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1、全国高等医药教材建设研究会全国高等医药教材建设研究会卫生部规划教材卫生部规划教材全国高等学校教材全国高等学校教材 供七、八年制临床医学等专业用供七、八年制临床医学等专业用医学分子生物学医学分子生物学Medical Molecular Biology主编主编 冯作化冯作化人民卫生出版社人民卫生出版社 2005年年8月第一版月第一版课件制作：吴耀生课件制作：吴耀生(版权所有版权所有)广西医科大学基础医学院广西医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室生物化学与分子生物学教研室 2008.10全国高等医药教材建设研究会第十三章第十三章基因工程与基因体外表达基因工程与基因体外表达Gene Engin
2、eering and Gene Expression第十三章基因工程与基因体外表达Gene Engineerin目的与意义目的与意义1.获得感兴趣的目的基因获得感兴趣的目的基因2.研究基因结构特征研究基因结构特征3.表达基因产物表达基因产物4.研究基因功能研究基因功能目的与意义1.获得感兴趣的目的基因2.研究基因结构特征3.表基本要素基本要素1. 目的基因目的基因 (target genes)2. 工具酶工具酶 (tool enzymes)3. 载体载体 (vectors)4. 宿主细胞宿主细胞 (host cells)基本要素1. 目的基因 (target genes)2. 工Main co
3、ntents 工具酶工具酶DNA载体载体基因克隆过程基因克隆过程真核细胞基因转染真核细胞基因转染基因改造基因改造克隆基因表达克隆基因表达电子克隆电子克隆基本概念及背景基本概念及背景Main contents 工具酶DNA载体基因克隆过程真For Example 如何从植物中克隆法呢基焦磷酸合酶如何从植物中克隆法呢基焦磷酸合酶(FPS)?1. 查资料认识查资料认识FPS2. 设计实验方案设计实验方案3. 可行性分析可行性分析For Example 如何从植物中克隆法呢基焦磷酸合酶(For Example For Example FPS 克隆：克隆： RT-PCR， 3-RACE， 5-RACE改
4、进的异硫氰酸胍一步法提取三七根部总改进的异硫氰酸胍一步法提取三七根部总RNART-PCR扩增扩增fps部分保守序列部分保守序列3-RACE 及克隆测序及克隆测序5-RACE 及克隆测序及克隆测序序列拼接序列拼接FPS 克隆： RT-PCR， 3-RACE， 5-RAmRNA: 5 AAAAAA3TTTTTTT-接头cDNA:Oligo dT接头接头基因特异性引物基因特异性引物3 Full RACE原理图原理图mRNA: 5 5 Full RACE原理图原理图(1) P5-端磷酸化端磷酸化RT-Primer未知区域未知区域已知序列已知序列Target mRNAAAAAAAAA-5 AAAAAAA
5、A-5 P未知区域未知区域逆转录逆转录RNA分解分解P未知区域未知区域未知区域未知区域S1A1S2A21st PCR primers2nd PCR primers用用RNA ligase进行环化或形成首尾连接物进行环化或形成首尾连接物未知区域未知区域1stand 2nd PCR5-端磷酸化端磷酸化RT primer部位部位包含未知的包含未知的5上游区域的扩增产物上游区域的扩增产物(2) (3) (4) 5 Full RACE原理图(1) P5-端磷酸化RT-Thank YouThank YouDNA重组重组 DNA recombinationSome concerned concepts:DN
6、A重组技术重组技术 DNA recombination technique分子克隆分子克隆 Molecular cloning基因工程基因工程 Genetic engineering克隆克隆 Cloning DNA重组 DNA recombinationSom分子生物学-基因工程与基因体外表达课件三大理论基础三大理论基础1953年，年，Watson 和和Crick揭示了揭示了DNA分子的双螺分子的双螺旋结构模型和半保留复制原理，解决了基因的自旋结构模型和半保留复制原理，解决了基因的自我复制和传递的过程。我复制和传递的过程。40年代，年代，O.T. Avery等通过肺炎链球菌转化实验等通过肺炎链
7、球菌转化实验发现遗传物质的携带者是发现遗传物质的携带者是DNA而不是蛋白质而不是蛋白质50年代末到年代末到60年代初，相继提出了年代初，相继提出了“中心法则中心法则”和操纵子学说，成功破译了遗传密码，阐明了遗和操纵子学说，成功破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流向和表达问题。传信息的流向和表达问题。三大理论基础1953年，Watson 和Crick揭示了DN三大技术发明三大技术发明 DNA分子的体外切割与连接技术分子的体外切割与连接技术 1970年年 Smith, Wilcox 流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌(Haemopbilus influenzae) Hind II 1972年年 Boyer E
8、coR I “GAATTC” 1967年年 世界上世界上5个实验室几乎同时发现了个实验室几乎同时发现了DNA ligase 1970年年 T4 DNA ligase大肠杆菌转化体系的建立大肠杆菌转化体系的建立-复制工厂复制工厂基因工程载体的使用基因工程载体的使用：plasmid, phage, viruses三大技术发明 DNA分子的体外切割与连接技术大肠杆菌转化体系1978年年Nobel 医学与生理学奖医学与生理学奖The Nobel Prize in Medicine was awarded, in 1978, to Daniel Nathans, Werner Arber, and Ha
9、milton Smith for the discovery of restriction endonucleases. Their discovery lead to the development of recombinant DNA technology that allowed, for example, the large scale production of human insulin for diabetics using E. coli bacteria. Over 3000 restriction enzymes have been studied in detail, a
10、nd more than 600 of these are available commercially and are routinely used for DNA modification and manipulation in laboratories.1978年Nobel 医学与生理学奖The Nobel Pr分子生物学-基因工程与基因体外表达课件DNA ligase repairing chromosomal damage.ligase I, DNA, ATP-dependentDNA ligase repairing chromosom第一节第一节 基因克隆是利用工具酶进行操作基因
11、克隆是利用工具酶进行操作v工具酶工具酶(Tool enzymes )-用于对用于对DNA分子进行定点切割、连接、扩增、分子进行定点切割、连接、扩增、标记等操作的特殊酶类，已被纯化并商品化进标记等操作的特殊酶类，已被纯化并商品化进行应用行应用一、一、 限制酶限制酶 (RE , restriction endonuclease )二、其他工具酶二、其他工具酶 (other tool enzymes)第一节 基因克隆是利用工具酶进行操作工具酶(Tool en一、一、RE在基因克隆中用于切割在基因克隆中用于切割DNAvRE (restriction enzyme, restriction endonu
12、clease )-限制性核酸内切酶，限制酶，限制性核酸内切酶，限制酶，能识别能识别DNA双链内特异位点并水解磷酸二酯键，双链内特异位点并水解磷酸二酯键，产生特定末端的酶产生特定末端的酶一、RE在基因克隆中用于切割DNARE (restrictiRestriction enzyme Functions:能识别能识别DNA内部特异位点并且裂解磷酸二酯键内部特异位点并且裂解磷酸二酯键(1) Sorting of restriction enzyme有三型，但最重要的是有三型，但最重要的是II型酶型酶(2) Naming of RE 细菌属细菌属名名细菌种细菌种名名细菌菌细菌菌株株编号编号Escher
13、ichia coli RY13 I属属Genus, 种种-species, 菌株菌株-strainEcoR IRestriction enzyme Functions:细Two catalytic manganese ions (one from each monomer) are shown as magenta spheres and are adjacent to the cleaved sites in the DNA made by the enzyme (depicted as gaps in the DNA backbone). Structure of the homodime
14、ric restriction enzyme EcoRI (cyan and green cartoon diagram) bound to double stranded DNA (brown tubes) based on the PDB 1QPS X-ray crystallographic coordinates.Two catalytic manganese ions (3) 限制酶的识别和切割位点限制酶的识别和切割位点Characters: 通常通常识别识别46个碱基个碱基，少数识别，少数识别8个个所识别的序列一般为所识别的序列一般为回文结构回文结构(palindrome)在特异位
15、点内切割在特异位点内切割DNA双链，产生双链，产生两种两种末端末端 粘性末端粘性末端平端平端5-粘性末端粘性末端3-粘性末端粘性末端5-CCCGGG-33-GGGCCC55-CCC GGG-33-GGG CCC-5+平端切割平端切割(blunt end, such as Sma I )Go to 109(3) 限制酶的识别和切割位点粘性末端平端5-粘性末端35-GGTGAATTCAGC-33-CCACTTAAGTCG55-TTGCTGCAGAAG-33-AACGACGTCTTC55-粘性末端粘性末端 (EcoR I )3-粘性末端粘性末端 ( Pst I )5-GGTG AATTCAGC-33
16、-CCACTTAA GTCG5+5-TTGCTGCA GAAG-33-AACG ACGTCTTC5+5-GGTGAATTCAGC-35-TTGCTGCA(4) 同工异源酶同工异源酶( isoschizomers ) 来源不同，但能识别和切割同一位点的来源不同，但能识别和切割同一位点的RE 例：例：Bam H I & Bst I ( GGATCC) Xho I & Pae R7 (CTCGAG)(5) 同尾酶同尾酶( isoaudamers ) 识别序列不同，但产生相同粘性末端的识别序列不同，但产生相同粘性末端的RE 例：例：Bam H I ( GGATCC) Sau 3A I ( NGATCN
17、)RE作用的条件：作用的条件： 一定的盐溶度；一定的盐溶度；Mg2+; 不需不需ATPRE识别序列长度与切点数：识别序列长度与切点数：对同一对同一DNA，识别序列短的，切点数多，片段，识别序列短的，切点数多，片段较短；反之则反之较短；反之则反之(4) 同工异源酶( isoschizomers )二、基因克隆需要具有不同功能的工具酶二、基因克隆需要具有不同功能的工具酶v其他工具酶其他工具酶-用于对用于对DNA分子进行多种操作，分子进行多种操作，也叫也叫修饰酶修饰酶作用：作用：剪切、补平、连接、化学修饰等剪切、补平、连接、化学修饰等二、基因克隆需要具有不同功能的工具酶其他工具酶-用于对常用：常用：
18、(1) DNA polymerase I，Klenow Fragment (2) Reverse transcriptase(3) T4 DNA ligase(4) Alkaline phosphatase(5) Terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT(6) Taq DNA polymeraseSo on 常用：(1) DNA polymerase IActivities：53聚合活性，聚合活性， 53及及 35外切活性外切活性Functions：在生物体内，填补引物切除后留下的空缺，修复在生物体内，填补引物切除后留下的空缺，修复在生物体外，缺口平
19、移制备探针在生物体外，缺口平移制备探针DNA polymerase IKlenow fragment (76KD)Another small fragment 枯草杆菌枯草杆菌蛋白酶蛋白酶(1) DNA polymerase IDNA polymKlenow片段片段35kD76kDNCE.coli DNA pol I53外切酶外切酶53聚合聚合酶酶35外切外切酶酶用枯草杆菌蛋白酶裂解全酶用枯草杆菌蛋白酶裂解全酶53聚合聚合酶酶35外切外切酶酶76kDCKlenow fragment 用途：用途：1) 补齐双链补齐双链DNA的的3-末端末端2) 通过补齐通过补齐3端使端使3端标记端标记3) 在在
20、cDNA克隆中，第二股链的合成克隆中，第二股链的合成4) DNA序列分析序列分析Klenow片段35kD76kDNCE.coli DNA 常用的常用的reverse transcriptase:禽类成骨细胞性白血病病毒禽类成骨细胞性白血病病毒(AMV)逆转录酶逆转录酶(2) Reverse transcriptase用途：用途：合成合成cDNA，构建，构建cDNA文库文库Moloney 小鼠白血病病毒小鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶逆转录酶常用的reverse transcriptase:禽类成骨细第二节第二节 基因克隆需要特定的基因克隆需要特定的DNA载体载体基因克隆为什么需要载体？基因克
21、隆为什么需要载体？载体的类型载体的类型-克隆载体，表达载体克隆载体，表达载体载体的来源载体的来源细菌质粒细菌质粒噬菌体噬菌体DNA(DNA, M13 DNA)病毒病毒DNA人工载体人工载体(cosmid)等等第二节 基因克隆需要特定的DNA载体基因克隆为什么需要载体vDNA载体载体(vector)-能与能与DNA片段连接，构片段连接，构建成新的重组建成新的重组DNA分子，并可携带该外源分子，并可携带该外源DNA片段进入一定宿主细胞，在宿主中扩增甚至表片段进入一定宿主细胞，在宿主中扩增甚至表达，并有遗传标记进行筛选达，并有遗传标记进行筛选载体的概念载体的概念DNA载体(vector)- 能与DN
22、A片段连接，构建成Cloning vector能够携带感兴趣的外源能够携带感兴趣的外源DNA（target DNA）进入宿主细胞，并将外源）进入宿主细胞，并将外源DNA在宿主内进行克隆和扩增，而采用的一些在宿主内进行克隆和扩增，而采用的一些DNA分子称为分子称为Cloning vector 。Cloning vector classes Plasmid DNA (质粒质粒DNA)Phage DNA (噬菌体噬菌体DNA)Virus DNA (病毒病毒DNA)Expression vector 能使外源基因在宿主中能使外源基因在宿主中表达的载体表达的载体Cloning vector能够携带感兴趣
23、的外源DNAExpression vector: 含表达调控有关的元件含表达调控有关的元件When E coli is used as host cell, plasmid, phage, cosmid, M13 phage can usually be used as vectors载体的本体的本质是什么？是什么？ Vector characters (cloning vector):能在宿主细胞中自我复制、自我表达能在宿主细胞中自我复制、自我表达分子相对较小，在宿主细胞中有高拷贝分子相对较小，在宿主细胞中有高拷贝具有遗传标志具有遗传标志有多个限制性酶单一酶切位点有多个限制性酶单一酶切位点(
24、多克隆位点多克隆位点)易与宿主易与宿主DNA相分离相分离Expression vector: 含表达调控有关的元件W一、常用克隆载体主要来自质粒和病毒一、常用克隆载体主要来自质粒和病毒v(一一)质粒是常用的克隆载体质粒是常用的克隆载体Examples:pBR322pUC Characters:a.Small molecular weight, high copiesb.More than one genetic markc.Multiple cloning sites, MCS一、常用克隆载体主要来自质粒和病毒(一)质粒是常用的克隆载体pBR322Turn to 64pBR322Turn to
25、 64pUC19 pUC19 v(二二) 噬菌体经过重组也可以携带外源噬菌体经过重组也可以携带外源 DNAExamples: bacteriophage, phage; M13 phageIt is a kind of virus which can infect bacteria bacteriophages in common use:EMBL spectrum gt spectrumCharon spectrum(二) 噬菌体经过重组也可以携带外源 DNAExamples bacteriophage, phage 噬菌体是侵犯细菌的病毒。在菌体内为环状噬菌体是侵犯细菌的病毒。在菌体内为环
26、状DNADNA分子；分离产物为双链线状分子；分离产物为双链线状DNADNA分子，有天然分子，有天然的粘性末端（称的粘性末端（称COSCOS位点），进入宿主菌后可自行位点），进入宿主菌后可自行环合。基因组环合。基因组DNADNA长约为长约为48.5Kb48.5Kb, ,共有共有6666个基因，个基因，较复杂。较复杂。Character：1 1、其生长必需的序列位于左右二臂其生长必需的序列位于左右二臂上，中部约上，中部约30%30%为生长非必需；为生长非必需；2 2、成熟需要包装成熟需要包装（大小为原来的（大小为原来的75-105%75-105%时）时）Two kinds of vectors：置
27、换型载体；插入型载体置换型载体；插入型载体 bacteriophage, phageCharacte置换型置换型噬菌体载体：噬菌体载体：用限制酶切除中央片段用限制酶切除中央片段供目的基因替代，目的基因与左、右载体两臂供目的基因替代，目的基因与左、右载体两臂结合。结合。替代片段可达替代片段可达9 923Kb23Kb。左臂左臂中央片段中央片段右臂右臂酶切点酶切点酶切点酶切点切除后用目的基因取代切除后用目的基因取代COS位点位点COS位点（位点（12bp)置换型噬菌体载体：用限制酶切除中央片段供目的基因替代，目的The life period of phage(噬菌体的生活周期噬菌体的生活周期):L
28、ysogenic pathway( 溶原生溶原生长途径途径)Lysis pathway(溶菌生溶菌生长途径途径)The life period of phage(噬菌体溶原生长溶原生长溶菌生长溶菌生长溶原转溶菌生长溶原转溶菌生长以噬菌体为媒介的转导作用以噬菌体为媒介的转导作用溶原生长溶菌生长溶原转溶菌生长以噬菌体为媒介的转导作用 gt10:insertion vector; multiple cloning site: CIThe positive marks of screening:Whether the recombinant vector can be wrapped(If no ex
29、traneous DNA replaced, the vector would be too small to be wrapped)With insertion, CI activity lost, to be transparent spots; Without insertion, CI keeps intact, to be turbid spots gt11：insertion vector; MCS: lac Z；expressedWith insertion into lac z of gt11, white spotsOtherwise blue spots gt10:inse
30、rtion vector; multiv(四四) 粘性质粒适合克隆较大的粘性质粒适合克隆较大的DNA片段片段粘性质粒粘性质粒(cosmid)由由DNA的的cos区与质粒重新构建的载体，具有区与质粒重新构建的载体，具有与质粒相同的结构特点，为双链环状与质粒相同的结构特点，为双链环状DNA。It is constructed with the cos region of DNA and plasmid, which is double cycle DNA with bigger content for cloning (4050kb)(四) 粘性质粒适合克隆较大的DNA片段粘性质粒(cosmiCh
31、aracters:1) With antibiotics marks and replication element itself2) With cos region of phage, can be wrapped3) With one or more cloning sites4) Small molecular weight5) non-recombination cosmid too small to be wrapped, so it is screened easilyCharacters:v(三三) M13噬菌体适合制备单链噬菌体适合制备单链DNAM13 bacteriophag
32、e:It is a kind of E coli phage, the genome6.5kb, a cycle DNA containing singlestrand DNATwo forms:Wild form; Replication form (RF)The most merit:Can be released from host as single strand(三) M13噬菌体适合制备单链DNAM13 bacteriM13 phage Characters:In vivo, double strands DNA (can be replicated)In vitro, singl
33、e strand DNA (can be used as template for DNA sequencing, or make DNA probes for hybridization )After entering host cells, it is replicated to double strands DNA and becomes replicational form DNA ( RF DNA ) which can be used as cloning vectorM13 phage Characters:In vivo, v(五五) 病毒载体可将外源病毒载体可将外源DNA带入
34、哺乳动物细胞带入哺乳动物细胞Virus vectors in common use:逆转录病毒，腺病毒，腺相关病毒，逆转录病毒，腺病毒，腺相关病毒，EB病毒病毒等病毒载体，可将外源基因导入受体细胞等病毒载体，可将外源基因导入受体细胞Characters:多数均已质粒化，由病毒启动子、包装元件、选多数均已质粒化，由病毒启动子、包装元件、选择性遗传标记及择性遗传标记及pBR322复制起始点组成复制起始点组成Other vectors:YAC, yeast artificial chromosome (0.52Mb) BAC, bacterial artificial chromosome (0.4
35、Mb)(五) 病毒载体可将外源DNA带入哺乳动物细胞Virus v二、表达载体将外源基因带入宿主并表达二、表达载体将外源基因带入宿主并表达vExpression vectors Concept:The conditions for expression vector:With expression structures except for the characters of cloning vectorsThe vectors which can make the extraneous DNA be expressed in host cells are termed as expressi
36、on vectors.二、表达载体将外源基因带入宿主并表达Expression vSorts:Expression vectors of E coli (prokaryote )Expression vectors of eukaryoteExpression vectors of mammal animals Sorts:Expression vectors of E v(一一) 原核表达载体适于原核细胞表达外源基因原核表达载体适于原核细胞表达外源基因Expression vectors of E coli:除克隆所需成分外，还含有启动子，核糖体除克隆所需成分外，还含有启动子，核糖体结合位点
37、，转录终止序列等表达元件结合位点，转录终止序列等表达元件(一) 原核表达载体适于原核细胞表达外源基因ExpressiTrp-lac promoter ( or tac promoter)Inducer: IPTGStrains: RB791, XL-1-blue, SB221, JM 1091. PromoterT7 of T7 phage It is a high effective expression promoterStrain: JM109(DE3)PL of -phage (temperature induce promoter ) Controlled by cIts857 (s
38、ensitive to temperature), clts857为温度敏感阻抑物温度敏感阻抑物Strain: M5219Trp-lac promoter ( or tac prom原核生物原核生物mRNA与核蛋白体小亚基结合的分子机制与核蛋白体小亚基结合的分子机制AUU C C UCCACUAGG核蛋白体小亚基的核蛋白体小亚基的16S-rRNA5A G G A PuPuUUUPuPuAUG3mRNARps辨认序列辨认序列SD序列序列Ribosome-binding site, RBS Including AUG, SD sequence 2. 核糖体结合位点核糖体结合位点(RBS)原核生物m
39、RNA与核蛋白体小亚基结合的分子机制AUU C 作用：作用： 3. 转录终止序列转录终止序列保证外源基因在宿主中的高效表达保证外源基因在宿主中的高效表达使读码框架能够正确转录使读码框架能够正确转录作用： 3. 转录终止序列保证外源基因在宿主中的高效表达使读v(二二) 真核表达载体适于真核细胞表达外源基因真核表达载体适于真核细胞表达外源基因Eukaryote expression vectors:含有一定的原核序列：含有一定的原核序列：E coli中的中的ori位点；位点；antibacterial site含有一定的真核序列：含有一定的真核序列：真核细胞中的药物抗性基因；真核表达组件，如真核细
40、胞中的药物抗性基因；真核表达组件，如真核复制起点，启动子真核复制起点，启动子/ 增强子，克隆位点，加增强子，克隆位点，加尾信号等尾信号等(二) 真核表达载体适于真核细胞表达外源基因Eukaryot Expression vectors of mammal animalIf a gene needs to be expressed in mammal animal cells, the eukaryote expression vector must be used.The essential elements including:Replica origin, antibiotics site
41、s, eukaryote promoter, enhancer, cloning sites, termination signal, poly A signal Expression vectors of mammal 第三节第三节 基因克隆过程包括五个基本部分基因克隆过程包括五个基本部分vGene cloning process(1) 制备目的基因及相关载制备目的基因及相关载体体(2) 将目的基因与载体进行连接将目的基因与载体进行连接(3) 将重组将重组DNA导入受体细胞导入受体细胞(4) DNA重组体的筛选与鉴重组体的筛选与鉴定定(5) DNA重组体扩增、表达及其他研究重组体扩增、表达及
42、其他研究分分切切 接接筛筛转转第三节 基因克隆过程包括五个基本部分Gene clonin一、采用不同方法获取目的基因一、采用不同方法获取目的基因vMethods to get a target gene:(1) To prepare genomic library(2) To prepare cDNA library or cDNA(3) To PCR(4) To synthesize the DNA fragment by chemical method一、采用不同方法获取目的基因Methods to get av(一一) 从基因组文库中获得目的基因从基因组文库中获得目的基因Genomic
43、library :指含有一个机体基因组指含有一个机体基因组DNA的全套重组的全套重组DNA分分子的克隆群体子的克隆群体用于构建基因组文库的载体：用于构建基因组文库的载体：-噬菌体噬菌体(- phage)，粘性质粒，粘性质粒(cosmid)(一) 从基因组文库中获得目的基因Genomic libraGenomic library construction:分离高分子量分离高分子量DNA分离回收分离回收1525 kb的的DNA片段片段部分消化，以切成一定大小片段部分消化，以切成一定大小片段回收片段与适当载体连接回收片段与适当载体连接所有重组所有重组DNA分子转入宿主细胞并扩增分子转入宿主细胞并扩增
44、基因组文库基因组文库Genomic library construction:分随机文库克隆数目计算随机文库克隆数目计算随机文库指代表基因组各部分随机文库指代表基因组各部分DNA的摩尔数相等。对的摩尔数相等。对于随机文库，有：于随机文库，有：ln(1-P)N =ln(1- )xyN: 克隆数目克隆数目P: 设定的概率值设定的概率值(如：如：0.99)x: 插入片段平均大小插入片段平均大小(1520kb)y: 植物基因组大小植物基因组大小(以以kb计计)如果插入片段平均大小为如果插入片段平均大小为20kb，某植物基因组大小，某植物基因组大小为为4x108bp，P=0.99时，根据上式，根据上式，
45、N1X101X105 5。含。含1X101X105 5个克隆的基因文个克隆的基因文库相当覆盖了相当覆盖了5 5倍的基因倍的基因组，在，在片段随机分布片段随机分布时，从文，从文库中找到任一序列的概率不低中找到任一序列的概率不低于于0.990.99。随机文库克隆数目计算随机文库指代表基因组各部分DNA的摩尔数植物基因组大小植物基因组大小 及克隆文库所需噬菌斑数及克隆文库所需噬菌斑数植物种类植物种类 基因组大小基因组大小(bp)(bp)a a 重组噬菌斑数重组噬菌斑数b b拟南芥拟南芥 7.7X10 7.7X107 7 2.1X10 2.1X104 4大豆大豆 8.7X10 8.7X108 8 2.
46、4X10 2.4X105 5菜豆菜豆 1.8X10 1.8X109 9 4.9X10 4.9X105 5碧东茄碧东茄 1.9X10 1.9X109 9 5.1X10 5.1X105 5烟草烟草 3.8X10 3.8X109 9 1.0X10 1.0X106 6玉米玉米 3.9X10 3.9X109 9 1.1X10 1.1X106 6小麦小麦 1.5X10 1.5X101010 4.1X10 4.1X106 6a a，基因组大小引自，基因组大小引自RogersRogers和和Bendich; b.Bendich; b.假设插入片段为假设插入片段为17kb,17kb,概率为概率为0.990.99
47、。 植物基因组大小 及克隆文库所需噬菌斑数植物种类 v(二二) 从从cDNA文库中获得目的基因文库中获得目的基因cDNA library :指含有一个机体某种特定细胞或特定状态下表达指含有一个机体某种特定细胞或特定状态下表达基因的全部基因的全部cDNA 克隆的群体克隆的群体cDNA library characters:不含内含子，用不含内含子，用mRNA经逆转录构建经逆转录构建cDNA library vectors:-gt10; -gt11; Ziplox et al(二) 从cDNA文库中获得目的基因cDNA librarycDNA library construction:分离分离mR
48、NARNase H水解去掉水解去掉mRNA以以oligo(dT)为引物，合成为引物，合成cDNA第一链第一链随机引物，随机引物，DNA pol I合成第二链合成第二链修齐两端，加人工接头，修齐两端，加人工接头，与载体连接，得到与载体连接，得到cDNA重组体，重组体，所有所有cDNA 重组体均转入宿主扩增重组体均转入宿主扩增cDNA 文库文库cDNA library construction:分离mRv(三三) 利用利用PCR技术获得目的基因技术获得目的基因采用采用T载体载体(AT克隆克隆)：pGEM-T vector; pMD18-T Vector 合成长度有限合成长度有限可人工设计相应的序列
49、，不必使用天然模板可人工设计相应的序列，不必使用天然模板v(四四) 人工合成目的基因人工合成目的基因(三) 利用PCR技术获得目的基因采用T载体(AT克隆)：p分子生物学-基因工程与基因体外表达课件Plasmid phage cosmid M13 phageCapacity 10 kb 22 kb 4050 kb 1 kb of cloninggDNA library - + + -cDNA library + + - -Subcloning + - - +Sequencing + + - +E coli expression + + - -二、依据基因克隆的目的选择和准备载体二、依据基因克隆
50、的目的选择和准备载体vCloning vectors in common use:Plasmid phage co(1) The ligation by cohesive endsAdvantage: easily linked Disadvantage: easily to be cycled self bidirection insertion(2) The ligation with artificial linker (3) The ligation with homopolymeric tail (4) The ligation by blunt ends High ATP con.
51、 T4 DNA ligase should be used三、选择适当的策略将三、选择适当的策略将DNA片段进行连接片段进行连接vMethods in common use:(1) The ligation by cohesive e(一一) 粘性末端的连接粘性末端的连接全同源粘性末端全同源粘性末端 最方便，但载体自身环化，并为双最方便，但载体自身环化，并为双向插入向插入5G3CTTAAppAATTC3G5GCTTAAppAATTCG5G3CTTAAppAATTC3G5例：用例：用EcoR I分别切割载体和目的分别切割载体和目的DNA：切割载体：切割载体：切割目的切割目的DNA：(一) 粘性末
52、端的连接全同源粘性末端 最方便，但载体自GCTTAAAATTCGAATTC3G55G3CTTAA双向插入示意图：双向插入示意图：GCTTAAAATTCGAATTC3G55G3CTTAAGCTTAAAATTCGA粘性末端的连接粘性末端的连接粘性末端的连接(二二) 用人工接头法克隆用人工接头法克隆cDNA连接酶连接酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶(二) 用人工接头法克隆cDNA连接酶碱性磷酸酶(三三) 同聚物接尾法克隆双链同聚物接尾法克隆双链DNA转化适当的宿主转化适当的宿主退火退火载体载体(三) 同聚物接尾法克隆双链DNA转化适当的宿主退火载体(一一) 转化转化(transformation ) 四、重组
53、四、重组DNA需要导入宿主细胞进行扩增需要导入宿主细胞进行扩增vMethods in common use:(二二) 感染感染(infection ) (三三) 转染转染(transfection ) (四四) 电穿孔电穿孔(electroporation) (一) 转化(transformation ) 四、重组DNv(一一) 转化是直接将转化是直接将DNA导入细菌的方法导入细菌的方法Transformation：指将质粒或其他外源指将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿导入处于感受态的宿主菌，并使其获得新的表型的过程。主菌，并使其获得新的表型的过程。 宿主菌：宿主菌：E coli感受态细
54、胞的制备：感受态细胞的制备：低温低温CaCl2处理，使细胞处理，使细胞通透性增加，易于摄取外源通透性增加，易于摄取外源DNA，这种细胞称，这种细胞称为感受态细胞为感受态细胞(competent cell)(一) 转化是直接将DNA导入细菌的方法Transformav(二二) 感染是利用噬菌体将外源感染是利用噬菌体将外源DNA导入宿主导入宿主Infection：指指噬菌体、粘性质粒或真核细胞病毒为载体噬菌体、粘性质粒或真核细胞病毒为载体的重组的重组DNADNA分子，在体外经过包装成具有感染分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，然后感染适当宿主能力的病毒或噬菌体颗粒，然后感染适当宿
55、主细胞的过程细胞的过程 (二) 感染是利用噬菌体将外源DNA导入宿主Infectio用于包装的宿主菌：用于包装的宿主菌：琥珀突变株琥珀突变株Dam溶菌物：溶菌物：含头部蛋白含头部蛋白突变株突变株Eam溶菌物：溶菌物：含尾部蛋白含尾部蛋白Dam溶菌物溶菌物 + Eam溶菌物溶菌物 + DNA重重组体体包装噬菌体包装噬菌体重组有外源重组有外源DNA的逆转录病毒载体的逆转录病毒载体感染感染辅助病毒辅助病毒-2-2细胞胞包装成病毒颗粒包装成病毒颗粒有感染能力有感染能力用于包装的宿主菌：琥珀突变株Dam溶菌物：含头部蛋白突变v(三三) 转染是将外源转染是将外源DNA导入真核细胞的方法导入真核细胞的方法T
56、ransfection：指真核细胞主动摄取或被动导入外源指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段片段而获得新的表型的过程而获得新的表型的过程Methods：电穿孔电穿孔磷酸钙共沉淀法磷酸钙共沉淀法脂质体融合法脂质体融合法进入细胞进入细胞的的DNA存存在方式在方式染色体外染色体外整合至宿主整合至宿主基因组中基因组中(三) 转染是将外源DNA导入真核细胞的方法Transfec(一一) 遗传学方法遗传学方法五、重组五、重组DNA导入宿主后筛选与鉴定导入宿主后筛选与鉴定vMethods in common use:(二二) 免疫学方法免疫学方法 -检测表达产物检测表达产物(三三) 核酸杂交核酸杂交(
57、四四) PCR技术技术抗性标记抗性标记表型标记表型标记插入失活插入失活互互补补(五五) 酶切鉴定酶切鉴定Go to 23Go to 103Go to 104Go to 105(一) 遗传学方法五、重组DNA导入宿主后筛选与鉴定Meth第四节第四节 真核细胞基因转染真核细胞基因转染Transfection：指真核细胞主动摄取或被动导入外源指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段片段而获得新的表型的过程而获得新的表型的过程一、真核细胞转染的方法与基本原理一、真核细胞转染的方法与基本原理二、转染细胞可利用抗性标记进行筛选二、转染细胞可利用抗性标记进行筛选第四节 真核细胞基因转染Transfecti
58、on ：指真核细(一一) 磷酸钙共沉淀示介导基因转染磷酸钙共沉淀示介导基因转染一、真核细胞转染的方法与基本原理一、真核细胞转染的方法与基本原理vMethods in common use:(二二) 电穿孔法介导基因转染电穿孔法介导基因转染 (electroporation)(三三) DEAE-葡聚糖法介导基因转染葡聚糖法介导基因转染 (DEAE-dextran)(四四) 脂质体介导基因转染脂质体介导基因转染 (liposome )(五五) 显微注射法显微注射法( microinjection )Calcium phosphate co-precipitation (1%)(一) 磷酸钙共沉淀示
59、介导基因转染一、真核细胞转染的方法与基 Electroporation(电穿孔法电穿孔法)Extraneous DNAHost cellsElectricity with high frequency Electroporation(电穿孔法)Extraneo(一一) 利用利用TKTK- -细胞突变株进行转染细胞筛选细胞突变株进行转染细胞筛选 二、转染细胞可利用抗性标记进行筛选二、转染细胞可利用抗性标记进行筛选vMethods in common use:(二二) 药物筛选转染细胞药物筛选转染细胞稳定转染细胞株的筛选稳定转染细胞株的筛选(一) 利用TK-细胞突变株进行转染细胞筛选 二、转染细胞
60、可v( (一一) ) 利用利用TKTK- -细胞突变株进行转染细胞筛选细胞突变株进行转染细胞筛选 Principle：TK (thymidine kinase) 是催化核苷酸补救合是催化核苷酸补救合成的关键酶成的关键酶氨基喋呤氨基喋呤(aminopterin, A )是从头合成途径的是从头合成途径的抑制剂，抑制剂，A的加入使细胞主要依赖于补救合成的加入使细胞主要依赖于补救合成TK- -选择系统选择系统Host -TK - - 细胞株细胞株(TK(TK表达缺陷表达缺陷) )培养基培养基 -HAT培养基培养基H, hypoxanthine; A, aminopterin; T, thymine(一
61、) 利用TK-细胞突变株进行转染细胞筛选 PrincipTk -氨基蝶呤（氨基蝶呤（A）处理）处理抑制抑制二氢叶二氢叶酸还原酶酸还原酶四氢叶酸四氢叶酸逐渐耗尽逐渐耗尽dUMPdATPdCTP(-)(+)HdATPdCTPTdTTPTk +培养基含培养基含H、TA细胞不细胞不能存活能存活细胞能细胞能够存活够存活补救合成补救合成tk基因导基因导入入tk - 细胞细胞细胞能细胞能够存活够存活在含在含HAT培养基中培养基中tk选择系统原理图解选择系统原理图解(越过越过A的抑制的抑制)Tk -氨基蝶呤（A）处理抑制二氢叶四氢叶酸dUMPdATPThe screening with antibiotics
62、, G418 (geneticin, 新霉素衍生物新霉素衍生物)v( (二二) ) 药物筛选转染细胞药物筛选转染细胞 The most used antibiotic marker: neor The screening with antibiotics新霉素抗性选择系统新霉素抗性选择系统新霉素新霉素干扰干扰原核生物蛋白合成原核生物蛋白合成不影响不影响真核生物蛋白合成真核生物蛋白合成新霉素类新霉素类似物似物G418干扰干扰原核生物蛋白合成原核生物蛋白合成干扰干扰真核生物蛋白合成真核生物蛋白合成细菌新霉素细菌新霉素抗性基因抗性基因neor表达氨基糖苷磷酸表达氨基糖苷磷酸转移酶转移酶(APH)使使
63、G418失活失活表达表达neor 的细胞可在含的细胞可在含G418的培养基中的培养基中存活存活新霉素抗性选择系统新霉素干扰原核生物蛋白合成不影响真核生物蛋第五节第五节 利用重组利用重组DNA技术进行基因改造技术进行基因改造vMethods in common use:定点诱变技术定点诱变技术寡核苷酸介导定点诱变技术寡核苷酸介导定点诱变技术PCR介导定点诱变技术介导定点诱变技术目的目的改变基因的一级序列特征改变基因的一级序列特征第五节 利用重组DNA技术进行基因改造Methods in一、对特定基因可进行定点诱变一、对特定基因可进行定点诱变What is the site-directed mu
64、tagenesis (目的基因的定点诱变目的基因的定点诱变)?It means the process that the one or more sites of gene be replaced or deleted by artificial method.一、对特定基因可进行定点诱变What is the site(一一) 带突变位点的寡核苷酸可介导定点诱变带突变位点的寡核苷酸可介导定点诱变 The site-directed mutagenesis mediated by oligonucleotideCharacters:It can cause finely the mutagen
65、esis at the special site according to the design of researchers(一) 带突变位点的寡核苷酸可介导定点诱变 The siteProcesses:1) The use of Klenow fragment and a primer with an incorrect paired base, M13 as single strand template2) To extend the primer to get a heterozygous double strands DNA3) To transform the heterozygo
66、us DNA into E coli, the wild DNA and mutated DNA will be yielded4) To screen and decide the mutated DNA，further research the mutated DNAProcesses:1) The use of Klenow诱变寡核诱变寡核苷酸引物苷酸引物单链单链M13模板模板Klenow fragment, dNTP, T4 DNA pol杂交双链杂交双链DNA转化转化E coli琼脂平皿琼脂平皿标记诱变寡核苷酸原位标记诱变寡核苷酸原位分子杂交放射自显影分子杂交放射自显影 寡核苷酸介导
67、的寡核苷酸介导的定点诱变基本实定点诱变基本实验步骤验步骤理论上最高诱变效率只有理论上最高诱变效率只有50%诱变寡核苷酸引物单链M13模板Klenow fragment(二二) 含含U模板可以提高寡核苷介导定点诱变效率模板可以提高寡核苷介导定点诱变效率Principle:建立含建立含U 单链模板单链模板(U取代取代T)-正链正链合成杂合双链合成杂合双链DNA杂合双链杂合双链DNA转化野生型转化野生型E coli中中尿嘧啶核苷酶尿嘧啶核苷酶降解含降解含U的正链的正链带诱变位点的负链能保存，合成双链带诱变位点的负链能保存，合成双链DNA(突突变体变体突变率突变率90%)(二) 含U模板可以提高寡核苷
68、介导定点诱变效率Princip诱变寡核诱变寡核苷酸引物苷酸引物Klenow fragment, dNTP, T4 DNA pol转化野生型转化野生型E coli，含含尿嘧啶核苷酶尿嘧啶核苷酶，可降解含可降解含U模板模板标记诱变寡核苷酸原位标记诱变寡核苷酸原位分子杂交放射自显影分子杂交放射自显影 U模板介导的定模板介导的定点诱变基本实验点诱变基本实验步骤步骤含突变体的含突变体的负链保负链保存存下来并进行复制下来并进行复制扩增，筛选鉴定扩增，筛选鉴定突变率突变率90%单链单链M13模板模板UUUUUUU杂交双链杂交双链DNAUUUUUUU诱变寡核苷酸引物Klenow fragment, dNTP,
69、(三三) PCR技术适合进行基因的定点诱变技术适合进行基因的定点诱变Principle(两对引物，三次两对引物，三次PCR):一对常规引物一对常规引物a、d + 一对带诱变点的引物一对带诱变点的引物b、ca + b 及及d + c分别扩增出两个带突变点的片段分别扩增出两个带突变点的片段上述两个片段等量混合，变性、退火上述两个片段等量混合，变性、退火用用Klenow DNA聚合酶补齐聚合酶补齐利用利用a、d引物对进行引物对进行PCR扩增，即得所需片扩增，即得所需片段段(三) PCR技术适合进行基因的定点诱变Principle(5533abcd55335533555533ad5353PCR1PCR
70、2变性，退火变性，退火Klenow fragment, dNTPPCR3图图8-8PCR介导的定点诱变法介导的定点诱变法5533abcd553355335二、利用基因定点诱变技术改变基因工程二、利用基因定点诱变技术改变基因工程蛋白特性蛋白特性目的目的使工业酶具有更好的理化特性便于应用使工业酶具有更好的理化特性便于应用使临床生物蛋白或多肽制剂疗效高副作用小使临床生物蛋白或多肽制剂疗效高副作用小获得更多对人类有益的蛋白或多肽产物获得更多对人类有益的蛋白或多肽产物For example: Insulin二、利用基因定点诱变技术改变基因工程蛋白特性目的使工业酶具有Gene engineering In
71、sulin1. 定点诱变制备长效定点诱变制备长效Insulin(半衰期延至半衰期延至35.3h)2. 定点诱变制备快速吸收定点诱变制备快速吸收Insulin(减少六聚体减少六聚体形成形成)3. 定点诱变增加定点诱变增加Insulin与受体的亲和力与受体的亲和力B27 ThrArg, C端氨基化；端氨基化；A21 Asn GlyB10 HisAsp, 体外活性体外活性较野生型提高野生型提高5倍倍Gene engineering Insulin1. 定点诱第六节第六节 克隆基因在适当宿主细胞的表达克隆基因在适当宿主细胞的表达vExpression systemsExpression vectors
72、, Appropriate host cellsAim: To get a lot of proteins or polypeptidesThe expression systems in common use:E coli expression systemMammal animal expression systemInsect expression systemYeast expression system第六节 克隆基因在适当宿主细胞的表达Expression 一、大肠杆菌一、大肠杆菌( E coli )表达系统表达系统Characters：目标基因表达水平高、遗传背景清楚、易于培目标
73、基因表达水平高、遗传背景清楚、易于培养（培养方法简单、生长快、培养周期短、抗养（培养方法简单、生长快、培养周期短、抗污染能力强）、成本低污染能力强）、成本低一、大肠杆菌( E coli )表达系统Characters(一一)表达外源基因需要一些基本要素表达外源基因需要一些基本要素1. 来自真核细胞的基因需要适当改选来自真核细胞的基因需要适当改选2. 必须选用必须选用E coli vectors3. 目的基因与载体可用不同方式连接目的基因与载体可用不同方式连接4. 选择适当的受体菌和诱导条件选择适当的受体菌和诱导条件表达非融合蛋白；表达融合蛋白表达非融合蛋白；表达融合蛋白(一)表达外源基因需要一
74、些基本要素1. 来自真核细胞的基因需If the target gene come from eukaryote, it should be cDNA. Why?1. 来自真核细胞的基因需要适当改选来自真核细胞的基因需要适当改选The signal peptide of secretary protein has to be deleted tooThe 5-end sequence before ATG on cDNA is useless, so it has to be deleted.If the target gene come from eThe vectors must be E
75、 coli expression vectors, which contain the promoters ( PL, tac, T7 ) recognized by DDRP in E coli and SD sequence.Why?2. 必须选用必须选用E coli vectorsPromoters Effectively induce transcription转录效应强转录效应强Can be controlled easily 能被有效控制能被有效控制The vectors must be E coli exp53SDTarget genea. To express the non-
76、fusion proteins Use Nde I ( CATATG ) or Nco I ( CCATGG) to bring in ATG SDTarget geneFragment of structure gene of prokaryote3. 目的基因与载体可用不同方式连接目的基因与载体可用不同方式连接The models of linkage:b. To express the fusion proteins 53SDTarget genea. To expressFusion protein:NThe peptide of target genepeptide of proka
77、ryoteCIt means that the peptide expressed consists of N-end of peptide coded by prokaryote DNA and C-end of peptide coded by the cloning fragment of eukaryote DNA, which is termed as fusion protein. Fusion protein:NThe peptide ofThe advantages of fusion protein:a. More stableb. With the signal pepti
78、de, the secretary product could be yieldedc. It can be purified by affinity chromatographyd. The peptide of prokaryote can be cut out by proteinase, and then the peptide of eukaryote can be released in natural formThe advantages of fusion prote(二二) 采用适当措施可提高外源基因表达水平采用适当措施可提高外源基因表达水平1. 多种策略提高翻译水平多种策略
79、提高翻译水平2. 将细菌生长与外源基因表达在时间上分开将细菌生长与外源基因表达在时间上分开3. 采用不同措施提高表达蛋白的稳定性采用不同措施提高表达蛋白的稳定性表达融合蛋白，采用突变菌株，表达分泌蛋白表达融合蛋白，采用突变菌株，表达分泌蛋白调整调整SD与与ATG之间距离，增加之间距离，增加mRNA稳定性，稳定性，点突变改变碱基点突变改变碱基(二) 采用适当措施可提高外源基因表达水平1. 多种策略提高二、哺乳动物表达系统二、哺乳动物表达系统Characters：Eukaryote expression systems are needed The gene to be expressed can
80、 come from genome DNA or cDNA Why?二、哺乳动物表达系统Characters ：How can the vectors be transformed into host cells?Plasmid vectors:Calcium phosphate co-precipitation; Electroporation; DEAE-Dextran; Microinjection; Make the extraneous DNA into cells mediated by liposome Virus vectors:The virus vectors have t
81、o be introduced into wrap cells, then the pseudo-virus particles would be produced and used to infect the host cells.How can the vectors be transfoThe screening markers:Antibiotics genes ( neor )-code the aminosaccharide phosphate transportase -make G418 lost activityAdvantages:The expression produc
82、ts have scarcely effect on host cells, and not easily be degraded. The screening markers:Advantag(1) Insect expression system1) Drosophila melanogaster (Fruit fly) expression system (DES)(果蝇表达系统果蝇表达系统)2) Bacilliform virus expression system(杆状杆状病毒表达系统病毒表达系统)三、其他真核表达系统三、其他真核表达系统(2) Microzyme ( yeast )
83、 expression system (啤酒酵母，啤酒酵母，Saccharomyces cerevisiae)Go to 101(1) Insect expression system三、第七节第七节 电子克隆辅助基因克隆电子克隆辅助基因克隆vIn silico cloning 通过对基因数据库进行序列搜索、对比分析、通过对基因数据库进行序列搜索、对比分析、拼接整合，预测新的、假定的全长基因，然后拼接整合，预测新的、假定的全长基因，然后通过分子生物学实验方法，加以证实，并从相通过分子生物学实验方法，加以证实，并从相应组织、细胞中获得这种基因，称为电子克隆应组织、细胞中获得这种基因，称为电子克隆
84、In silico cloningNote: In silico is not the real gene cloning第七节 电子克隆辅助基因克隆In silico cloniSummary vThe basic elements for gene cloning vThe basic process for gene cloning vThe gene site-directed mutagenesisvThe gene expressionvIn silico cloningSummary The basic elements forFor example (Genome based)
85、以小麦胞质以小麦胞质G-6-PD cDNA序列为信息探针序列为信息探针在在GenBank水稻水稻nr数据库中找高度同源的基因组序列数据库中找高度同源的基因组序列人工序列拼接人工序列拼接RT-PCR确认确认得到水稻得到水稻G-6-PD全长全长cDNA水稻水稻G-6-PD cDNA的电子克隆的电子克隆根据根据intron的的GUAG编码规则，确定编码规则，确定I and E的排布的排布For example (Genome based)以小麦胞objective: In silico cloning aims to provide a bioinformatics approach to find
86、 the most promising candidate genes in a candidate region indicated by quantitative trait loci (数量性状基因座位,数量性状基因定位, QTLs). As there are usually hundreds of genes in a QTL region, narrowing them down to a smaller number is of the most importance to proceed to further validation steps. Here we represen
87、t our strategy to rank them by utilizing various biological knowledge such as gene annotations, MeSH terms and metabolic pathways.objective: In silico cloning a克隆的克隆的HBV DNA分离编码分离编码HBsAg序列序列酵母表达载体酵母表达载体连接连接酵母启动子酵母启动子酵母转录终止子酵母转录终止子细菌复制起点细菌复制起点AMPR酵母复酵母复制起点制起点LEU2转化酵转化酵母细胞母细胞在缺乏在缺乏Leu的培养的培养基中生长，选出含基中生
88、长，选出含载体的酵母细胞载体的酵母细胞发酵培养发酵培养离心分离离心分离破坏酵母细胞破坏酵母细胞提纯提纯HBsAg粒子粒子Turn to 99克隆的HBV 分离编码HBsAg序列酵母表达载体连接酵母启动DNA重组重组 DNA recombination不同来源的不同来源的DNA分子通过共价连接重新组合成分子通过共价连接重新组合成为一新的为一新的DNA分子，分子， 这一过程称之这一过程称之重组重组DNA (Recombinant DNA)The new DNA molecule that has been made by joining the DNA fragments is called a
89、recombinant DNA molecule or recombinant DNADNA重组 DNA recombination重组DNDNA重组技术重组技术 DNA recombination technique 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（目的基因）与载体传物质（目的基因）与载体DNA结合成为一具结合成为一具有自我复制能力的有自我复制能力的DNA分子，继而转化或转染分子，继而转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子拷
90、贝，分子拷贝，这一技术即称为这一技术即称为DNA recombination technique、 DNA cloning or Gene cloning, Molecular cloning.DNA重组技术 DNA recombination t基因工程基因工程 Genetic engineering 将基因进行克隆，并利用克隆的基因表达、将基因进行克隆，并利用克隆的基因表达、制备特定的蛋白或多肽产物，制备特定的蛋白或多肽产物， 或定向改造细胞或定向改造细胞乃至生物个体的特性所用的方法及相关的工作乃至生物个体的特性所用的方法及相关的工作统称为基因工程统称为基因工程(genetic engin
91、eering )基因工程 Genetic engineering含重组体的为含重组体的为白白色菌落，不含者为色菌落，不含者为蓝蓝色菌落色菌落Turn to 64含重组体的为白色菌落，不含者为蓝色菌落Turn to 64菌落原位杂交菌落原位杂交Turn to 64菌落原位杂交Turn to 64M1 23 456 78 9 101kb图2b. 经EcoR I酶切的阳性质粒电泳图M-1Kb DNA ladder110, 经EcoR I酶切的阳性质粒M123456 78 9 10图2a. 阳性克隆质粒电泳图M-1Kb DNA ladder110, 阳性质粒A. before cut with REB
92、. after cut with RE 酶切鉴定酶切鉴定Turn to 64M123456789101kb图2b. 经EcoR I酶切回文诗欣赏回文诗欣赏 有一次苏轼专程上门拜访秦观。家人告诉苏轼，他出外游玩，很可能上有一次苏轼专程上门拜访秦观。家人告诉苏轼，他出外游玩，很可能上佛印和尚寺里去了。于是苏轼写信去询问他的情况。秦少游见苏轼来信佛印和尚寺里去了。于是苏轼写信去询问他的情况。秦少游见苏轼来信后，便写了一封只有后，便写了一封只有14字的怪信遣人带回给苏轼。信上的字的怪信遣人带回给苏轼。信上的14个字排成一个字排成一圈：圈： 暮暮已赏已赏时花时花醒归醒归微去微去力马力马酒如酒如飞飞苏轼看
93、后，连声叫好。原来，秦观写的是一首回文诗，诗中描述了他在外出游玩苏轼看后，连声叫好。原来，秦观写的是一首回文诗，诗中描述了他在外出游玩的生活和情趣。其内容为：的生活和情趣。其内容为：“赏花归去马如飞，去马如飞酒力赏花归去马如飞，去马如飞酒力微。酒力微醒时已暮，醒时已暮赏花归。微。酒力微醒时已暮，醒时已暮赏花归。”14个字组成个字组成了一首七言绝句，每个字出现两次，文字处理技巧高超。了一首七言绝句，每个字出现两次，文字处理技巧高超。 回文诗欣赏 有一次苏轼专程上门拜访秦观。家人告诉苏轼，他回文诗欣赏回文诗欣赏v清代女诗人吴绛雪写的咏四季的四首回文诗，春夏秋冬，清代女诗人吴绛雪写的咏四季的四首回文诗，春夏秋冬，每首仅用十个字，却是七言绝句每首仅用十个字，却是七言绝句. 一首诗从一首诗从10个字中回环出个字中回环出来，描写四季自然特色分明，光色陆离，让人回味无穷。被来，描写四季自然特色分明，光色陆离，让人回味无穷。被世人誉为回文诗珍品。其中，世人誉为回文诗珍品。其中，夏夏更是公认的一枝独秀。更是公认的一枝独秀。v夏夏香莲碧水动风凉，水动风凉夏日长。香莲碧水动风凉，水动风凉夏日长。长日夏凉风动水，凉风动水碧莲香。长日夏凉风动水，凉风动水碧莲香。 Turn to 11 回文诗欣赏清代女诗人吴绛雪写的咏四季的四首回文诗，春夏秋冬
