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1、碱裂解法小量制备质粒王欢欢二零一二.九质粒 PLASMID 质粒粒结构非常构非常简单，只能在寄主，只能在寄主细胞内独立增殖。胞内独立增殖。 质粒是粒是细胞内的一种胞内的一种环状的小分子状的小分子DNA，是，是进行行DNA重重组的常用的常用载体。作体。作为一个具有自身复制起点的复制一个具有自身复制起点的复制单位独立于位独立于细胞的主染色体胞的主染色体之外，之外，质粒粒DNA上携上携带了部分的基因信息，了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主基因表达后使其宿主细胞表胞表现相相应的性状。的性状。 F质粒：粒：F因子。使寄主染色体上的基因与其一起因子。使寄主染色体上的基因与其一起转移到受体移到受体细胞
2、胞 R质粒：抗粒：抗药性因子，性因子，编码一种或多种抗菌素抗性基因一种或多种抗菌素抗性基因 Col质粒：粒：编码有控制大有控制大肠杆菌素合成的基因杆菌素合成的基因 天然天然质粒的大小在粒的大小在1200kb不等，但用作不等，但用作载体的体的质粒通常很小，粒通常很小，一般一般为210kb，均以天然，均以天然质粒粒为基基础，经过人工改造构建而成。人工改造构建而成。大肠杆菌质粒分子结构环形染色体形染色体DNA质粒粒Plasmid控制控制质粒粒DNA转移的基因移的基因细菌染色体外能菌染色体外能够自我复制的自我复制的环形双形双链的的DNA分子分子抗菌素抗性基因抗菌素抗性基因专用质粒载体在天然在天然质粒的
3、基粒的基础上，上，进行人工改造和构建的行人工改造和构建的质粒粒载体，具有各种不体，具有各种不同的功能特性。同的功能特性。不同的不同的质粒粒DNA的分子量差异的分子量差异显著，可相差数百倍，有的适于用作基著，可相差数百倍，有的适于用作基因克隆因克隆载体，有的体，有的则不适用。不适用。低拷低拷贝质粒：粒：13份拷份拷贝，“严紧型型”stringent plasmid高拷高拷贝质粒：粒：1060份拷份拷贝“松弛型松弛型”relaxed plasmid质粒粒载体体 必必须具具备的条件：的条件：u具有复制起点具有复制起点u具有抗菌素抗性基因具有抗菌素抗性基因u具有若干限制具有若干限制酶单一一识别位点位点
4、u具有具有较小的分子量和小的分子量和较高的拷高的拷贝数数质粒构型从从细胞中分离胞中分离质粒粒DNA时，质粒粒DNA通通常会呈常会呈现超螺旋构型（超螺旋构型（SC构型），另外构型），另外也会有开也会有开环DNA的存在（的存在（OC构型构型)。在。在琼脂糖凝胶脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种泳中，不同构型的同一种质粒粒DNA具有不同的具有不同的电泳迁移率，走在前沿泳迁移率，走在前沿的是的是SC构型，构型，OC构型位于凝胶的最后面，构型位于凝胶的最后面，经过限制性核酸内切限制性核酸内切酶切割切割质粒之后粒之后产生生的的L构型，其位置构型，其位置则介于介于SC和和OC构型之构型之间质粒粒DNA琼脂糖凝
5、胶脂糖凝胶电泳泳图A.从从细胞中分离的胞中分离的质粒粒DNAB.经限制性核酸内切限制性核酸内切酶切割后的切割后的线性性质粒粒DNA质粒DNA的分离与纯化应用用质粒作粒作为基因克隆的基因克隆的载体分子，重要条件是要体分子，重要条件是要获得批量的得批量的纯化化质粒粒DNA分子。分子。寄主寄主细胞的裂解是关胞的裂解是关键，细胞破裂能使胞破裂能使质粒粒DNA分离，但又不分离，但又不污染染过多多的染色体的染色体DNA。u氯化化铯密度梯度离心法密度梯度离心法u碱碱变性法性法u微量碱微量碱变性法性法 当当菌体在菌体在NaOH和和SDS溶液中裂解溶液中裂解时，蛋白，蛋白质与与DNA发生生变性，当性，当加入中和
6、液后，加入中和液后，质粒粒DNA分子能分子能够迅速复性，呈溶解状迅速复性，呈溶解状态，离心，离心时留在留在上清中；蛋白上清中；蛋白质与染色体与染色体DNA不不变性而呈絮状，离心性而呈絮状，离心时可沉淀下来。可沉淀下来。碱裂解法提取大肠杆菌质粒溶液溶液I悬浮浮-吸取1ml 菌液于Eppendorf 管中，12000 r/min 离心1min，弃尽上清。加入100l冰预冷的solution I，涡旋振荡30s 后置于冰上3min；溶液溶液II裂解裂解加入200l solution II，快速上下颠倒试管4-5 次（切勿振荡），置于冰上3-5 min；溶液溶液III沉淀沉淀DNA-加入150l 冰预
7、冷的solution III，上下小心颠倒5-6 次，置于冰上3-5 min；抽提抽提酚酚/氯仿仿/异戊醇异戊醇-12000 r/min 离心5 min。取上清（约450l），加入等体积的酚-氯仿-异戊醇（25:24:1），混匀；醇沉醇沉无水乙醇无水乙醇-12000 r/min 离心10 min。取上清（约400l），加入2 倍体积冰预冷的无水乙醇，-20C 静置2h 或O/N；漂洗漂洗70%乙醇乙醇-12000 r/min 离心5min，去上清，沉淀用400l 冰预冷70%乙醇洗2-3 次，吹干沉淀；溶水溶水RNA酶-加入30l 含0.5U RNA酶 的ddH2O 溶解沉淀，37C 静置30
8、min，-20C 保存。注意要点影响影响质粒粒DNA产量的量的因素：因素：寄主菌株的寄主菌株的遗传背景：使用背景：使用endA基因突基因突变的大的大肠杆菌寄生菌株，杆菌寄生菌株，使其失去了合成具有功能活性的核酸内切使其失去了合成具有功能活性的核酸内切酶I的能力，增的能力，增进质粒粒DNA分子的分子的稳定性定性质粒的拷粒的拷贝数及分子大小数及分子大小溶液溶液II要要现用用现配，配，NaOH与空气中与空气中CO2反反应，SDS也会析也会析出出加溶液加溶液II后菌液澄清，并有拉后菌液澄清，并有拉丝现象，象，时间不能太不能太长，也不，也不能振能振荡，避免基因，避免基因组DNA断裂，要上下断裂，要上下颠倒混合。倒混合。抽提要充分，如有必要可以重复抽提，否抽提要充分，如有必要可以重复抽提，否则影响影响酶切等切等离心养成按离心养成按顺序放置的序放置的习惯，将离心管塑料柄向外，有利于，将离心管塑料柄向外，有利于有效溶解看不到的沉淀有效溶解看不到的沉淀。醇醇沉必沉必须充分混合充分混合质粒提取试剂盒
