内环完全溶血-毒素毒素 外环不完全溶血外环不完全溶血- - 毒素毒素v蛋黄琼脂平板蛋黄琼脂平板：NaglerNagler反应反应v庖肉培养基：庖肉培养基：数小时即可见到生长，产生数小时即可见到生长，产生大量气体，肉渣或肉块变为略带粉色，但大量气体，肉渣或肉块变为略带粉色，但不被消化不被消化 v 牛牛乳乳培养基培养基：“汹涌发酵汹涌发酵”（stormy
4、 fermentation）分型及其依据分型及其依据v根据此菌产生外毒素的种类，可将其分为根据此菌产生外毒素的种类，可将其分为A A、B B、C C、D D和和E 5E 5个型个型 vA A型菌：型菌：vB B型菌：型菌： vC C型菌：型菌：vD D型菌：型菌：vE E型：型：魏氏梭菌与相应疾病魏氏梭菌与相应疾病v其中，其中，A型菌主要引起人的气性坏疽和食物中毒，型菌主要引起人的气性坏疽和食物中毒，也可引起动物的气性坏疽，牛、绵羊、家兔肠毒也可引起动物的气性坏疽，牛、绵羊、家兔肠毒血症血症vB型菌主要引起羔羊痢疾；型菌主要引起羔羊痢疾；vC型菌主要是牛、猪肠毒血症、羊猝狙型菌主要是牛、猪肠毒
5、血症、羊猝狙vD型菌引起羔羊、绵羊、山羊、牛以及灰鼠的肠型菌引起羔羊、绵羊、山羊、牛以及灰鼠的肠毒血症；毒血症；vE型菌可致犊牛、羔羊肠毒血症，但很少发生。型菌可致犊牛、羔羊肠毒血症，但很少发生。 气性坏疽发病急剧，后果严重，需要尽早准确的做出微生气性坏疽发病急剧，后果严重，需要尽早准确的做出微生物学诊断，争取早期治疗：物学诊断，争取早期治疗：标本标本 镜检：可发现镜检：可发现G大杆菌，并伴有其他杂菌和少量形态大杆菌，并伴有其他杂菌和少量形态 不规则的白细胞。不规则的白细胞。 培养基培养基 厌氧培养厌氧培养 进一步鉴定进一步鉴定: : 牛乳培养基牛乳培养基 生化反应：生化反应：TSCTSC 动
6、物实验：泡沫肝实验动物实验：泡沫肝实验 分离诊断分离诊断纯化纯化液体培养基65-70C半小时43温箱培养3-4小时连续传代镜检TSC.石蕊牛奶血平板 侵袭力侵袭力：病原菌有突破宿主皮肤、黏膜：病原菌有突破宿主皮肤、黏膜 生理屏障等生理屏障等 免疫防御机制，进免疫防御机制，进 入体内定居、繁殖和扩散的能入体内定居、繁殖和扩散的能 力，力，包括包括荚膜、粘附素和侵袭荚膜、粘附素和侵袭 性物质。性物质。 毒素毒素：含有损害宿主组织、器官并引起：含有损害宿主组织、器官并引起生理功能紊乱的大分子成分。生理功能紊乱的大分子成分。毒毒力力细菌的毒力细菌的毒力荚膜、微荚膜。荚膜、微荚膜。黏附素黏附素：细菌表面
7、的蛋白质。：细菌表面的蛋白质。 菌毛分泌物菌毛分泌物 细菌的表面组分：如磷壁酸。细菌的表面组分：如磷壁酸。2 2、侵袭性物质：、侵袭性物质：协助病菌抗吞噬或向四周扩散。协助病菌抗吞噬或向四周扩散。如致病性葡萄球菌凝固酶、如致病性葡萄球菌凝固酶、A A群链球菌透明质酸酶、群链球菌透明质酸酶、链激酶等从而有利于细菌在组织中扩散。链激酶等从而有利于细菌在组织中扩散。侵袭力侵袭力1、菌体的表面结构、菌体的表面结构细细菌菌在在生生长长繁繁殖殖中中产产生生和和释释放放的的毒毒性性成成分分，可可直直接接或或间间接接损损伤伤宿宿主主细细胞胞、组组织和器官，干扰其生理功能。织和器官，干扰其生理功能。1.1.外毒
8、素外毒素2.2.内毒素内毒素（二）毒素（二）毒素 内毒素毒性作用内毒素毒性作用(A)(A)(A)(A)热源性热源性热源性热源性(C)(C)(C)(C)内毒素血症和休克内毒素血症和休克内毒素血症和休克内毒素血症和休克(D)(D)(D)(D)弥漫性血管内凝血（弥漫性血管内凝血（弥漫性血管内凝血（弥漫性血管内凝血（DICDICDICDIC）(B)(B)(B)(B)白细胞数目改变白细胞数目改变白细胞数目改变白细胞数目改变 9/18/区别要点区别要点外毒素外毒素内毒素内毒素存在部位存在部位由活的细菌释放至细菌体外由活的细菌释放至细菌体外为细菌细胞壁结构成份，菌体为细菌细胞壁结构成份，菌体崩解后释出崩解后
9、释出细菌种类细菌种类革兰阳性菌多见革兰阳性菌多见革兰阴性菌多见革兰阴性菌多见化学组成化学组成蛋白质蛋白质脂多糖脂多糖稳定性稳定性606080 30 min80 30 min破坏破坏耐热，耐热，160 2h160 2h4 h4 h破坏破坏毒性作用毒性作用强，有选择毒害作用，引起特殊临强，有选择毒害作用，引起特殊临床表现床表现稍弱，各种细菌内毒素的毒性稍弱，各种细菌内毒素的毒性作用大致相同。作用大致相同。抗原性抗原性强，可刺激机体产生高效价的抗毒强，可刺激机体产生高效价的抗毒素。经甲醛脱毒成为类毒素，仍有素。经甲醛脱毒成为类毒素，仍有较强的抗原性，可用于人工自动免较强的抗原性，可用于人工自动免疫疫
10、刺激机体对多糖成份产生抗体，刺激机体对多糖成份产生抗体，不形成抗毒素，不能经甲醛处不形成抗毒素，不能经甲醛处理成为类毒素理成为类毒素疫苗现状疫苗现状v梭菌类的疫苗有单价苗和多联苗，单价疫苗在实梭菌类的疫苗有单价苗和多联苗，单价疫苗在实际应用中难以取得很好的效果，原因是致病的梭际应用中难以取得很好的效果，原因是致病的梭菌种类较多，而且有的是混合感染，单价苗往往菌种类较多，而且有的是混合感染，单价苗往往是顾此失彼，不能有效地预防疾病。是顾此失彼，不能有效地预防疾病。v国外相继出现了包括产气荚膜梭菌的四联、五联、国外相继出现了包括产气荚膜梭菌的四联、五联、七联和八联苗梭菌苗，不仅把梭菌苗联合起来，七
11、联和八联苗梭菌苗，不仅把梭菌苗联合起来，而且还把所梭菌苗与需氧菌苗而且还把所梭菌苗与需氧菌苗(如巴氏杆菌苗、沙如巴氏杆菌苗、沙门氏杆菌苗门氏杆菌苗)联合起来，甚至与病毒苗联合起来，甚至与病毒苗(如羊痘疫如羊痘疫苗苗)联合起来进行防疫。联合起来进行防疫。疫苗现状疫苗现状v国内首先出现的是羔羊痢疾，肠毒血症等单价苗，国内首先出现的是羔羊痢疾，肠毒血症等单价苗，继之出现了羊猝狙、快疫二联苗，羊黑疫、快疫继之出现了羊猝狙、快疫二联苗，羊黑疫、快疫二联苗，快疫、羔羊痢疾、肠毒血症三联苗。文二联苗，快疫、羔羊痢疾、肠毒血症三联苗。文希喆等希喆等(1978)研制成功了快疫、羔羊痢疾、碎狙、研制成功了快疫、羔
12、羊痢疾、碎狙、肠毒血症、黑疫五联苗。纪金春等肠毒血症、黑疫五联苗。纪金春等(1978)研制成研制成功了快疫、羔羊痢疾、猝狙、肠毒血症、黑疫和功了快疫、羔羊痢疾、猝狙、肠毒血症、黑疫和肉毒中毒六联苗。肉毒中毒六联苗。疫苗现状疫苗现状v上世纪上世纪70年代到年代到80年代，中监所的文希喆、王泰健、屠年代，中监所的文希喆、王泰健、屠伟英等科研人员，在国际上率先开创了梭菌多联干粉苗的伟英等科研人员，在国际上率先开创了梭菌多联干粉苗的研究，取得满意效果，保存期长，使用方便，可以随意搭研究，取得满意效果，保存期长，使用方便，可以随意搭配，疫苗的保护期也得到的延长，基本克服了液体苗的缺配，疫苗的保护期也得到
13、的延长，基本克服了液体苗的缺陷。陷。v效力检验：多联苗所含的成份越多，需要的动物也越多，效力检验：多联苗所含的成份越多，需要的动物也越多，以致于达到不便检验的程度，严重阻碍了多联苗的发展，以致于达到不便检验的程度，严重阻碍了多联苗的发展，v采用免疫动物测定血清中和效价的方法，来评价梭菌苗的采用免疫动物测定血清中和效价的方法，来评价梭菌苗的效力。其方法是用梭菌苗免疫动物两次后，用国际单位效力。其方法是用梭菌苗免疫动物两次后，用国际单位(I.U.)衡量血清的中和效价，检验每批疫苗所需试验动物衡量血清的中和效价，检验每批疫苗所需试验动物为为8-12只。只。v免疫效果与制苗菌液中毒素毒力正相关免疫效果
14、与制苗菌液中毒素毒力正相关v抗原含量过大会产生严重局部反应，会导抗原含量过大会产生严重局部反应，会导致安全性检验不合格致安全性检验不合格主要毒素主要毒素毒素毒素v各型产气荚膜梭菌均产生各型产气荚膜梭菌均产生毒素毒素,它是产气荚膜梭它是产气荚膜梭菌最重要的毒素之一菌最重要的毒素之一,同时又是同时又是A型产气荚膜梭菌型产气荚膜梭菌的主要毒素的主要毒素v是是A型产气荚膜梭菌的主要毒素。它具有磷脂酶型产气荚膜梭菌的主要毒素。它具有磷脂酶C(Phospholipase C,PLC)和鞘磷脂酶和鞘磷脂酶(Sphin-gomyelinase)两种酶活性两种酶活性,能水解细胞能水解细胞膜的主要成分膜磷脂膜的主
15、要成分膜磷脂,从而破坏细胞膜结构的完整从而破坏细胞膜结构的完整性性理化性质和生物学特性v毒素是由毒素是由370个个氨基酸组成的单链多肽氨基酸组成的单链多肽,分子量分子量为为43 ku。它是一种依赖于锌离子的多功能性金。它是一种依赖于锌离子的多功能性金属酶属酶,具有细胞毒性、溶血活性、致死性、皮肤坏具有细胞毒性、溶血活性、致死性、皮肤坏死性、血小板聚集和增加血管渗透性等特性死性、血小板聚集和增加血管渗透性等特性v当把当把毒素加热至毒素加热至6070时时,就可以使其失去就可以使其失去活性活性,当进一步加热到当进一步加热到100时时,又可以恢复部分又可以恢复部分活性活性毒素基因的克隆与表达毒素基因的
16、克隆与表达v毒素基因在禽类和哺乳动物中都是保守的毒素基因在禽类和哺乳动物中都是保守的v毒素的启动子是最强的启动子之一毒素的启动子是最强的启动子之一,可被大肠杆菌可被大肠杆菌的的RNA聚合酶所识别聚合酶所识别,因而因而毒素在自身启动子下毒素在自身启动子下不仅可在产气荚膜梭菌本身中高效表达不仅可在产气荚膜梭菌本身中高效表达,也可在大也可在大肠杆菌中得到高效表达肠杆菌中得到高效表达v免疫免疫毒素的毒素的C端功能区端功能区,来预防产气荚膜梭菌所来预防产气荚膜梭菌所致气性坏疽的发生致气性坏疽的发生 刘家森等克隆了刘家森等克隆了毒素基因序列中从第毒素基因序列中从第294个碱基到中止密码子约个碱基到中止密码
17、子约900 bp的核苷酸序列的核苷酸序列,并表达出大小约并表达出大小约3. 8 ku的重组蛋白。重组蛋白完全涵盖的重组蛋白。重组蛋白完全涵盖了了毒素的羧基末端的蛋白序列并缺失掉了位于氨基末端内对毒素的羧基末端的蛋白序列并缺失掉了位于氨基末端内对毒素起重要作毒素起重要作用的用的Trp1、His11、Asp56、His68等氨基酸残基等氨基酸残基;表达的重组蛋白含量表达的重组蛋白含量占到菌体蛋白总量的占到菌体蛋白总量的30%以上以上,且表现出良好的反应原性且表现出良好的反应原性,无毒性现象产生。无毒性现象产生。毒素毒素v产气荚膜梭菌产气荚膜梭菌毒素是由产气荚膜梭菌毒素是由产气荚膜梭菌B型和型和C型
18、菌株产生型菌株产生的坏死、致死性毒素的坏死、致死性毒素,可引起人和动物的坏死性肠炎可引起人和动物的坏死性肠炎, 。 毒素对胰酶敏感，毒素对胰酶敏感，37作用作用30min后即完全失活后即完全失活v毒素分为毒素分为1、2毒素毒素,其中其中2毒素是近年确认的由毒素是近年确认的由C型型产气荚膜梭菌产生的一种新的毒素。产气荚膜梭菌产生的一种新的毒素。2毒素与毒素与1毒素没毒素没有明显的氨基酸序列的同源性有明显的氨基酸序列的同源性,但具有相似的生物学活性。但具有相似的生物学活性。而且而且,抗抗2毒素的抗体能识别纯化的毒素的抗体能识别纯化的2毒素毒素,并能与并能与1毒毒素发生弱反应素发生弱反应,然而然而,
19、抗抗1毒素的抗体只能与毒素的抗体只能与1毒素反应毒素反应,却不能与却不能与2毒素发生反应毒素发生反应,表明二者的免疫学相关性差表明二者的免疫学相关性差,但其机制尚不清楚。但其机制尚不清楚。1毒素毒素v1毒素是一种强毒素毒素是一种强毒素,具有细胞毒性、致死性。具有细胞毒性、致死性。纯化的纯化的1毒素分子量为毒素分子量为34 ku左右左右,等电点等电点(PI)约为约为5. 6。2毒素毒素v1997年年Gibert等首先从来自仔猪坏死性肠炎病等首先从来自仔猪坏死性肠炎病例的培养上清中分离纯化到这种例的培养上清中分离纯化到这种C型产气荚膜梭型产气荚膜梭菌菌(CWC245)毒素毒素v2毒素与家畜的梭菌性
20、胃肠道疾病有关毒素与家畜的梭菌性胃肠道疾病有关v2毒素在猪的胃肠道疾病中发挥了一定作用毒素在猪的胃肠道疾病中发挥了一定作用v2毒素基因存在于质粒上毒素基因存在于质粒上v研究刚起步研究刚起步毒素毒素v毒素是由毒素是由B型和型和D型产气荚膜梭菌所产生，型产气荚膜梭菌所产生，能引能引起家畜的致死性肠毒血症起家畜的致死性肠毒血症,又称肉性肾病又称肉性肾病v毒素的编码基因毒素的编码基因etx位于质粒上位于质粒上,etx基因编码的基因编码的蛋白蛋白毒素前体在分泌初期是无毒性的毒素前体在分泌初期是无毒性的,通过蛋白通过蛋白酶去除毒素前体酶去除毒素前体N端的端的13个氨基酸和个氨基酸和C端端22个氨个氨基酸后
21、成为有活性的成熟肽基酸后成为有活性的成熟肽,成熟肽分子质量为成熟肽分子质量为32 ku，参与活化的蛋白酶包括产气荚膜梭菌产参与活化的蛋白酶包括产气荚膜梭菌产生的生的蛋白酶和消化性蛋白酶如胰蛋白酶、蛋白酶和消化性蛋白酶如胰蛋白酶、胰凝胰凝乳蛋白酶。乳蛋白酶。v毒素是致死性毒素毒素是致死性毒素,给小鼠静脉注射纳克级的给小鼠静脉注射纳克级的毒毒素素,在在30 min内即可引起小鼠死亡内即可引起小鼠死亡,并且其毒力并且其毒力仅次于肉毒素和破伤风毒素仅次于肉毒素和破伤风毒素毒素毒素v这种通过切除这种通过切除N、C末端两段序列且还有菌体自身末端两段序列且还有菌体自身蛋白参与的活化过程较为少见。蛋白参与的活
22、化过程较为少见。Miyata S等证等证明明,去除去除C末端氨基酸残基是活化作用的关键末端氨基酸残基是活化作用的关键,而而且不同的酶切产生的毒素的且不同的酶切产生的毒素的N、C末端及其活性也末端及其活性也不相同。其中以胰蛋白酶加胰凝乳蛋白酶活化的不相同。其中以胰蛋白酶加胰凝乳蛋白酶活化的毒素毒力最强毒素毒力最强,而而N末端氨基酸残基去除与否对毒末端氨基酸残基去除与否对毒素活性基本没有影响。惟有素活性基本没有影响。惟有C末端的切除位点对末端的切除位点对毒素活性毒素活性,包括在神经突触膜上形成七聚体的能力包括在神经突触膜上形成七聚体的能力有影响。去除有影响。去除C末端氨基酸残基后的成熟毒素其末端氨
23、基酸残基后的成熟毒素其毒性是毒素前体的毒性是毒素前体的1 000倍。倍。毒素毒素v毒素与宿主细胞表面的作用机制还不是很清楚毒素与宿主细胞表面的作用机制还不是很清楚,但是现已证明它可以识别小鼠脑细胞和突触小体但是现已证明它可以识别小鼠脑细胞和突触小体膜上的唾液糖蛋白受体。目前只有两种细胞系对膜上的唾液糖蛋白受体。目前只有两种细胞系对毒素敏感毒素敏感,分别为分别为MDCK和人成平滑肌瘤和人成平滑肌瘤G402细胞据推测这与这两种细胞表面存在有效结合毒细胞据推测这与这两种细胞表面存在有效结合毒素的受体有关。素的受体有关。毒素vE型魏氏梭菌分泌型魏氏梭菌分泌 v组成 ：酶部分：酶部分(Ia)和结合部分和
24、结合部分(Ib) v功能：（1）Ia是一种是一种ADP核糖转移酶核糖转移酶;而而Ib是一种细胞是一种细胞结合蛋白结合蛋白 。（2） Ib与细胞膜的受体结合后，立即进入细胞膜与细胞膜的受体结合后，立即进入细胞膜间隙，形成低聚体，继而与间隙，形成低聚体，继而与Ia结合，诱导细胞产结合，诱导细胞产生内吞作用。生内吞作用。（3）Ib激活后能形成离子通道，而激活后能形成离子通道，而Ia则在则在pH值低值低于于5.6时封闭这一通道。时封闭这一通道。产气荚膜梭菌肠毒素(CPE)(CPE) v产生产生 ：A型魏氏梭菌在芽孢期产生的，部分型魏氏梭菌在芽孢期产生的，部分C、D型菌也可产生。型菌也可产生。v 影响因素：影响因素：pH、温度和碳源、温度和碳源 v功能功能（1）小肠上皮细胞的顶部形成一个小孔，从而造小肠上皮细胞的顶部形成一个小孔，从而造成宿主的体液和电解质流失。成宿主的体液和电解质流失。（2）提供紧密连接蛋白通过的入口。）提供紧密连接蛋白通过的入口。菌体形态双溶血环Nagler反应 在蛋黄琼脂平板上 ,菌落周围出现 乳白色浑浊圈,是由卵磷脂酶(毒素 )分解蛋黄中卵磷脂所致,此现象称Nagler反应,为本菌的特点。汹涌发酵 l产酸，产气，凝固，胨化几乎同时发生。l胨化：分解乳糖产酸，使干酪素凝固，产生的蛋白酶可使凝固的干酪素分解成水溶性蛋白胨。
