《4生物大分子相互作用分析技术基础医学与医学实验技术》由会员分享，可在线阅读，更多相关《4生物大分子相互作用分析技术基础医学与医学实验技术（91页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第六章第六章 生物大分子相互作用生物大分子相互作用 分析技术分析技术基础医学院基础医学院刘刘 芸芸 第一节第一节 生物大分子相互作用分析的意义生物大分子相互作用分析的意义 第二节第二节 常见的生物大分子相互作用分析方法常见的生物大分子相互作用分析方法 第三节第三节 生物大分子相互作用分析新进展生物大分子相互作用分析新进展（FRET、SPR）主要内容主要内容l真核生物细胞真核生物细胞 eukaryotic celleukaryotic celll原核生物细胞原核生物细胞 prokaryotic cellprokaryotic cell细胞结构细胞结构 cell引言引言原核生物细胞结构原核生物细胞
2、结构肽聚糖肽聚糖被膜被膜质膜质膜引言引言动物细胞动物细胞植物细胞植物细胞细胞壁、细胞膜、细胞质和细胞核细胞壁、细胞膜、细胞质和细胞核真核真核生物细胞结构生物细胞结构引言引言细胞中的大分子细胞中的大分子 Macromolecules in CellsThe approximate composition of a bacterial cell.引言引言分子水平DNAsequenceProteins Structure Function?All Cell 第一节第一节 生物大分子相互作用分析的意义生物大分子相互作用分析的意义DNAPrimary transcriptmRNAmRNAInactive
3、mRNAproteinnucleuscytoplasmTranscriptionalcontrolPost-transcriptionalcontrolmRNA degradationcontroltranslationcontrolactiveproteinPost-translationcontrol基因表达的调控层次基因表达的调控层次Protein complexSignaling net work生命机制生命机制蛋白质组学的分类蛋白质组学的分类? 表达蛋白质组学表达蛋白质组学Quantitative study of protein expression between samples
4、 that differ by some variable? 结构基因组学结构基因组学Goal is to map out the 3-D structure of proteins and protein complexes? 功能蛋白质组学功能蛋白质组学To study protein-protein interaction, 3-D structures, cellular localization and PTMs in order to understand the physiological function of the whole set of proteome.l蛋白质结构和
5、序列特点蛋白质结构和序列特点l蛋白质进化过程和保守序列蛋白质进化过程和保守序列l蛋白质表达谱蛋白质表达谱l蛋白在细胞内的定位及其相关联的细胞器或蛋白在细胞内的定位及其相关联的细胞器或结构结构l蛋白质翻译后修饰情况蛋白质翻译后修饰情况l了解与其相关联的其他细胞蛋白质了解与其相关联的其他细胞蛋白质蛋白质信息的不同层次蛋白质信息的不同层次v蛋白质同源二聚体蛋白质同源二聚体(homodimer)v蛋白质异源二聚体蛋白质异源二聚体(heterodimer)v蛋白质多聚体蛋白质多聚体(polymer)v蛋白质蛋白质-DNA复合物复合物(protein-DNA complex)v蛋白质-脂质复合物(prot
6、ein-lipid complex)v蛋白质-RNA复合物(protein-RNA complex)vDNA-DNA复合物(DNA-DNA complex)v生物大分子复合物的类型生物大分子复合物的类型第二节第二节 生物大分子相互作用分析技术生物大分子相互作用分析技术 1. 研究思路研究思路2. 分类分类3. 技术介绍技术介绍生物大分子相互作用分析研究思路生物大分子相互作用分析研究思路鉴定与目标分子相鉴定与目标分子相互作用的所有可能互作用的所有可能大分子大分子详细描述其生物功能详细描述其生物功能及相互作用对其功能及相互作用对其功能的影响的影响鉴定出相互作用且在生理鉴定出相互作用且在生理状态下得
7、到了验证和合理状态下得到了验证和合理的解释的解释vGST 融合蛋白技术融合蛋白技术(GST pull-down)v免疫共沉淀免疫共沉淀(Immunoprecipitation, Co-IP )v串联亲和纯化串联亲和纯化(Tandem Affinity Purification，TAP)v酵母双杂交系统酵母双杂交系统(Yeast two-hybrid)v噬菌体展示噬菌体展示(Phage display)v细胞内蛋白质共定位细胞内蛋白质共定位(Co-localization)v荧光共振能量转移荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)
8、v表面等离子共振表面等离子共振(surface plasmon resonance，SPR)v生物大分子相互作用分析技术生物大分子相互作用分析技术1.GST融合蛋白技术融合蛋白技术 （GST pull-down assay）基于重组蛋白表达纯化技术的体外分析系统基本原理：基本原理：是将靶蛋白是将靶蛋白-GST融合蛋融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为作为与目的蛋白亲和的支撑物与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种充当一种“诱诱饵蛋白饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱目的蛋白溶液过柱,可从中捕可从中捕获与之相互作用的获与之相互作用的“捕获蛋白捕获蛋白”(目的蛋目的蛋白白),
9、洗脱结合物后通过洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分电泳分析析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白诱饵蛋白”和和“捕捕获蛋白获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。等方法获得。 GSTGST：谷胱甘肽巯基转移酶：谷胱甘肽巯基转移酶：谷胱甘肽巯基转移酶：谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-(glutathione S-transferasetransferase) )GST pull-down assayPur
10、ification of proteinGlutathione columnGlutathione beadGST fusion proteinTags Pull-Down 方法的组成方法的组成RtagbaitpreyResin树脂树脂树脂树脂Bait诱饵蛋白诱饵蛋白诱饵蛋白诱饵蛋白Prey捕获蛋白捕获蛋白捕获蛋白捕获蛋白Tags 标签标签标签标签（GST, His, Flag, HA, MBP）RPull-down experimentRWashRRAdd preyWashElutionAnalysisBaitPreyControlsRAdd preyWashRRElutionAnalysi
11、s S CSDS-PAGE gel实验设计思路实验设计思路GSTXY谷胱甘谷胱甘肽肽-琼脂糖微珠琼脂糖微珠细胞裂解物细胞裂解物 tube4下孵育下孵育2h2h GST融合蛋白融合蛋白GSTXY+实验流程实验流程GST pull-down 应用应用l鉴定未知相互作用的蛋白l鉴定预测的或已知的相互作用GST pull down验证两种已知蛋白质验证两种已知蛋白质（X-Y）的相互作用）的相互作用举举 例例inputGSTY-GFP + + +X-GSTY-GFP105kDAnti-GFPX-GFP + + +GSTinputAnti-GFPY-GSTX-GFP2. 免疫共沉淀免疫共沉淀（ immun
12、oprecipitation，Co-IP ）非常有效地用于鉴定细胞内生理上的蛋白质相互作用的分析技术 免疫共沉淀（免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）：）：是以是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。胞内生理性相互作用的有效方法。 基本原理基本原理：当细胞在当细胞在非变性条件下非变性条件下被裂解时，完整被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互
13、作用被保留了下来。如果用蛋白质了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀的抗体免疫沉淀X，那么与，那么与X在在体内结合的蛋白质体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。也能沉淀下来。GagaroseGagaroseXYGagarose实验设计思路实验设计思路实验流程实验流程SDS-PAGEProtein A/GSepharose诱饵诱饵蛋白质蛋白质抗体抗体离心离心诱饵诱饵蛋白质蛋白质Protein A/GSepharose离心离心传统方法传统方法交联方法交联方法基础：基础：细胞在非变性条件下裂解时，完整细胞内许多蛋细胞在非变性条件下裂解时，完整细胞内许多蛋白质之间的结合保持下来。白质之间的结合保持下来。要求要
14、求：在一系列操作过程中保持蛋白质复合体不变在一系列操作过程中保持蛋白质复合体不变缺点缺点：可能检测不到细胞内处于动态平衡中的低亲和与可能检测不到细胞内处于动态平衡中的低亲和与瞬间的相互作用瞬间的相互作用,存在着免疫球蛋白的污染，需要培养大存在着免疫球蛋白的污染，需要培养大量的细胞量的细胞局限：局限：仅应用于从细胞中溶解出来仍存在于生理复合物仅应用于从细胞中溶解出来仍存在于生理复合物中的蛋白质中的蛋白质Co-IP 应用应用l鉴定已知蛋白质相互作用的检测l鉴定新蛋白质间的相互作用免疫共沉淀验证两种已知蛋白质的免疫共沉淀验证两种已知蛋白质的相互作用相互作用Y-GFPY-GFP+X-HAIP: HA
15、control IgGAnti-GFPAnti-GFPAnti-HAY-GFPinput举 例3.串联亲和纯化串联亲和纯化（Tandem Affinity Purification，TAP）a. One-step affinity purificationb. Two-step affinity purification (tandem affinity purification)Affinity purification (immunopurification)融合了标准生化纯化和免疫共沉淀策略的极为有效的快速纯化蛋白质复合物的方法串联亲和纯化技术的优势串联亲和纯化技术的优势C与传统的生化纯
16、化方法相比与传统的生化纯化方法相比C与免疫共沉淀方法相比与免疫共沉淀方法相比使用恒定的标签和标准纯化条件避免了每次都要设计新纯化使用恒定的标签和标准纯化条件避免了每次都要设计新纯化方案的问题方案的问题多步骤纯化降低了细胞高丰度蛋白质以及免疫球蛋白的背景污多步骤纯化降低了细胞高丰度蛋白质以及免疫球蛋白的背景污染染双亲和标签：双亲和标签：l ProAProA（葡萄球菌蛋白（葡萄球菌蛋白A A 的两个免疫球蛋白的两个免疫球蛋白IgGIgG结结合单位）合单位）l CBPCBP（钙调蛋白结合肽）（钙调蛋白结合肽）实验设计思路实验设计思路实验流程实验流程钙调素钙调素结合肽结合肽TEV酶切酶切位点位点在在C
17、a2+ 离子下结合离子下结合TEV 酶切酶切用用EGTA 洗脱洗脱靶蛋白结合于靶蛋白结合于IgG珠子珠子充分洗涤后，在充分洗涤后，在TEV蛋白酶作蛋白酶作用下洗脱结合物用下洗脱结合物钙离子存在下，将首次洗脱物钙离子存在下，将首次洗脱物中的蛋白质结合于钙调蛋白包中的蛋白质结合于钙调蛋白包被的珠子上被的珠子上充分洗涤后，加入充分洗涤后，加入EGTA洗洗脱结合物脱结合物4. 酵母双杂交酵母双杂交（ yeast two-hybrid system ）基于在转录水平上的直接在酵母细胞内检测蛋白质之间相互作用的遗传学方法基本原理：基本原理： 基于对真核生物调控转录起始过程的认识。基于对真核生物调控转录起始
18、过程的认识。 前者可识别前者可识别DNA上的特异序列，上的特异序列， 并使转录激活结构域定位于所调并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，节的基因的上游， 转录激活结构转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作域可同转录复合体的其他成分作用，用， 启动它所调节的基因的转录。启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，当部位打开， 仍具有各自的功能。仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白
19、蛋白的相互作用。表达探测蛋白蛋白的相互作用。 典型的真核生长转录因子，典型的真核生长转录因子， 如如GAL4都含有二个不同的结构域：都含有二个不同的结构域：DNA结合结构域（结合结构域（DNA-binding domain，BD）和转录激活结构域）和转录激活结构域（transcription-activating domain，AD）。）。酵母双杂交酵母双杂交（ yeast two-hybrid system ）三个基本组成部分三个基本组成部分1.表达诱饵蛋白的载体表达诱饵蛋白的载体，诱饵即我们诱饵即我们感兴趣的蛋白，它和感兴趣的蛋白，它和DNA结合结构域结合结构域融合。融合。2. 表达靶蛋白
20、的载体表达靶蛋白的载体，靶蛋白可以是靶蛋白可以是一个已知的蛋白，也可以是一个已知的蛋白，也可以是cDNA或或基因组文库编码的蛋白。靶蛋白和转基因组文库编码的蛋白。靶蛋白和转录激活结构域融合。录激活结构域融合。3. 一个或多个报告基因一个或多个报告基因（如控制氨基如控制氨基酸合成的基因、大肠杆菌的酸合成的基因、大肠杆菌的lacZ基因基因等），位于等），位于DNA结合结构域识别的调结合结构域识别的调控区的下游。控区的下游。 ADDBDgene+reporterMeasurableproduct+DBDbaitADpreyDBDAD实验设计思路实验设计思路Target:未知蛋白或未知蛋白或将将研究對
21、象研究對象+ DNA binding domainBait:已知蛋白已知蛋白+ activation domainTarget 与与Bait可互换可互换转入同一个酵母菌中转入同一个酵母菌中Construct target plasmid and bait plasmidTransformationScreeningDNA extractionDNA sequencingYeast Two-Hybrid Assaynucleushis- leu- trp-MeasurableproductDBDbaittrpADfishleureporterDBDADhisHISlacZ优势：优势：酵母双杂交方
22、法的优势及缺陷酵母双杂交方法的优势及缺陷C 采用酵母菌株采用酵母菌株C 敏感度高敏感度高C 蛋白折叠蛋白折叠C 易于筛选易于筛选C 应用范围广应用范围广缺陷：缺陷：I 核内作用核内作用I 假阳性假阳性I 假阴性假阴性I 转化率转化率酵母双杂交方法的应用酵母双杂交方法的应用l高灵敏度地检测蛋白蛋白的相互作用 l确定蛋白相互作用的结构域或重要活性位点 l寻找与靶蛋白相互作用的新蛋白 l寻找具有药物治疗作用的小分子肽 l寻找控制蛋白相互作用的化合物 l蛋白相互作用图谱的绘制举举 例例酵母双杂交前准备工作酵母双杂交前准备工作双酶切验证双酶切验证21kb5kb3.5kb2kb1.5kb M 1 M:ma
23、rker1:pGBKT7-BD-X构建诱饵质粒构建诱饵质粒诱饵蛋白的表达诱饵蛋白的表达X-BDGal4-BD检测诱饵蛋白是否有毒性检测诱饵蛋白是否有毒性1 2 3Western blot1.Yeast2.BD-yeast3.X-BD-yeast酵母生长曲线酵母生长曲线1.未转化酵母未转化酵母2.BD-酵母酵母3.X-BD-酵母酵母酵母双杂交结果酵母双杂交结果SD/-Trp/-Leu-Trp/-Leu/-His/-Ade +3-AT （20mM）举举 例例SD/-Trp/-LeuGal4-BD+Y-ADX-BD+Y-ADGal4-BD+Gal4-ADX-BD+Gal4-AD X-半乳糖苷酶蓝白斑
24、显色分析半乳糖苷酶蓝白斑显色分析举举 例例X-BD+Y-ADX-BD+gal4-ADGal4-BD+Y-ADgal4-BD+gal4-AD酵母双杂交测序结果酵母双杂交测序结果酵母双杂交得到的阳性克隆子质粒经过酵母双杂交得到的阳性克隆子质粒经过DNA测序，由测序，由NCBI数据库的数据库的BLAST检索检索cDNA编码的蛋白质编码的蛋白质举举 例例5.噬菌体展示技术噬菌体展示技术（Phage display）基于将某个蛋白与其遗传信息之间直接联系的筛选方法 噬菌体展示技术是将外源蛋白噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的或多肽的DNA序列插入到噬菌体外序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外
25、壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。装而展示到噬菌体表面的生物技术。到目前为止，人们已开发出了单链到目前为止，人们已开发出了单链丝状噬菌体展示系统、丝状噬菌体展示系统、噬菌体展噬菌体展示系统、示系统、T4噬菌体展示系统等数种噬菌体展示系统等数种噬菌体展示系统。噬菌体展示系统。 特特 点点 该技术的主要特点是将特定分子的该技术的主要特点是将特定分子的基因型基因型和和表型表型统一统一在同一病毒颗粒内，即在噬菌体表面展示特定蛋白质，而在同一病毒颗粒内，即在
26、噬菌体表面展示特定蛋白质，而在噬菌体核心在噬菌体核心DNA中则含有该蛋白的结构基因。另外，这中则含有该蛋白的结构基因。另外，这项技术把基因表达产物与亲和筛选结合起来，可以利用适项技术把基因表达产物与亲和筛选结合起来，可以利用适当的靶蛋白将目的蛋白或多肽挑选出来。当的靶蛋白将目的蛋白或多肽挑选出来。lUsed for cloning foreign genes among other applicationslProteins and peptides are fused to the Capsid (surface) of the phagelThe combination of the ph
27、age and peptide is known as a Fusion Protein实验设计思路实验设计思路phageslFilamentous phages M13FdF1lOthersT4Filamentous phageslInfect many gram-negative bacterialCircular single stranded DNA genomelAbout 6.4kb.p.lLong, flexible tube structurelabout 1m long and 6.5nm in diameterlReproduced and secreted from in
28、fected bacteria without cell killing or lysis (lysogenic phage)(a) Adenovirus. (b) Rotavirus. (c) Influenza virus (courtesy of George Leser). (d) Vesicular stomatitis virus.(e) Tobacco mosaic virus. (f) Alfalfa mosaic virus. (g) T4 bacteriophage. (h) M13 bacteriophage.M13 噬菌体颗粒结构噬菌体颗粒结构M13噬菌体的生活史噬菌体
29、的生活史其裂解周期为：其裂解周期为：1)吸附吸附(adsorption) 2)侵入侵入(entory)3)复制（生物合成复制（生物合成biosynthesis）4)成熟成熟(maturation) 5)装配装配(assembly)6)释放释放(release)丝状噬菌体的基因及蛋白结构丝状噬菌体的基因及蛋白结构http:/www.scielo.br/scielo.php?pid=S1415-47572005000100001&script=sci_arttext pIII (406aa, 58copies) pVIII (50aa, 2700 copies) pVI (112aa, 58cop
30、ies)载体的插入位点载体的插入位点 pIII 和和pVIII 噬菌体展示系统噬菌体展示系统pIII系统pVIII系统拷贝数拷贝数少少多多多肽片段大小多肽片段大小大大1010个氨基酸个氨基酸亲和力亲和力高高低低适用范围适用范围常用于展示由常用于展示由cDNAcDNA和和基因组序列编码的多基因组序列编码的多肽，范围较广肽，范围较广展示小肽，范围较窄展示小肽，范围较窄T7噬菌体展示筛选系统测序分析插入序列将噬菌体文库铺在固定的靶蛋白上洗脱未结合的噬菌体加入大肠杆菌，扩增和富集洗脱的噬菌体铺富集文库铺盘分离单个克隆34轮筛选验证实验：结合实验实验流程实验流程 优点：优点： A. 高通量的淘选：高通量
31、的淘选：将靶标分子（抗体）固定在固相载体上，加入噬菌体展示肽库将靶标分子（抗体）固定在固相载体上，加入噬菌体展示肽库（噬菌体的数量可达（噬菌体的数量可达1011 PFU），利用抗原），利用抗原-抗体的特异性亲和力将与抗体结合的噬菌抗体的特异性亲和力将与抗体结合的噬菌体吸附在固相载体上，不能结合的噬菌体仍在溶液中，可以通过洗涤去除，再将特异结体吸附在固相载体上，不能结合的噬菌体仍在溶液中，可以通过洗涤去除，再将特异结合的噬菌体洗脱下来，如此反复数轮扩增、淘选，即可将有用的基因从多达百万以上的合的噬菌体洗脱下来，如此反复数轮扩增、淘选，即可将有用的基因从多达百万以上的噬菌体克隆中分离出来。噬菌体克
32、隆中分离出来。B. 可用于模拟表位的筛选可用于模拟表位的筛选 ：利用噬菌体展示技术得到模拟表位的报道较多模利用噬菌体展示技术得到模拟表位的报道较多模拟表位同样可诱发与天然表位相似的特异性免疫反应，例如利用乙肝病毒的模拟表位免拟表位同样可诱发与天然表位相似的特异性免疫反应，例如利用乙肝病毒的模拟表位免疫小鼠可诱导产生高滴度的乙肝病毒抗体。疫小鼠可诱导产生高滴度的乙肝病毒抗体。C. 易于纯化易于纯化 重组噬菌体的纯化步骤简单、不要求昂贵的试剂与设备，重组噬菌体的纯化步骤简单、不要求昂贵的试剂与设备，在一般的实验室条件下就可以完成。在一般的实验室条件下就可以完成。 缺点：缺点： 首先，目前所建的肽库
33、容量只能达到首先，目前所建的肽库容量只能达到109，要想构建大片段的肽库，要想构建大片段的肽库很困难。其次，需要解决肽库的多样性问题。第三，少数多肽由于疏很困难。其次，需要解决肽库的多样性问题。第三，少数多肽由于疏水性过强，或由于影响外膜蛋白的折叠而不能展示在噬菌体表面。水性过强，或由于影响外膜蛋白的折叠而不能展示在噬菌体表面。 噬菌体展示系统的应用及优缺点噬菌体展示系统的应用及优缺点6、细胞内蛋白质共定位、细胞内蛋白质共定位（cellular co-localization）基于细胞内绿色蛋白示踪技术的蛋白质间相互的研究方法绿色荧光绿色荧光罗丹明染色罗丹明染色重重 叠叠相相 差差举举 例例细
34、胞内蛋白质共定位研究两种已知细胞内蛋白质共定位研究两种已知蛋白质时空表达关系蛋白质时空表达关系举举 例例第三节第三节 生物大分子相互作用分析生物大分子相互作用分析新技术新技术 1、荧光共振能量转移技术、荧光共振能量转移技术（fluorescence resonance energy transfer，FRET）能够对于细胞中的蛋白质间相互作用或对作用进行实时原位分析的检测方法供体荧光素 受体荧光素FRET现象现象 Binding NO BindingFRET: The Size 当一个荧光分子当一个荧光分子(又称为又称为供体分子供体分子)的荧光光谱与另的荧光光谱与另一个荧光分子一个荧光分子(又
35、称为又称为受体受体分子分子)的激发光谱相重叠时的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光受体分子发出荧光，同时供同时供体荧光分子自身的荧光强度体荧光分子自身的荧光强度衰减衰减。FRET 程度与供、受程度与供、受体分子的空间距离紧密相关体分子的空间距离紧密相关，一般为一般为710 nm 时即可发时即可发生生FRET；随着距离延长随着距离延长，FRET呈显著减弱呈显著减弱.实验设计实验设计InteractionXCFPYYFPUV laserFRETYellow light emissionYYFPXCFPUV laserCyan light emissi
36、onDonorAcceptorFRET的能量供体和受体的能量供体和受体满足条件：满足条件： 供体受体的激发光谱要分得足够开；供体受体的激发光谱要分得足够开； 供体的发射光谱与受体的激发光谱要重叠；供体的发射光谱与受体的激发光谱要重叠； 供受体的发射光谱要足够分开。供受体的发射光谱要足够分开。CFPYFPWavelength (nm)Normalized intensity (%)GFP 绿绿 色色 荧荧 光光 蛋蛋 白白CFP (青色荧光蛋白青色荧光蛋白)(第第66位位TyrTrp)(第第203位位ThrTyr)YFP (黄色荧光蛋白黄色荧光蛋白)CFP (433nm /476nm) YFP
37、(513nm / 527nm)FRET的能量供体和受体的能量供体和受体 均相检测（无分离和洗涤步骤）均相检测（无分离和洗涤步骤） 实时连续地观察活细胞的动态变化实时连续地观察活细胞的动态变化FRET技术的优势技术的优势Fluorescence IntensityTime LigandCy3Cy5ABCIntermolecularDirectIndirectKinaseStep2Step1FRET应用的类型应用的类型FRET应用范围应用范围 酵母双杂交系统、噬菌体展示系统所筛选克隆的复证酵母双杂交系统、噬菌体展示系统所筛选克隆的复证 蛋白质蛋白质核酸相互作用核酸相互作用 酶活性分析酶活性分析蛋白
38、酶、磷酸激酶蛋白酶、磷酸激酶 钙流检测、离子通道研究钙流检测、离子通道研究 蛋白质的结构研究蛋白质的结构研究FRET应用的局限性应用的局限性 信噪比经常不佳，通常为信噪比经常不佳，通常为1：1 -背景主要来自受体被直接激发的信号背景主要来自受体被直接激发的信号 检测仪器的灵敏度、分辨率以及计算机影像采集和检测仪器的灵敏度、分辨率以及计算机影像采集和分析软件的能力分析软件的能力2、表面等离子共振技术、表面等离子共振技术（surface plasmon resonance，SPR）适合于多种类型分子并且无需借助标记物可以实现对复合物直接实时测定的方法 SPRimagerII 基本原理：基本原理：基
39、于表面等离子共振（基于表面等离子共振（SPR）技术）技术来实时跟踪生物分子间的相互作用，而不用任何标记来实时跟踪生物分子间的相互作用，而不用任何标记物。实验时先将一种生物分子固定在传感器芯片表面，物。实验时先将一种生物分子固定在传感器芯片表面，将与之相互作用的分子溶于溶液流过芯片表面。检测将与之相互作用的分子溶于溶液流过芯片表面。检测器能跟踪检测溶液中的分子与芯片表面的分子结合、器能跟踪检测溶液中的分子与芯片表面的分子结合、解离整个过程的变化。解离整个过程的变化。SPR 现象现象SPR angle450 gold layerp-PolarizedLight 表面等离子共振（表面等离子共振（SP
40、R）是一种物理现象，当入射光以临界角入射到两种不同折射是一种物理现象，当入射光以临界角入射到两种不同折射率的介质界面（比如玻璃表面的金或银镀层）时，可引起金属自由电子的共振，由于电子率的介质界面（比如玻璃表面的金或银镀层）时，可引起金属自由电子的共振，由于电子吸收了光能量，从而使反射光在一定角度内大大减弱。其中，使反射光在一定角度内完全吸收了光能量，从而使反射光在一定角度内大大减弱。其中，使反射光在一定角度内完全消失的入射角称为消失的入射角称为SPR角。角。SPR随表面折射率的变化而变化，而随表面折射率的变化而变化，而折射率的变化又和结合在折射率的变化又和结合在金属表面的生物分子质量成正比。金
41、属表面的生物分子质量成正比。因此可以通过获取生物反应过程中因此可以通过获取生物反应过程中SPR角的动态变化，角的动态变化，得到生物分子之间相互作用的特异性信号。得到生物分子之间相互作用的特异性信号。 SPR 角度角度扫描曲线扫描曲线SPR angle传统检测原理传统检测原理SPR angle shift as basis of measurementSPR imaging 检测原理检测原理Fixed angle, fixed wavelengthD%RReflectivity change as basis of measurementSPRimager 系统系统Rotating Stage流
42、动相流动相（含待分析物）（含待分析物）Gold-coated glassSPRchipp-pol light棱镜棱镜分子探针阵列分子探针阵列GWCs “SPR Imaging” 技术技术Bioarray TerminologySPRchipglassgoldattachment chemistryBiosensorAnalyteProbeMonitoring Changes: Difference Images=SA+Bim-PEGn-PEGSASAProbe ArrayProbe Array + BiotinT7Difference Image: signal due to binding
43、of BiotinT7 to StreptavidinABAB-Monitoring Changes: Image + ChartValue of Real-Time MonitoringProtein Array,End of ExperimentAg SA ConAdd Biotinylated AntibodyD D%RminEnd-point measurements miss all the action 优点：优点：分子无需标记；分子无需标记； 高通量（蛋白质芯片）高通量（蛋白质芯片） 检测对象类型广泛检测对象类型广泛 可实现实时检测可实现实时检测 可进行相互作用动力学分析可进行相
44、互作用动力学分析SPRimager 系统系统灵活灵活的阵列形式的阵列形式 Rapid methods developmentManual spottingno spottingrobot neededSmall probe volumes SpotReady, 16 or 25 spots SPRchip 1 - 400 spotsHigher density arraysHigher throughputSpotting robot needed样品无需标记样品无需标记particularly valuable for protein biology Protein moleculeProt
45、ein molecule, labelled避免引入标签带来的人为干扰避免引入标签带来的人为干扰Detect in real time, measure molecular affinitiesMultiplex analysis from a few to a few hundred probes检测对象广泛、实时并实现高通量检测对象广泛、实时并实现高通量Study interactions involvingProteinsPeptidesAntibodiesDNA, RNA LigandsCellsVirusesetc. using the same detection system小小
46、 结结 第一节第一节 生物大分子相互作用分析的意义生物大分子相互作用分析的意义 第二节第二节 常见的生物大分子相互作用分析方法常见的生物大分子相互作用分析方法u GST 融合蛋白技术融合蛋白技术(GST pull-down)u 免疫共沉淀免疫共沉淀(Immunoprecipitation, Co-IP )u 串联亲和纯化串联亲和纯化(Tandem Affinity Purification，TAP)u 酵母双杂交系统酵母双杂交系统(Yeast two-hybrid)u 噬菌体展示噬菌体展示(Phage display)u 细胞内蛋白质共定位细胞内蛋白质共定位(Co-localization)u 荧光共振能量转移荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)u 表面等离子共振表面等离子共振(surface plasmon resonance，SPR) 小小 结结第三节第三节 生物大分子相互作用分析新进展生物大分子相互作用分析新进展思考题思考题l常用的进行生物大分子相互作用分析的常用的进行生物大分子相互作用分析的技术有哪些？技术有哪些？lFRET和和SPR 技术的基本原理是什么？技术的基本原理是什么？谢谢！
