《医学生化与分子生物学技术课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《医学生化与分子生物学技术课件（61页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、分子生物学实验技术总体设计时间：周二 8：3010:00地点：309室内容：讲授： 1.重组DNA的实验方案 2.相关概念 3.目的基因的获得cDNA mRNA 提取、PCR(酶切位点） 实验：上午 1.mRNA 提取 2. PCR 下午 3. 电泳(分组操作） 医学生化与分子生物学技术时间：周三 地点：309室实验：上午 1.PCR产物纯化回收（分组操作） 2.酶切（分组操作） 3.电泳 4.切胶回收 下午 1.连接 2.转化（分组操作）医学生化与分子生物学技术时间：周四 地点：309室实验：下午：质粒提取（分组操作） 酶切电泳（略） 医学生化与分子生物学技术主要知识点：基因重组的概念及过程
2、；用于重组DNA技术的理想载体应该具备的特点；获得目的基因的途径；真核表达体系的优点；常用真核细胞转染方法的种类；RT-PCR的基本实验步骤（包括PCR）；限制性内切酶的特点医学生化与分子生物学技术重组重组DNA技术技术 Recombinant DNA Technology医学生化与分子生物学技术 重组重组DNA技术相关概念技术相关概念 克隆克隆(clone):来自同一始祖的相同副本来自同一始祖的相同副本或或 拷贝的集合。拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)， 即即无性繁殖无性繁殖。 DNA克隆克隆医学生化与分子生物学技术 技术水平：技术水平：
3、 分子克隆分子克隆(molecular clone)即即DNA 克克隆隆 细胞克隆细胞克隆 个体克隆（动物或植物）个体克隆（动物或植物）医学生化与分子生物学技术DNA克隆克隆应应用用酶酶学学的的方方法法，在在体体外外将将各各种种来来源源的的遗遗传传物物质质（同同源源的的或或异异源源的的、原原核核的的或或真真核核的的、天天然然的的或或人人工工的的DNA）与与载载体体DNA接接合合成成一一具具有有自自我我复复制制能能力力的的DNA分分子子复复制制子子(replicon)，继继而而通通过过转转化化或或转转染染宿宿主主细细胞胞，筛筛选选出出含含有有目目的的基基因因的的转转化化子子细细胞胞，再再进进行行
4、扩扩增增提提取取获获得得大大量量同同一一DNA分分 子子 ， 也也 称称 基基 因因 克克 隆隆 或或 重重 组组 DNA (recombinant DNA) 。 医学生化与分子生物学技术目的目的 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程基因工程(genetic engineering) 实现实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程基因工程，又称重组又称重组DNA工艺学。工艺学。医学生化与分子生物学技术重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒
5、质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNAcDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基因目的基因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交目目 录录鉴定（测序）鉴定（测序）医学生化与分子生物学技术 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程目目 录录医学生化与分子生物学技术载载 体体定义：定义： 能够携带外源基因并且具有自主复制能力的能够携带外源基因并且具有自主复制能
6、力的DNA,是将目的是将目的DNA导入受体细胞的工具。导入受体细胞的工具。在重组在重组DNA技术中，常用基因载体有两种类型：技术中，常用基因载体有两种类型：克隆载体克隆载体表达载体表达载体医学生化与分子生物学技术载体的特点载体的特点具有自主复制能力，保证重组具有自主复制能力，保证重组DNA分子可以在宿主细胞分子可以在宿主细胞内得到扩增；内得到扩增；具有较多的拷贝数，易与宿主细胞的染色体具有较多的拷贝数，易与宿主细胞的染色体DNA分开，分开，便于分离提纯；便于分离提纯；具有一个或多个筛选标记（如对抗生素的抗性、营养缺具有一个或多个筛选标记（如对抗生素的抗性、营养缺陷型或显色表型反应等），便于重组
7、体的筛选和鉴定；陷型或显色表型反应等），便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点，便于目的基因的克隆；位点，称为多克隆位点，便于目的基因的克隆；分子量相对较小，易于操作，以容纳较大的外源分子量相对较小，易于操作，以容纳较大的外源DNA；具有较高的遗传稳定性；具有较高的遗传稳定性；使用安全。使用安全。医学生化与分子生物学技术载体种类载体种类 1. 质粒质粒(plasmid) 2. 噬菌体噬菌体(phage) 3. 柯斯质粒柯斯质粒/粘粒粘粒 （cosmid） 4. 人工染色体：人工染色体： 细菌人工
8、染色体细菌人工染色体 （bacterial artificial chromosome,BAC） 酵母人工染色体酵母人工染色体 （yeast artificial chromosome,YAC） 哺乳动物人工染色体（哺乳动物人工染色体（mammalian artificial chromosome,MAC） 5. 动物病毒动物病毒DNA改造的载体改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）医学生化与分子生物学技术质粒质粒 (plasmid)特点特点 能能在在宿宿主主细细胞胞内内独独立立自自主主复复制制；带带有有某某些些遗传信息遗传信息, , 会赋
9、予宿主细胞一些遗传性状。会赋予宿主细胞一些遗传性状。 细细菌菌中中独独立立于于染染色色体体外外的的双双链链闭环闭环DNA分子。分子。医学生化与分子生物学技术医学生化与分子生物学技术医学生化与分子生物学技术医学生化与分子生物学技术目的基因的获取1. 化学合成法：已知目的基因的核苷酸序列或其化学合成法：已知目的基因的核苷酸序列或其 产物的氨基酸序列产物的氨基酸序列 。2.基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library)3. cDNA文库文库(cDNA library)4. 聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)5.从已有重组载体
10、中获得从已有重组载体中获得医学生化与分子生物学技术mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制* 从从cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 逆转录酶逆转录酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T目目 录录医学生化与分子生物学技术 聚聚 合合 酶酶 链链 反反 应应 Polymerase Chain Reaction 以拟扩增的以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与分子为模板，以一对分别与模板模板5末端和末端和3 末端相互补的寡核苷酸片
11、段为引末端相互补的寡核苷酸片段为引物，在物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这合成，重复这一过程，即可使目的一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。这一过程片段得到扩增。这一过程成为成为PCR。医学生化与分子生物学技术n 模板模板DNAn 特异性引物特异性引物n 耐热耐热DNA聚合酶（聚合酶（Taq 酶）酶）n dNTPsn Mg2+ PCR体系基本组成成分体系基本组成成分医学生化与分子生物学技术PCR的基本反应步骤的基本反应步骤1.变性：将反应系统加热至变性：将反应系统加热至95
12、 ，使模板，使模板DNA 完全变性成为单链；完全变性成为单链；2.退火：将温度下降至退火：将温度下降至50左右，使引物与模板左右，使引物与模板 DNA退火结合；退火结合；3. 延伸：将温度升至延伸：将温度升至72 ，DNA聚合酶以聚合酶以dNTPs 为底物催化为底物催化DNA的合成反应。的合成反应。 上述三个步骤为一个循环，经上述三个步骤为一个循环，经2530次循环后，次循环后，可将模板可将模板DNA扩增达百万倍。扩增达百万倍。医学生化与分子生物学技术 PCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性95C延伸延伸72C退火退火50C医学生化与分子生物学技术5 Primer 15 Primer 2C
13、ycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 一、基本工作原理一、基本工作原理目目 录录医学生化与分子生物学技术Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。目目 录录Cycle 3医学生化与分子生物学技术重组DNA技术的基本过程及技术路线分-获取目的基因切-限制性内切酶接-连接目的基因及载体转-重组子转入宿主细胞筛-筛选出含有重组子的宿主细胞医学生化与分子生物学技术 mRNA 提取提取cDNAPCR琼脂糖
14、电泳琼脂糖电泳RT-PCR医学生化与分子生物学技术 凝胶中回收凝胶中回收PCR产物产物目的目的DNA与载体双酶切与载体双酶切DNA与载体的连接与载体的连接转化转化医学生化与分子生物学技术 质粒的提取质粒的提取酶切鉴定酶切鉴定测测 序序表表 达达医学生化与分子生物学技术以构建以构建pBSK-Akt1-WT重组体为例重组体为例 一、PCR扩增得到Akt1/PKB的cDNA 设计基因特异性引物设计基因特异性引物a、b，以克隆在质粒，以克隆在质粒pCIS2-Akt1上的上的Akt/PKB cDNA为模板为模板5 5 端引入端引入Hind酶切位点，酶切位点，33引入引入BamHI酶切位点，以酶切位点，以
15、a、b为引物，扩增野生型为引物，扩增野生型Akt1/ PKB。 医学生化与分子生物学技术引物a(划线部分为Hind酶切位点)：5-GCGAAGCTTCCATGAACGACGTAGCCATTGT-3引物b(划线部分为BamHI 酶切位点)： 5-ATTGGATCCTCAGGCTGTGCCACTGGCTGAG-3医学生化与分子生物学技术PCR产物末端限制酶切位点的切断情况产物末端限制酶切位点的切断情况医学生化与分子生物学技术10PCR反应缓冲液 5.0 l dNTP mix(2mmol/L) 4.0 l Ex Taq DNA聚合酶(5U/l ) 0.25 l 引物 a (10pmol/l ) 2.
16、0 l 引物 b (10pmol/l ) 2.0 l pCIS2-Akt1 5ng加水至 50 l 应用应用TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶，聚合酶，反应体系为反应体系为50 l 94预变性1min，然后按照94 30sec，63 45sec，72 1min，进行29个循环，最后72延伸10min 。医学生化与分子生物学技术 电泳检测 PCR结果医学生化与分子生物学技术 PCR产物的回收和鉴定产物的回收和鉴定 将上述PCR产物全部电泳，然后按照TaKaRa DNA凝胶回收试剂盒的说明书回收PCR产物。 医学生化与分子生物学技术医学生化与分子生物学技术 电泳检测回收的电泳检测回收的PCR
17、产物产物医学生化与分子生物学技术二、二、PCR产物和表达载体的限制性内切酶酶切产物和表达载体的限制性内切酶酶切1、酶切体系的组成及注意事项酶切体系的组成及注意事项 内切酶内切酶：根据实验的目的选择限制性内切酶。对于基因克隆，选择粘性末端可提高连接效率。DNA：DNA应该具备一定的纯度，其溶液中不能含有过量的酚、氯仿、乙醚、大于10mmol/L的EDTA、SDS以及过量的盐离子浓度，以免影响限制性内切酶的活性。 反应缓冲液反应缓冲液：每一种限制酶都有其一系列最佳反应条件，甚至来源于不同厂家的同一种限制酶的反应缓冲液也不尽相同，应该严格遵照产品说明书进行操作。 医学生化与分子生物学技术2 2、限制
18、酶操作时应注意的原则：限制酶操作时应注意的原则：限制性内切酶从冰箱中取出后，应置于冰中。一般总是在其它试剂加完后，再加入内切酶。必须使用新的灭菌吸管，1个吸管不能反复使用，更不可交叉使用。内切酶的容积不能超过反应总容积的10，否则使甘油终浓度达到5将会抑制酶在该体系中的活性。酶应分装成小份。当切割大量DNA时，通常用延长反应时间来减少酶的用量。同一种内切酶消化多个DNA样品时，应计算所需酶的总量，再将酶稀释液分配到各个反应管中，以减少酶液储存管的污染机会。 医学生化与分子生物学技术PCR产物(或pBluescript II/SK) 12l10Y+/Tanqo（with BSA） 2lHind(
19、10U/ l ) 1.5lBamHI (10U/l ) 1.5l补水至 20l医学生化与分子生物学技术三、三、PCR产物与载体的连接产物与载体的连接 建立连接反应时注意建立连接反应时注意：1 1、温度。、温度。粘性末端的连接一般在16进行，以保证粘性末端退火及酶活性、反应速率之间的平衡。2 2、酶量。、酶量。 3 3、DNA量量。载体与目的DNA的分子数比例一般为1:3。医学生化与分子生物学技术四、重组体导入受体细胞四、重组体导入受体细胞 受体菌条件受体菌条件安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷处于感受态处于感受态(competent) 导入方式导入方式转化转化 (tra
20、nsformation)转染转染 (transfection)感染感染 (infection)医学生化与分子生物学技术在重组在重组DNA技术中技术中转化：将质粒转化：将质粒DNA或以它为载体构建的重或以它为载体构建的重 组子导入细菌的过程。组子导入细菌的过程。转染：病毒及其重组子导入真核受体细胞转染：病毒及其重组子导入真核受体细胞转导：噬菌体及其重组子导入受体细胞转导：噬菌体及其重组子导入受体细胞医学生化与分子生物学技术真核细胞转染的方法脂质体法磷酸钙法电穿孔法DEAE葡聚糖法显微注射法医学生化与分子生物学技术转化步骤转化步骤：将60l E. coli JM109感受态细菌 置于冰上溶化；加入
21、2 l重组体；冰上放置30分钟， 42水浴90 秒，迅速放入冰中骤冷3分钟；加LB培养基至1ml ，轻轻摇荡，37振荡培养1.5h，使得细菌恢复正常并让氨苄青霉素抗性基因表达。医学生化与分子生物学技术 五、重组体的筛选与鉴定五、重组体的筛选与鉴定 直接选择法直接选择法: (1) 抗药性标记选择：抗药性标记选择： (2) 标志补救：如蓝白筛选标志补救：如蓝白筛选 (3) 分子杂交法：分子杂交法： 原位杂交原位杂交 Southern印迹印迹 免疫学方法：利用特异抗体与目的基因表达产物相互免疫学方法：利用特异抗体与目的基因表达产物相互作用进行筛选。作用进行筛选。 如免疫化学方法及酶免检测分析等如免疫
22、化学方法及酶免检测分析等医学生化与分子生物学技术1、筛选阳性菌落并扩大培养：、筛选阳性菌落并扩大培养： 取150 l转化后的液体涂布于Amp + 的琼脂平板培养基中，37 培养过夜。挑取单菌落于Amp + LB 培养基中，37振荡培养过夜。 医学生化与分子生物学技术试剂：试剂：溶液I : 50mmol/L葡萄糖;25mmol/L Tris-HCl(pH8.0); 10mmol/L EDTA溶液II: 0.2mmol/L NaOH;1% SDS(此溶液必须新鲜配制)溶液III: 5mol/L KAc 60ml;冰醋酸 11.5ml;水 28.5ml。配制 好的溶液III含3mmol/L钾盐、5m
23、ol/L 醋酸(pH4.8)酚氯仿乙醇TERNase医学生化与分子生物学技术步骤：步骤：取11.5ml细菌培养液移至Ep管中， 12000g ，4离心 1分钟，弃上清；将细菌沉淀悬浮于100 l冰预冷的溶液I 中，强烈振荡沉淀；加入200 l溶液II，盖严管盖颠倒微型离心管5次以混合内容物，不要强烈振荡，放置冰上510分钟左右；加入150l溶液III，可以将管盖朝下温和振荡10秒钟，冰上放置35分钟；医学生化与分子生物学技术4，12000g离心，5-10min，取上清移至另一Ep管中；加入等体积的酚/氯仿抽提，振荡混匀，4，12000g离心2min，取上清移至另一Ep管中；用2倍体积的乙醇，振
24、荡混匀，室温放置2分钟；12000g ，4离心5分钟；弃上清，加入1ml 70(4)乙醇振荡漂洗沉淀， 12000g ，4离心2分钟；弃上清，将Ep管倒置放在滤纸上，室温干燥沉淀；用50 l含有无DNA酶的RNA酶(20g/ml)的TE重新溶解核酸，温和振荡几秒钟后可进行内切酶酶切实验或贮存于20医学生化与分子生物学技术3、重组质粒酶切鉴定、重组质粒酶切鉴定 重组质粒用Hind 和BamHI 双酶切，反应体系如下： 质粒DNA 5 l 10Y+/Tanqo（with BSA） 1 l BamHI (10U/ l) 0.5 l Hind(10U/ l) 0.5 l 加水至 10 l酶切反应结束后
25、，电泳检测酶切结果。医学生化与分子生物学技术DNA重组技术重组技术构建重组体构建重组体转化转化筛选筛选重组体的检测重组体的检测表达体系的选择表达体系的选择重组体的表达重组体的表达选择载体选择载体获得目的基因获得目的基因医学生化与分子生物学技术原核表达与真核表达体系 大肠杆菌是常用的原核表达体系，具有遗传背景清晰、成本低廉、表达水平高的优点。真核蛋白常具有翻译后修饰加工，比如糖基化、磷酸化、乙酰化、多聚化、二硫键形成等等。在原核表达体系中，不能完成这些翻译后修饰加工，常常使一些表达的真核蛋白没有活性，而真核表达系统具有翻译后修饰加工的能力，常可获得有活性的表达蛋白。医学生化与分子生物学技术实验一
26、、组织总RNA的提取试剂：RNAout、氯仿、异丙醇、75%乙醇、RNAse free水。步骤： 1.将组织样品剪碎； 2.按50100mg组织加1ml的RNAout，匀浆30秒； 3.按每1ml的RNAout加入0.2ml氯仿，涡旋震荡30秒；医学生化与分子生物学技术 4.离心13000转/分，3分钟； 5.取上清液（约0.6ml）转移入新的EP管；注意：取上清要避免吸入中间层，防止DNA或蛋白质污染。 6.上清液中加入等体积异丙醇，涡旋震荡30秒； 7.离心13000转/分，5分钟； 8.小心弃上清； 9.EP管中加入1ml的75%乙醇，震荡30秒； 10.13000转/分，离心1分钟；
27、11.小心弃上清；医学生化与分子生物学技术 12.重复911步一次； 13.短暂快速离心，吸弃残留乙醇；注意：尽量不要残留乙醇，会影响到RNA的使用。 14.室温放置12分钟，加入RNAse free水50ul溶解。注意：应使用无RNAse的水溶解RNA。 15.RNA的浓度与纯度测定。 OD260=1(40ug/ml) OD260/OD280=1.82.1医学生化与分子生物学技术实验二、RT-PCR1.试剂：通用型RT-PCR试剂盒。2.RT的反应体系（20ul）：溶液A（随机引物RP）1ul溶液B（dNTP）1ul溶液D（5*RT buffer）4ul溶液E（酶混合液）1ul提取的总RNA 1ul溶液G（DEPC水）12ul医学生化与分子生物学技术3.RT步骤： 混匀上述反应体系，42度60分。95度5分钟，4度15分钟。4.PCR反应体系（50ul）： RT反应产物 4ul 溶液F（10*PCR buffer）5ul 溶液B（dNTP）1ul 上游引物（10uM） 2ul 下游引物（10uM）2ul 【溶液H（阳性对照引物beta-actin）1ul】 溶液C（taq酶）1ul 溶液G（DEPC水）35ul医学生化与分子生物学技术5.PCR的步骤： 94度预变性1分钟 94度30秒 55度30秒 72度30秒 30个循环 72度5分钟医学生化与分子生物学技术
