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1、基金申请的策略和技巧基金申请的策略和技巧黎黎明明涛涛中山大学蛋白质组学研究中心中山大学蛋白质组学研究中心中山大学基础医学院药理教研室中山大学基础医学院药理教研室基金申请基金申请l选题l撰写申请书l答辩撰写前的准备l好心情、好身体边想边写3h/天l读指南、读通知注意截止期l读标书、读高手、读同行l读自己卖点！？选题创新性工作基础l想法变文字一气呵成“立项依据”l沟通科研科87330567、医科处 87333055摘 要 研究内容和意义（限研究内容和意义（限研究内容和意义（限研究内容和意义（限400400字）字）字）字）1. 1. 基础：继续和深入基础：继续和深入 发表和未发表发表和未发表 创新创
2、新2. 2. 问题问题 中肯中肯 3. 3. 预实验预实验 针对针对“问题问题”的预实验结果的预实验结果4. 4. 假设假设 思想性、创新性思想性、创新性5. 5. 方法方法 可靠性第一可靠性第一 先进性第二先进性第二6. 6. 目标目标 明确、具体明确、具体7. 7. 意义意义 理论性和应用性理论性和应用性立 项 依 据1. 1. 1. 1. 关键关键关键关键! ! ! ! 占占占占50% 50% 50% 50% 文笔流畅、层次分明、逻辑性强文笔流畅、层次分明、逻辑性强文笔流畅、层次分明、逻辑性强文笔流畅、层次分明、逻辑性强2. 2. 要求：充分的理由和意义要求：充分的理由和意义 思想性思想
3、性 与摘要呼应与摘要呼应 3. 3. 自己的工作为依据自己的工作为依据 图文并茂图文并茂 规范规范 4. 4. 参考文献参考文献 时时效性效性 自己的文章自己的文章 规范化规范化5. 5. 深入浅出深入浅出 内行、外行读得懂内行、外行读得懂 6. 6. 人文文化人文文化 素质素质 精神精神 动人的故事动人的故事 神经元凋亡时神经元凋亡时SP1SP1对对BH3-onlyBH3-only蛋白蛋白BimBim的转录调控的转录调控细胞凋亡细胞凋亡时时SP1对对BH3-only蛋白蛋白Bim的转录调控的转录调控神经元凋亡时神经元凋亡时BH3-only蛋白蛋白Bim的转录调控的转录调控神经元凋亡时神经元凋
4、亡时SP1对对BH3-only蛋白蛋白Bim的的调控调控SP1对对BH3-only蛋白蛋白Bim的转录调控的转录调控SP1对神经元凋亡的调控作用对神经元凋亡的调控作用l关键词关键词：SP1/Bim/基因调控基因调控/信号转导信号转导/神经元凋亡神经元凋亡项 目 名 称研究内容、研究目标与研究内容、研究目标与拟解决的关键问题拟解决的关键问题研究目标l获获得得SP1SP1直直接接调调控控bimbim基基因因表表达达的的可可靠靠证证据据，阐阐明明促促凋凋亡亡蛋蛋白白BimBim由由SP1SP1转转录录调调控控的的新新机机制制，为为确确立立SP1SP1作作为为神神经经退退行行性性疾疾病病治治疗疗的的新
5、新靶靶点点提提供更充分的科学依据。供更充分的科学依据。要求：要求：明确、具体明确、具体解决学解决学术问题术问题神经元凋亡时神经元凋亡时神经元凋亡时神经元凋亡时SP1SP1对对对对BH3-onlyBH3-only蛋白蛋白蛋白蛋白BimBim的转录调控的转录调控的转录调控的转录调控与题目相呼应与题目相呼应研究内容（紧紧围绕研究目标）（紧紧围绕研究目标）1.证证明明bim启启动动子子核核心心区区的的SP1结结合合序序列列是是否否介介导导了了bim基基因因的的上上调调为了证实bim启动子核心区的SP1结合序列是否介导了bim基因的上调，将其中的SP1结合序列进行点突变，使其不能结合SP1；确定这一突变
6、是否能够消除bim启动子的撤钾反应。2.分分析析SP1是是否否能能够够与与bim启启动动子子核核心心区区的的SP1结结合合序序列列结结合合应用EMSA(ElectrophoreticMobilityShiftAssay)技术，证实bim启动子核心区的SP1结合序列是否能够与SP1结合；进一步采用CHIP(Chromatinimmunoprecipitation)方法，获得SP1与bim启动子核心区在细胞内结合的证据。3.从从bim的的mRNA和和蛋蛋白白质质水水平平，观观察察负负显显性性SP1是是否否能能够够抑抑制制撤撤钾钾诱诱导导的的bim基基因因的的上上调调质粒转染CGNs的转染率只能达到
7、0.1-1.0%，腺病毒的感染率可达7080%1。因此，构建dnSP1的腺病毒载体Ad-dnSP1，感染CGNs才能达到可靠分析bim的mRNA和蛋白质表达水平改变的目的。 4. 4. 分析分析SP1诱导诱导Bim这一机制对神经元凋亡的调控作用这一机制对神经元凋亡的调控作用确立SP1转录激活bim这一机制后，进一步分析这一机制对神经元凋亡的调控作用。拟解决的关键问题获得获得SP1SP1直接调控直接调控bimbim基因表达的可靠依据。基因表达的可靠依据。什么是关键问题？什么是关键问题？研究过程中对达到预期目标有重要影响的某些研究内容或因素。为达到预期目标所必须掌握的关键技术或研究手段。撰写要求：
8、撰写要求：找出关键问题，问题清晰，分析透彻，合理的解决方法。 研 究 方 案l项目需求为前提；项目需求为前提；l可靠性第一，先进性第二；可靠性第一，先进性第二；l参考文献；参考文献；l突出关键技术的描述；突出关键技术的描述；l不主张使用流程图，建议开头：不主张使用流程图，建议开头：“有关方法、技术路有关方法、技术路线、试线、试 验手段、关键技术综述如下验手段、关键技术综述如下”。 可行性分析 从学学术术思想角度提出思想角度提出1.工作基础工作基础（学术思想）（学术思想）2.科研梯队科研梯队3.实验条件实验条件4.实验技术实验技术5.交流与合作（国内、国外）交流与合作（国内、国外） 创 新 性
9、对创新的理解：创新性与先进性是有根本区别的。对创新的理解：创新性与先进性是有根本区别的。 原始创新：原始创新： 填补空白或修改传统的理论；填补空白或修改传统的理论； 新技术、新方法的发明创造。新技术、新方法的发明创造。 跟踪创新：跟踪创新： 在前人工作基础上补充、完善现有理论；在前人工作基础上补充、完善现有理论； 对原有技术、方法进行修改后产生对原有技术、方法进行修改后产生1 11 12 2的效果。的效果。本项目的特色与创新之处：申请人首次报道了神经元凋亡时促凋亡蛋白Bim上调是不依赖于JNK/c-Jun通路(Leyu Shi,et al, Neurosci Lett. 2005)一观察之后，
10、又以可靠的实验结果证明PI3K/Akt/FKHRL1信号通路也不参与bim的上调（见立项依据）。 bim上调的转录机制是什么？我们率先对bim启动子进行了5末端序列续减分析，确立了诱导bim表达的启动子核心区， 进而发现一个典型的转录因子SP1结合序列位于其中。进一步实验显示：神经元凋亡时SP1被激活；负显性SP1突变体和SP1-DNA结合抑制剂mithramycin A可抑制bim的上调。根据以上生物信息学分析和实验观察，我们首次提出了SP1介导bim上调这一新的bim转录机制：神经元凋亡时转录因子SP1被激活，激活的SP1与bim启动子核心区的SP1结合序列结合，从而转录激活bim的表达。
11、 本项目拟进一步采用负显性SP1突变体的腺病毒表达技术以及启动子点突变、EMSA和CHIP方法，旨在获得SP1直接调控bim基因的可靠证据，为阐明SP1对促凋亡蛋白Bim的调控作用和机制并进一步确立SP1作为神经退行性疾病治疗的新靶点提供更充分的科学依据。 研究基础与工作条件研究基础与工作条件 突出与项目相关的工作积累突出与项目相关的工作积累1.研究基础研究基础 已取得的研究工作成绩及与本项目已取得的研究工作成绩及与本项目有关的研究工作积累有关的研究工作积累( (对于自由申请项目，着重对于自由申请项目，着重填写申请人近期的主要工作业绩；对于重点项目，填写申请人近期的主要工作业绩；对于重点项目，
12、请着重填写本课题组与本项目相关的研究工作积累请着重填写本课题组与本项目相关的研究工作积累和近五年的主要研究业绩和近五年的主要研究业绩) )2.工作条件工作条件 已具备的实验条件，尚缺少的实验已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径条件和拟解决的途径( (包括利用国家重点实验室包括利用国家重点实验室和部门开放实验室的计划与落实情况和部门开放实验室的计划与落实情况) )研究 基 础 在在国国家家自自然然科科学学基基金金(已已结结题题三三项项、正正进进行行一一项项)的的资资助助下下，近五年有如下工作积累和成绩：近五年有如下工作积累和成绩：1.SCI论论文文近近五五年年发发表表了了14篇篇SC
13、I论论文文；其其中中与与神神经经元元凋凋亡亡的的信信号号转转导导和和基基因因调调控控有有关关的的论论文文，作作为为第第一一作作者者的的有有2篇篇，作作为为通通讯讯作作者者的的有有4篇篇(见后见后)，作为共同作者的有，作为共同作者的有8篇篇。 2.Bim转录机制的前期工作转录机制的前期工作我们首次报道了神经元凋亡时我们首次报道了神经元凋亡时JNK/c-Jun不参与不参与bim的上调的上调1，随后，我们又以可靠的证据揭示了，随后，我们又以可靠的证据揭示了PI3K/Akt/FKHRL1也不介导也不介导bim的上调的上调(未发表资料未发表资料)。这些研究工作改变了以往。这些研究工作改变了以往的观点的观
14、点,也是本项目重要的立项依据之一。也是本项目重要的立项依据之一。3.Bim启启动动子子核核心心区区确确立立启启动动子子5末末端端序序列列续续减减分分析析确确立立了了诱诱导导Bim表表达达的的启启动动子子核核心心区区，并并发发现现一一个个典典型型的的转转录录因因子子SP1结结合合序序列列位位于于其其中中。进进一一步步实实验验显显示示：神神经经元元凋凋亡亡时时SP1被被激激活活；负负显显性性SP1突突变变体体和和SP1-DNA结结合合抑抑制制剂剂均均可可抑抑制制Bim的的上上调调。这这些些实实验验资资料料揭揭示示了了SP1介介导导bim转转录调控的新机制，也为本项目申请提供了最根本的实验依据。录调
15、控的新机制，也为本项目申请提供了最根本的实验依据。4.转转录录因因子子调调控控神神经经元元凋凋亡亡的的工工作作基基础础另另一一项项转转录录因因子子MEF2抗抗神神经经元元凋凋亡亡的的工工作作也也显显示示了了申申请请人人与与本本项项目目相相关关的的较较扎扎实实的的研研究究工工作作积积累累。本本人人首首次次报报道道(MingtaoLi,etal,JofNeurosci.2001,21:6544-6552)、随随后后被被他他人人证证实实(Shu-ichiOkamoto,etal,PNAS2002,99:3974-3979)，神神经经元元凋凋亡亡时时转转录录因因子子MEF2A和和MEF2D不不仅仅活活
16、性性降降低低和和失失去去抗抗凋凋亡亡作作用用，而而且且被被凋凋亡亡杀杀手手caspase剪剪切切，其其N-末末端端产产物物反反而而具具有有促促凋凋亡亡活活性性。这这一一MEF2调调控控凋凋亡亡机机制制的的发发现现，不不仅仅对对于于我我们们理理解解神神经经元元存存活活或或凋凋亡亡具具有有重重要要的的意意义义，而而且且也也为为神经系统的发育和分化的研究开拓了一条崭新的思路，具有创新性。神经系统的发育和分化的研究开拓了一条崭新的思路，具有创新性。5.信号转导的工作基础信号转导的工作基础较早的一项对较早的一项对cAMP/PKA抗神经元凋亡机制抗神经元凋亡机制的研究也反映了本人在神经元凋亡信号转导的研究
17、方面有较厚实的工作积累。的研究也反映了本人在神经元凋亡信号转导的研究方面有较厚实的工作积累。申请者首次发现促凋亡激酶申请者首次发现促凋亡激酶GSK-3 和和GSK-3是是PKA的天然底物；阐明的天然底物；阐明cAMP/PKA通过磷酸化并抑制通过磷酸化并抑制GSK-3发挥其促神经元存活的作用，此内容发挥其促神经元存活的作用，此内容发表在分子细胞生物学发表在分子细胞生物学(MingtaoLi,etal,MolCellBiol.2000,20:9356-9363)。6.JNK/c-Jun通路的工作基础通路的工作基础我们首次以我们首次以JNK/c-Jun为直接靶点、用为直接靶点、用小分子小分子JNK抑
18、制剂抑制剂(SP600125)治疗帕金森病动物，证实治疗帕金森病动物，证实JNK是有效的治疗靶是有效的治疗靶点。此工作发表后点。此工作发表后(NeuroscienceResearch,2004;48:195-202)，得到了国际同，得到了国际同行的认可。行的认可。SCI期刊期刊DrugNewsPerspectives邀请本人撰写了有关邀请本人撰写了有关“以以JNK为为靶点治疗帕金森病靶点治疗帕金森病”的专题综述的专题综述“JNKInhibitionasaPotentialStrategyinTreatingParkinsonsDisease”(DrugNewsPerspect.2004;17:
19、646-54)。SCI 文 章1.LeyuShi,ShoufangGong,ZhongminYuan,ChiMa,YanlingLiu,ChuanfuWang,WenmingLi,RongbiaoPi,ShoujianHuang,RuzhuChen,YifanHan,ZixuMao,andMingtaoLi(通讯作者).Activitydeprivation-dependentinductionoftheproapoptoticBH3-onlyproteinBimisindependentofJNK/c-Junactivationduringapoptosisincerebellargranu
20、leneurons.NeurosciLett.2005,375：712.2.WenyaWang,ChiMa,ZixuMaoandMingtaoLi.(通讯作者).JNKinhibitionasapotentialstrategyintreatingParkinsonssdisease.DrugNewsPerspect,2004,17(10):646-54.3.WenyaWang,LeyuShi,YuanbinXie,ChiMa,WenmingLi,XingwenSu,ShoujianHuang,RuzhuChen,ZhenyuZhu,ZixuMao,YifanHanandMingtaoLi.(
21、通讯作者).SP600125,anewJNKinhibitor,protectsdopaminergicneuronsintheMPTPmodelofParkinsonsdisease.NeurosciRes2004；48:195-2024.YuanbinXie,YanlingLiu,ChiMa,ZhongminYuan,WenyaWang,ZhenyuZhu,GuoquanGao,XianguoLiu,HengxinYuan,RuzhuChen,ShoujianHuang,XuelanWang,XiaonanZhu,XueminWang,ZixuMaoandMingtaoLi(通讯作者).I
22、ndirubin-3-oximeinhibitsc-JunNH2-terminalkinase:anti-apoptoticeffectincerebellargranuleneurons.NeurosciLett.2004,367:355-359.5.RongbiaoPi,WenmingLiNelsonT.K.Lee,HughH.N.Chan,YongmeiPu,LingNgaChan,NikolausJ.Sucher,DoanldC.Chang,MingtaoLiandYifanHan.Minocyclinepreventsglutamate-inducedapoptosisofcereb
23、ellargranuleneuronsbydifferentialregulationofp38andAktpathways.JNeurochem.2004,91:1212-1230.WenyaWang,ChiMa,ZixuMaoandMingtaoLi.(通讯作者).JNKinhibitionasapotentialstrategyintreatingParkinsonssdisease.DrugNewsPerspect,2004,17(10):646-54.6.WenmingLi,RongbiaoPi,HughH.N.Chan,HongjunFu,NelsonT.K.Lee,HingWai
24、Tsang,YongmeiPu,DonaldC.Chang,ChaoyingLi,JialieLuo,KemingXiong,ZhiwangLi,HongXue,PaulR.Carlier,YuanpingPang,KarlW.K.Tsim,MingtaoLiandYifanHan.NoveldimericAChEinhibitorBis(7)-tacrine,butnotDonepezil,preventsglutamate-inducedneuronalapoptosisbyblockingNMDAreceptors.JBiolChem.2005,280(18):18179-88.7.Xu
25、eminWang,XiaoliTang,MingtaoLi,JohnMarshall,ZixuMao.Regulationofneuroprotectiveactivityofmyocyteenhancerfactor2bycAMP-PKAsignalingpathwayinneuronalsurvival.JBiolChem.2005,280(17):16705-13.8.MarcusWiedmann,XueminWang,X.iaoliTang,MingtaoLi,ZixuMao.PI3K/Akt-dependentregulationofthetranscriptionfactormyo
26、cyteenhancerfactor-2ininsulin-likegrowthfactor-1-andmembranedepolarization-mediatedsurvivalofcerebellargranuleneurons.JNeurosciRes.2005200581(2):226-234.9.9.MingtaoLi，XiaominWang，MaryKayMeintzer，TraceyLaessig，MorrisJ.BirnbaumandKimA.Heidenreich.CyclicAMPpromotesneuronalsurvivalbyphosphorylationofgly
27、cogensynthasekinase3.MolCellBiol.2000,20（24）：9356-9363.10.10.MingtaoLi，DanielA.Linsenman，MelissaP.Allen，MaryKayMeintzer，XiaominWang，TraceyLaessig，MargaretE.Wierman&KimA.Heidenreich.MEF2AandMEF2Dundergophosphorylationandcaspase-mediateddegradationduringapoptosisofratcerebellargranuleneurons.J.Neurosc
28、i.2001;21(17):6544-6552.11.11.DanielA.Linseman,ChristopherM.Bartley,ShoshonaS.Le,TraceyA.Laessig,RonJ.Bouchard,MaryKayMeintzer,MingtaoLiandKimA.Heidenreich.InactivationoftheMyocyteEnhancerFactor-2RepressorHistoneDeacetylase-5byEndogenousCa2/Calmodulin-dependentKinaseIIPromotesDepolarization-mediated
29、CerebellarGranuleNeuronSurvival.JBiolChem2003,278:4147241481.12.12.Jing-PingYun,Choong-TsekLiew,EngChingChew,Xiao-YuYin,PaulBoSanLai,YamHinFai,H.K.RichardLi,Mei-LinJin,Ming-XiaoDing,MingtaoLi,Han-LiangLin,andWanYeeLau.NuclearMatrixProteinExpressionsinHepatocytesofNormalandCirrhoticRatLiversUnderNorm
30、alandRegeneratingConditions.JCellBiochem.2004,91:12691279.13.HongweiYang,XiaodongHu,HongmeiZhang,WenjunXin,MingtaoLi,TongZhang,LijunZhouandXianguoLiu.RolesofCaMKII,PKA,andPKCintheinduction and mainternance of LTP of C-fiber-evoked field potentials in ratspinaldorsalhorn.JNeurophysiol.2004,91:1122-11
31、33.14.NengweiHu,HongmeiZhang,XiaodongHu,MingtaoLi,TongZhang,LijunZhouandXianguoLiu.ProteinSynthesisInhibitionBlockstheLate-PhaseLTPofC-FiberEvokedFieldPotentialsinRatSpinalDorsalHorn.JNeurophysiol,2003;89:2354-235915.JuanSun,MingtaoLi,JiahuaiHanandJunGu.SensitizationofdifferentiatedPC12cellstoapopto
32、sisbypresenilin-2ismediatedbyp38.Biochem.Biophy.Res.Commun.,2001,287:536-541.16.WeibinCai,JianfangMa,ChaoyangLi,ZhonghanYang,XiaYang,WeiLiu,ZuguoLiu,MingtaoLi,GuoquanGao.Enhancedanti-angiogeniceffectofadeletionmutantofplasminogenkringle5onneovascularization.JCellBiochem.2005Sep15;(inpress).17.MingYA
33、NG,Cun-youWAGN,FengZHOU,JingTAO,TaoLIU,Hai-yanWEI,WeiLIU,Ming-taoLi,Xian-songFENG.ProteomicAnalysisintheEarlyProcess of Pancreatic Regeneration in the Pancreatectomized Rat. ActaPharmacologicaSinica2005(inpress)工 作 条 件2001年回国，获得211基金180万元，组建了一流的分子、细胞生物学实验室。2002年，作为负责人获得一期985学科建设经费700万元，筹建了一流的蛋白质组学实验
34、室并正在主持开展蛋白质科学的前沿性工作。近三年，培养和汇聚了一支从事分子神经生物学和蛋白质组学研究的科研队伍。这些建设性工作为解决细胞信号转导、基因调控以及本项目的核心问题奠定了扎实的基础。 项目负责人黎明涛所在单位中山大学基础医学院药理教研室是211项目资助学科和国家重点学科。人才济济，科研装备精良。近三年，药理教研室获得学科建设资金3000万元，已购置大型仪器如质谱仪、激光共聚焦显微镜、超速离心机、流式细胞仪、高效液相和蛋白质分离纯化系统等。这是申请者视为非常可贵的研究工作环境。申请者简历申请者和项目组主要成员申请者和项目组主要成员 l学历l研究工作简历l近期已发表与本项目有关的文章目录l
35、获得学术奖励情况l在本项目中承担的任务。黎明涛黎明涛(LiMingtao)项目负责人，中山大学基础医学院药理教研室教授，博士生导师，中山医学院蛋白质组学实验室主任。于1984年、1989年和1996年分别获得医学学士、硕士和博士学位。主要研究领域是神经元凋亡的信号转导、基因调控和蛋白质组学。在美国DepartmentofPharmacology,UniversityofColoradoHealthSciencesCenter从事两年博士后研究（1999-2001），主攻凋亡的信号转导、基因调控和蛋白质组学。近五年发表了14篇SCI论文，其中：作为第一作者，在国际核心杂志Molecular an
36、d Cellular Biology(Impact Factor, 10.03)和 Journal ofNeuroscience(IF,8.4)发表了具有创新性的文章；作为通讯作者，最近在NeurosciRes(IF,2.4)和NeurosciLett（IF，2.2）等期刊上发表了开拓性的文章。近五年（19982004）作为第一主持人获得13项基金，包括：4项国家自然科学基金；5项省自然科学基金；3项市基金；1项教育部基金。发表的相关论文发表的相关论文1.LeyuShi,ShoufangGong,ZhongminYuan,ChiMa,YanlingLiu,ChuanfuWang,Wenming
37、Li,RongbiaoPi,ShoujianHuang,RuzhuChen,YifanHan,ZixuMao,andMingtaoLi(通讯作者).Activitydeprivation-dependentinductionoftheproapoptoticBH3-only protein Bim is independent of JNK/c-Jun activation during apoptosis incerebellargranuleneurons.NeurosciLett.2005,375:712. 2. 3. 皮荣标皮荣标(PiRongbiao)33岁，博士学位，讲师。2002
38、年毕业于中山大学，获神经药理学博士。同年赴香港科技大学生物化学系从事博士后研究，现在中山大学药学院任讲师。主要研究兴趣涉及神经保护药物的作用及其机制的研究。曾负责或参加包括国家自然科学基金等多项研究。已发表或待发表论著近20篇，其中SCI论文5篇。皮博士与本人合作达11年，有共同的研究趣向，作为共同作者发表多篇SCI论文。他掌握了本项目涉及的大部分实验方法和技术，尤其在腺病毒载体构建方面积累了经验（见文章）。主要负责腺病毒载体构建等工作。发表的相关论文发表的相关论文1.RongbiaoPi,WenmingLi,NelsonT.K.Lee,HughH.N.Chan,YongmeiPu,LingN
39、gaChan,NikolausJ.Sucher,DoanldC.Chang,MingtaoLiandYifanHan.Minocyclinepreventsglutamate-inducedapoptosisofcerebellargranuleneuronsbydifferentialregulationofp38andAktpathways.JNeurochem.2004,91:1212-1230.2.3.项目组主要成员经费申请表申请项目同行评议意见反馈信申请项目同行评议意见反馈信黎明涛先生：黎明涛先生：您好！您申请的项目经专家投票表决，同意资助。您好！您申请的项目经专家投票表决，同意资助
40、。关于你的项目的同行评议意见如下：1.本项目在小脑颗粒细胞撤钾的离体凋亡模型中，发现了一种直接调节Bim的新转录因子SP1，申请人试图采用腺病毒转染技术、基因突变以及分子生物学方法进一步论证SP1是直接调控bim基因的这一假说。立项具有前言性，申请人工作基础好，并与美国Emory大学、香港大学有长期的合作条件，完全能够完成本项课题。建议优先资助。2.本项课题的立项依据较为充分，具有一定的学术创新及科学意义。研究内容明确、技术路线清晰、研究方法和方案可行。申请者有较高的学术水平，以及多次主持国家自然科学基金课题的经验。同时，申请者所在单位又有比较好的实验室及条件。建议给予资助。3.课题研究具有较
41、好的工作基础，研究具有较高的学术价值，建议资助。4.同意资助。理由：该项目立论依据充分，其重要的意义表现在澄清撤钾诱导神经元凋亡时，Bim上调的细胞内信号转导机制。申请者有较好的研究基础和研究能力，项目的内容设置合适，重点突出，总体方案合理，技术路线可行，可资助。5.Thisisanicelywritenproposalwithaclearaimandpracticalapproaches.Further,thegrouphaspublishedresultsrelatedtothecurrentproposal,indicatingtheabilityofthegrouptoperformt
42、heexperiments.获得资助的决定因素l工作基础好l学术创新性及学术价值l立项依据充分l研究内容明确l技术路线清晰l重点突出、方案合理l国际合作祝大家新年快乐！ 在新的一年获得更多基金！基金答辩基金答辩l充满自信、激情l仪表和体语l特点：专家心理？按提前结束做准备！l准备充分幻灯小道具l口头表达准确性、情感性、可信性和简明性l开门见山、突出主题做什么？为什么？怎样做？l突出特色和创新帕金森病治疗的新靶点及靛玉红帕金森病治疗的新靶点及靛玉红衍生物的研究与开发衍生物的研究与开发黎明涛中山大学基础医学院中山大学基础医学院立论依据现现状：状：1.发病情况：发病情况：世界性；中国世界性；中国10
43、0万；美国万；美国100万万2.病理特征：病理特征：黑质多巴胺神经元凋亡黑质多巴胺神经元凋亡纹状体多巴胺含量纹状体多巴胺含量3.治疗现状：治疗现状：左旋多巴左旋多巴对症治疗：疗效不理想、安全性受对症治疗：疗效不理想、安全性受到质疑到质疑以JNK为新靶点治疗PD2002年省重点项目（15万元）资助MLK JNK SP600125SP600125 c-Jun 凋亡以以JNK为靶治疗为靶治疗PD1. 1. 保护多巴胺能神经元保护多巴胺能神经元2. 2. 改善行为学指标改善行为学指标3. 3. 提高黑质多巴胺浓度提高黑质多巴胺浓度结题情况结题情况1.四篇SCI文章，通讯作者2.人才培养：1名博士2名硕
44、士以JNK/CDK5/GSK3为靶治疗PDJNKNeurosciRes2004,48:195-202DrugNewsPerspect.200417(10):646-54GSK3MingtaoLi,etal,unpublisheddataCDK5PNASUSA2003,100(23):13650-5抑制JNK/CDK5/GSK3的方案1.三种抑制剂联合2.一种抑制剂，“一石三鸟”Indirubin-3-oxime（靛玉红衍生物）是CDK5、GSK-3的抑制剂l Nat Cell Biol. 1999 1(1):60-7l J Biol Chem. 2001, 5;276(1):251-60靛玉红
45、直接抑制JNK活性靛玉红直接抑制靛玉红直接抑制JNK,保护神经元保护神经元Indirubin-3-oximeinhibitedMPP+-inducedapoptosisinculturedIndirubin-3-oximeinhibitedMPP+-inducedapoptosisincultureddopaminerbicneurons.dopaminerbicneurons.(a)control,(redforTH-positiveneurons),(b)10(a)control,(redforTH-positiveneurons),(b)10MMMPP+decreasedTH-posit
46、ivecellsandreducedcytoplasmicvolume;indirubin-MPP+decreasedTH-positivecellsandreducedcytoplasmicvolume;indirubin-3-oxime33-oxime3M(c)and5M(c)and5M(d)rescuedTH-positivecellsM(d)rescuedTH-positivecellsIndirubin-3-oximepreventedlossofdopamineneuronsafterMPTPadministration.(a)vehicletreated(control);(b)
47、MPTPtreated;MPTPalongwithIndirubin-3-oxime5mg/kg(c);10mg/kg(d)and30mg/kg(e).NoteIndirubin-3-oximerescuedthedopaminergicneuronslossinadose-dependentmanner(c-e).研究目标研究目标以JNK/CDK5/GSK3为明确靶点，以靛玉红衍生物为抑制剂,研发出一类毒性小、特异性高、作用强的治疗PD的新药物研究内容研究内容1.筛选对JNK具有特异性抑制作用的靛玉红衍生物(11个）2.筛选对黑质多巴胺神经元凋亡具有保护性干预作用的靛玉红衍生物（8个）3.筛
48、选对PD具有治疗作用的衍生物（4个）4.药理、毒理研究研究基础研究基础1.首次证实JNK是治疗PD的有效靶点2.证实GSK-3是治疗PD的靶点之一3.发现靛玉红衍生物能够抑制JNK，对PD具有治疗作用4.15篇相关SCI文章发表文章补充1.WiedmannM,WangX,TangX,HanM,LiM,MaoZ.JNeurosciRes.2005Jun1Epubaheadofprint2.WangX,TangX,LiM,MarshallJ,MaoZ.JBiolChem.2005,280(17):16705-13.3.LiW,PiR,ChanHH,FuH,LeeNT,TsangHW,PuY,Cha
49、ngDC,LiC,LuoJ,XiongK,LiZ,XueH,CarlierPR,PangY,TsimKW,LiM,HanY.JBiolChem.2005,280(18):18179-88.创 新 点1.首次证实JNK是治疗PD的有效靶点2.证实GSK-3是治疗PD的靶点之一3.发现靛玉红能够抑制JNK，对PD具有治疗作用4.JNK/CDK5/GSK-3为靶治疗PD5.用一种化合物抑制JNK/CDK5/GSK-3我们对完成此项目充满信心！谢 谢！Fig.6MithramycinA,aSP1-DNAbindinginhibitor,attenuatesbimupreguationbyactivit
50、ydeprivationinCGNs.(A)MithramycinAattenuatestheupregulationofBimELinducedbyactivitydeprivationinadosedependentmanner.CGNswereplacedin25Kor5KmediaintheabsenceorpresenceofmithramycinAattheindicatedconcentrationsfor6h.BimELexpressionwasassessedbyWesternblotasdescribedinFig.1(A).Resultsshownarerepresent
51、ativeoffourseparateexperiments.(B)MithramycinAinhibitstheincreaseinbimmRNAlevelinadose-dependentmanner.Neuronsweretreatedasdescribedin(A),bimandactinmRNAsweredeterminedbyRT-PCR,Resultsshownarerepresentativeoffiveseparateexperiments.(C)MithramycinAsuppressestheactivationofbimpromoterinducedbyactivity
52、deprivation.Neuronswereco-transfectedwithbim-LucandpEF-RLfor8hr.LuciferaseactivitiesweremeasuredasdescribedinFig.2,Theexperimentswererepeatedthreetimeswithduplicatesforeachtreatment.ThedatarepresentS.E.M.ofthreeexperiments.参 考 文 献1.LeyuShi,ShoufangGong,ZhongminYuan,ChiMa,YanlingLiu,ChuanfuWang,Wenmi
53、ngLi,RongbiaoPi,ShoujianHuang,RuzhuChen,YifanHan,ZixuMao,andMingtaoLi.Activitydeprivation-dependentinductionoftheproapoptoticBH3-onlyproteinBimisindependentofJNK/c-Junactivationduringapoptosisincerebellargranuleneurons.NeurosciLett.2005,375：712.2.WenyaWang,LeyuShi,YuanbinXie,ChiMa,WenmingLi,XingwenS
54、u,ShoujianHuang,RuzhuChen,ZhenyuZhu,ZixuMao,YifanHanandMingtaoLi.SP600125,anewJNKinhibitor,protectsdopaminergicneuronsintheMPTPmodelofParkinsonsdisease.NeurosciRes2004；48:195-202实事求是、追求真理的人文精神Dr.JonathanHam以撤NGF的交感神经元为模型观察到JNK/c-Jun10和PI3K/Akt/FKHRL1通路参与Bim的上调12，而我们以撤钾处理CGNs为模型观察到，这两条通路不参与Bim的上调。显然，
55、我们的研究结果不支持Dr.Ham的结论。但是，Dr.Ham读了我们的文章初稿之后，在提出中肯意见的同时，称我们的实验结果非常清楚并对我们的上述结论表示认同(OverallyourresultsareclearandsuggestthatalteringtheKClconcentrationinCGNsinducesthebimpromoterbyamechanismthatdoesnotinvolveJNK/c-JunorFOXOfactors)。Dr.Ham这种严谨的科学态度令人钦佩，值得学习（尊敬的评审专家，如有必要，本人可以将Dr.Ham的Email原件转发给您）。 工作基础工作基础 ：
56、本项目是在原工作基础上的继续和深入。近五年，本人共发表了12篇SCI论文，其中作为第一作者两篇；通讯作者四篇（见工作基础）。研究方向主要集中在神经元凋亡的信号转导和基因调控。本课题组在研究JNK/c-Jun通路靶基因时,发现“促凋亡蛋白bim上调不依赖JNK/c-Jun”。我们首次报道了神经元凋亡时JNK/c-Jun不参与bim的上调1，随后，我们又以可靠的证据揭示了PI3K/Akt/ FKHRL1也不介导bim的上调(未发表资料)。最近，对bim的调控研究又取得了突 破性的进展，即发现了SP1调控bim的转录机制(见立项依据)。这些研究工作改变了以往的观点,也是本项目重要的立项依据之一。因此
57、，我们具有完成本项目的切实可行的、扎实的前期工作基础。课 题 组 成 员交流与合作交流与合作：我们与国际同行建立了良好的交流渠道， 与毛子旭(ZixuMao,AssociateProfessor，BrownUniversity， 现在EmoryUniversity)、韩怡凡(YifanHan,AssociateProfessor，HongKongUniversityofScienceandTechnology)一直保持密切合作关系，我们已经共同发表了多篇SCI论文（见工作基础中的参考文献），在人员、信息、试剂和载体等多方面真正做到了互通和互惠。本人将此视为完成本项目的宝贵条件之一。负显性负显性
58、SP1SP1腺病毒腺病毒(Ad-dnSP1)(Ad-dnSP1)载体载体的构建、扩增、纯化和保存的构建、扩增、纯化和保存 为了达到在mRNA和蛋白质水平（而不仅仅是人工的报道基因水平）观察dnSP1是否能够抑制撤钾诱导bim基因的上调的目的，必须保证dnSP1导入CGNs有较高的导入率。现有质粒转染CGNs方法的转染率只能达到0.1-1.0%，而在方法得当的情况下（见后）腺病毒的感染率可达7080%1。因此，dnSP1的腺病毒载体Ad-dnSP1的构建是采用RTPCR和Westernblot分析bim的mRNA和蛋白质的前提。 。腺病毒的扩增和纯化按本人报道的进行1。腺病毒的活性高低是决定能否对CGNs达到7080感染率的关键，而正确的腺病毒保存条件又是其活性高低的决定因素。我们曾经研究过储存条件对腺病毒感染CGNs的影响，并制定了腺病毒的最佳储存条件，即小量分装后置于20C/20%甘油或80C/50%甘油，一月内可保证感染率在70-80%。
