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1、第七章 微生物的测定含在饮料的检测中一、分类n碳酸饮料(品)(汽水)类 n果汁(浆)及果汁饮料(品)类 n蔬菜汁及蔬菜汁饮料(品)类 n含乳饮料(品)类 n植物蛋白饮料(品)类 n瓶装饮用水类 n茶饮料(品)类 n固体饮料(品)类 n特殊用途饮料(品)类 n总酸度、pH值、还原糖含量n食品中微生物的检测n 细菌总数n 大肠菌群数n食品添加剂的检测n甜味剂糖精钠、甜蜜素、安赛蜜、阿斯巴甜。n防腐剂苯甲酸、山梨酸二、微生物检验n1、细菌总数n菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后所得1g或1ml检样中所含细菌菌落的总数。它可以反应食品的新鲜度、被细菌污染的程度、生产过程中食品是否变质和食
2、品生产的一般卫生状况等。因此它是判断食品卫生质量的重要依据之一。流程检检样样做做成成几几个个适适当当倍倍数数的的稀稀释释液液选选择择2-3个个适适宜宜稀稀释释度度各各以以1mL之之量量分分别别入入灭灭菌菌平平皿皿内内每每皿皿内内加加入入46适适量量营营养养琼琼脂脂菌菌落落数数报告报告（1）样品的无菌处理n以无菌操作，将检样以无菌操作，将检样25g（或（或25ml）剪碎）剪碎以后，放于含有以后，放于含有225ml灭菌生理盐水或其他灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预先置适当稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预先置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研
3、磨做成摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。的均匀稀释液。n 固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以质器中以8000r/min100000r/min的速度的速度处理处理1min，做成，做成1：10的均匀稀释液。的均匀稀释液。（2）稀释、接种用用1ml灭灭菌菌吸吸管管吸吸取取1：10稀稀释释液液1ml，沿沿管管壁壁徐徐徐徐注注入入含含有有9ml灭灭菌菌生生理理盐盐水水或或其其他他稀稀释释的的试试管管内内（注注意意吸吸管管尖尖端端不不要要触触及及管管内内稀稀释释液液，下下同同），振振摇摇试试管管混混合合均均匀匀，做做成成1：100的稀释液。的稀释液。琼脂培养基
4、配方n蛋白胨 10 g n牛肉膏 3 g n氯化钠 5g n琼脂 15-20g n蒸馏水 1000mln根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择选择23个适宜稀释度，分别在作个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1ml稀释液稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。n稀释液移入平皿后，应及时将凉至稀释液移入平皿后，应及时将凉至46营养琼脂营养琼脂培养基培养基可放置在（可放置在（461）0C）水浴锅内保温）水浴锅内保温注入平皿注入平皿15
5、ml，并转动平皿使混合均匀，同时将，并转动平皿使混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入加有营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。的灭菌平皿内作空白对照。n等琼脂凝固后，翻转平板，置（等琼脂凝固后，翻转平板，置（361）0C恒温箱恒温箱内培养（内培养（482）h取出，计算平板内菌落数目乘取出，计算平板内菌落数目乘以倍数，即得以倍数，即得1g（1mL）样品所含菌落总数。）样品所含菌落总数。菌落计数方法菌落计数方法n做平板菌落计数时，可用肉眼做平板菌落计数时，可用肉眼观查，必要时用放大镜检查，观查，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌以防遗漏。
6、在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。板平均菌落总数。n平板菌落数的选择平板菌落数的选择n 选取菌落数在选取菌落数在30300之间的之间的平板作为菌落总数测定标准。平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平板，应一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余的一半中菌落的一半，而其余的一半中
7、菌落分布又很均匀，即可计算半个分布又很均匀，即可计算半个平板后乘平板后乘2以代表全皿菌落数。以代表全皿菌落数。稀释度的选择稀释度的选择n应选择平均菌落数在应选择平均菌落数在30300之之间的稀释度，乘以稀释倍数报告间的稀释度，乘以稀释倍数报告之。若有两上稀释度，其生长的之。若有两上稀释度，其生长的菌落数均在菌落数均在30300之间，则视之间，则视两者之比如何来决定。若其比值两者之比如何来决定。若其比值小于或等于小于或等于2，应报告其平均数；，应报告其平均数；若大于若大于2则报告其中较小的数字。则报告其中较小的数字。n 若所有稀释度平均菌落数均大若所有稀释度平均菌落数均大于于300，则应按稀释度
8、最高的平，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。均菌落数乘以稀释倍数报告之。n 若所有稀释度的平均菌落数均若所有稀释度的平均菌落数均小于小于30，则应按稀释度最低的平，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。均菌落数乘以稀释倍数报告之。n 若所有稀释度均无菌落生长，若所有稀释度均无菌落生长，则以小于则以小于1乘以最低稀释倍数报告乘以最低稀释倍数报告之。之。简便方法：菌落总数测定纸使用方法2、大肠菌群的测定n大肠菌群是指在37、24h能发酵乳糖，产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰式阴性无芽孢杆菌。n大肠菌群数以每100ml（g）检样中大肠菌群最可能数（MPN）表示。流程n乳糖胆盐
9、发酵管变黄浑浊，培养基配方n乳糖胆盐发酵双料:n(1)蛋白胨 40gn(2)牛胆盐 10gn(3)乳糖 20gn(4)蒸馏水 1000mln(5)溴甲酚紫 （） 2ml n(6)PH值n乳糖发酵管n(1)蛋白胨 20gn(2)乳糖 10gn(3)蒸馏水 1000mln(4)溴甲酚紫 （） 1ml n(5)PH值伊红美蓝培养基：伊红美蓝培养基：n成分：n蛋白胨10gn乳糖10gn磷酸氢二钾2gn琼脂 17gn2伊红水溶液 20mln美蓝水溶液 13mln蒸馏水 1000mlnpH为n制法：n将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于热蒸馏水中，校正pH，分装于烧瓶内， 121高压灭菌15min备用。临用时加入
10、乳糖并加热溶化琼脂，冷至50-55，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。伊红美兰琼脂平板划线培养大肠菌群的典型菌落n（1）深紫黑色，具有金属光泽的菌落n（2）紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落n（3）淡紫红色、中心色较深的菌落。 革兰氏染色阴性菌纸片法MPN表nn 阴性管数 MpN 95可信限n100 mL(g) n1mL(g)，*30.1mL(g)*30.0lmL(g)*3 下限上限nn 0 0 0 30 5 n 0 0 1 30 n 0 0 2 30 90 n 0 0 3 30 nn 0 1 0 30 5 n 0 1 1 60 130 n 0 1 2 90 n 0 1 3 120 nn 续表
11、nn 阳性管数 MPN 95可信限n100mL(g)n1mL(g)3 0.l mL(g)x3 0.0lmL(g)X3 下限上限nn 0 2 0 60 n 0 2 1 90 n 0 2 2 120 n 0 2 3 160 nn 0 3 0 90 n 0 3 1 130 n 0 3 2 160 n 0 3 3 190 nn 1 0 0 40 5 200 n 1 0 1 70 10 210 n 1 0 2 110 n 1 0 3 150 nn 1 1 0 70 10 230 n 1 1 1 110 30 360 n 1 1 2 150 n 1 1 3 190 nn 1 2 0 110 30 360
12、n 1 2 1 150 n 1 2 2 200 n 1 2 3 240 nn 1 3 0 160 n 1 3 1 200 n 1 3 2 240 n 1 3 3 290 nn 2 0 0 90 10 360n 2 0 1 140 30 370 n 2 0 2 200 n 2 0 3 260 nn 2 1 0 150 30 440n 2 1 1 200 70 890n 2 1 2 270 n 2 1 3 34o n 革兰氏染色n革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是： 1）涂片固定。 2）草酸铵结晶紫染1分钟。 3）自来水冲洗。 4）加碘液覆盖涂面染1分钟。 5）水
13、洗，用吸水纸吸去水分。 6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30秒后水洗，吸去水分。 7）蕃红梁色液（稀）染10秒钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。 染色的结果，革兰氏正反应菌体都呈紫色，负反应菌体都呈红色。 分光光度计使用方法n2使用方法n（1）预热仪器 将选择开关置于“T”，打开电源开关，使仪器预热20分钟。为了防止光电管疲劳，不要连续光照，预热仪器时和不测定时应将试样室盖打开，使光路切断。n（2）选定波长 根据实验要求，转动波长手轮，调至所需要的单色波长。n（3）固定灵敏度档 使用时，调到“1”挡。n（4）调节T=0% 轻轻旋动“0%”旋钮，使数字显示为“00.0”，（此时试样室是打开
14、的）。n（5）调节T=100% 将盛蒸馏水（或空白溶液，或纯溶剂）的比色皿放入比色皿座架中的第一格内，并对准光路，把试样室盖子轻轻盖上，调节透过率“100%”旋钮，使数字显示正好为“100.0”。n（6）吸光度的测定 将选择开关置于“A”，盖上试样室盖子，将空白液置于光路中，调节吸光度调节旋钮，使数字显示为“.000”。将盛有待测溶液的比色皿放入比色皿座架中的其它格内，盖上试样室盖，轻轻拉动试样架拉手，使待测溶液进入光路，此时数字显示值即为该待测溶液的吸光度值。读数后，打开试样室盖，切断光路。n重复上述测定操作1-2次，读取相应的吸光度值，取平均值。n（8）关机 实验完毕，切断电源，将比色皿取出洗净，并将比色皿座架用软纸擦净。n3注意事项n（1）为了防止光电管疲劳，不测定时必须将试样室盖打开，使光路切断，以延长光电管的使用寿命。n（2）取拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，而不能碰比色皿的光学表面。n（3）比色皿不能用碱溶液或氧化性强的洗涤液洗涤，也不能用毛刷清洗。比色皿外壁附着的水或溶液应用擦镜纸或细而软的吸水纸吸干，不要擦拭，以免损伤它的光学表面。
