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1、第十一章第十一章 无机基质高效色谱填料无机基质高效色谱填料微孔型微孔型 大孔型大孔型微孔微孔微孔微孔薄膜型薄膜型 表面多孔型表面多孔型离子交换层离子交换层惰性核惰性核惰性核惰性核离子交换剂硅胶层涂覆离子交换剂硅胶层涂覆HPLCHPLC中常用的几种微粒类型中常用的几种微粒类型硅胶硅胶可控孔径玻璃可控孔径玻璃其它：氧化铝、氧化锆、氧化钛、其它：氧化铝、氧化锆、氧化钛、碳和石墨微球。碳和石墨微球。制备制备: :制成适宜的球形或无定形颗粒制成适宜的球形或无定形颗粒, ,化学键合或涂层法改性。化学键合或涂层法改性。第一节第一节 无机基质无机基质一一. .硅胶硅胶: :表面含丰富表面含丰富硅醇基或硅羟基硅
2、醇基或硅羟基, , 可化学键合或改性可化学键合或改性; ; 表面存在大量物理吸附水表面存在大量物理吸附水, ,增加处理或修饰复杂性。增加处理或修饰复杂性。1.1.化学性质化学性质: :多孔二氧化硅多孔二氧化硅化学性质稳定化学性质稳定,pH,pH适应范围适应范围1-91-9，安全，安全pHpH范围为范围为2-82-8。晶型二氧化硅晶型二氧化硅表面可能仅有自由硅羟基；表面可能仅有自由硅羟基；无定形硅胶无定形硅胶则有自由硅羟基、邻位硅羟基、氢键则有自由硅羟基、邻位硅羟基、氢键结合水或物理吸附水。结合水或物理吸附水。HPLC硅胶担体的表面硅胶担体的表面物理吸附水的去除物理吸附水的去除-是硅胶衍生反应中
3、不可或缺的一步是硅胶衍生反应中不可或缺的一步。因为物理吸附水与硅羟基竞争硅烷化试因为物理吸附水与硅羟基竞争硅烷化试剂的反应剂的反应, ,可能引起键合率的降低和非可能引起键合率的降低和非特异性吸附的增加特异性吸附的增加, ,降低填料的性能。降低填料的性能。一般通过一般通过加热或真空下热处理加热或真空下热处理去去除物理吸附水。除物理吸附水。2.2. 物理性质物理性质: : 颗粒的形状大小、孔的结构、孔径及其颗粒的形状大小、孔的结构、孔径及其分布、总孔容、比表面积、高机械强度分布、总孔容、比表面积、高机械强度以以A A型与型与B B型硅胶担体的色谱柱分离三环抗抑郁药的比较型硅胶担体的色谱柱分离三环抗
4、抑郁药的比较色谱柱：色谱柱：15150.46 cm0.46 cm；流动相：乙腈；流动相：乙腈-0.025M-0.025M磷酸钠缓冲液（磷酸钠缓冲液（3030：7070），），p p H2.5+H2.5+三乙胺与三氟醋酸各三乙胺与三氟醋酸各0.2%0.2%；流速：；流速：1.0ml/min1.0ml/min；40400 0C C；254nm254nm检测；进样检测；进样5L5L。 A A型：纯度不高的酸性硅胶型：纯度不高的酸性硅胶B B型：高纯度的弱酸性硅胶型：高纯度的弱酸性硅胶3.3.多孔硅胶的制法多孔硅胶的制法: :将水玻璃将水玻璃( (硅酸钠水溶液硅酸钠水溶液) )酸化酸化, ,形成形成S
5、iOSiO2 2胶体溶液胶体溶液, ,以各种方法聚集成球形粒子以各种方法聚集成球形粒子, ,并并转化成干胶转化成干胶; ;另外另外, ,也可利用正硅酸酯的缩聚和也可利用正硅酸酯的缩聚和SiOSiO2 2气气溶胶水溶液喷雾干燥法。溶胶水溶液喷雾干燥法。粒度分布及杂质的控制是难点！粒度分布及杂质的控制是难点！堆砌硅珠法堆砌硅珠法尿素、甲醛相分离聚合尿素、甲醛相分离聚合：将适宜浓度的硅溶胶：将适宜浓度的硅溶胶与一定比例的尿素和甲醛配成水溶液，搅拌均匀令与一定比例的尿素和甲醛配成水溶液，搅拌均匀令其产生其产生缩聚反应缩聚反应。待反应进行到一定程度后，便会。待反应进行到一定程度后，便会产生产生相分离相分
6、离而从水溶液中而从水溶液中沉淀出沉淀出聚集硅微珠聚集硅微珠与与尿素尿素甲醛树脂甲醛树脂的的复合球复合球。将这种复合球收集、洗涤并。将这种复合球收集、洗涤并在高温炉中在高温炉中煅烧煅烧，令树脂分解，令树脂分解逸去逸去，剩下的就是多，剩下的就是多孔硅胶微球，其直径可以控制在孔硅胶微球，其直径可以控制在4 45 5m m或或7 78 8m m之之间。通过二次缩聚反应，直径可加大到间。通过二次缩聚反应，直径可加大到1515m m。二二. .可控孔径玻璃可控孔径玻璃: :含含硼的硼的NaNa2 2O-BO-B2 2O O3 3-SiO-SiO2 2系玻璃系玻璃, ,热处理时会热处理时会相分离，生成相分离
7、，生成溶于酸的溶于酸的NaNa2 2O-BO-B2 2O O3 3相相及及不溶不溶于酸的于酸的高硅相高硅相。以酸处理的方法，将酸可。以酸处理的方法，将酸可溶相浸析出来溶相浸析出来, ,剩下的高硅相就成了剩下的高硅相就成了可控玻可控玻璃璃(SiO(SiO2 2) )。控制玻璃的组成及处理条件可。控制玻璃的组成及处理条件可控制生成可控孔径玻璃的孔径、孔容及比控制生成可控孔径玻璃的孔径、孔容及比表面积。表面积。1.1.化学性质化学性质: :表面具有游离硅羟基表面具有游离硅羟基, ,可以通过各种化学修可以通过各种化学修饰而得到不同官能团的表面饰而得到不同官能团的表面。缺点缺点：游离硅羟基可能：游离硅羟
8、基可能导致非特异性吸附导致非特异性吸附及蛋白质失活及蛋白质失活; ;适应的适应的pHpH范围有一定的局限范围有一定的局限; ;制造成本较高。制造成本较高。2.2.物理特性物理特性: :机械强度高机械强度高, ,可耐受剧烈、反复的处可耐受剧烈、反复的处理和操作，耐压力强。理和操作，耐压力强。孔径分布窄而均匀。孔径分布窄而均匀。3.3.制造制造: :采用普通玻璃制造工艺：采用普通玻璃制造工艺：精细选择并精细选择并控制适宜的相分离温度与时间控制适宜的相分离温度与时间。孔。孔径一般控制在径一般控制在25nm25nm到到100nm100nm为宜。为宜。三、其它三、其它氧化铝：氧化铝：主要是主要是AlAl
9、2 2O O3 3, ,作为色谱固定相，作为色谱固定相，主要用于主要用于小分子有机物等的分离小分子有机物等的分离。限制其。限制其应用的因素在于其难以像应用的因素在于其难以像SiOSiO2 2那样通过键合那样通过键合而得到适应不同分离模式的固定相。而得到适应不同分离模式的固定相。氧化锆：氧化锆：利用与硅胶键合相类似的方法，可利用与硅胶键合相类似的方法，可以对其进行表面修饰。以对其进行表面修饰。第二节第二节 硅胶的化学修饰与改性硅胶的化学修饰与改性一、表面硅羟基的化学修饰（主要途径）：一、表面硅羟基的化学修饰（主要途径）：1 1、氯化反应：、氯化反应：可以将硅羟基转化成硅氯基，可以将硅羟基转化成硅
10、氯基，硅氯基性质活泼可以与各种化合物反应而引硅氯基性质活泼可以与各种化合物反应而引入相应的基团。这种方法引入的基团是入相应的基团。这种方法引入的基团是单分单分子层子层的，的，具有较好的传质能力和色谱性能具有较好的传质能力和色谱性能，但成本较高。但成本较高。2 2、氯硅烷与硅羟基的反应：、氯硅烷与硅羟基的反应：通过氯硅烷可以通过氯硅烷可以将各种烷基链引入硅将各种烷基链引入硅胶表面胶表面。氯硅烷包括一氯代型，二氯。氯硅烷包括一氯代型，二氯代型和三氯代型等。代型和三氯代型等。P231P2313 3、通过烷氧基硅烷与硅羟基的反应：、通过烷氧基硅烷与硅羟基的反应：烷氧基硅烷与硅胶进行缩合反应，使烷氧基硅
11、烷与硅胶进行缩合反应，使硅胶硅胶表面带上环氧基或氨基等基团表面带上环氧基或氨基等基团，在此基础，在此基础上可以很方便地进一步进行反应或修饰。上可以很方便地进一步进行反应或修饰。这一键合反应可以在水相，也可以在有机这一键合反应可以在水相，也可以在有机介质中进行。介质中进行。（a a）表面硅羟基与氯二甲基硅烷的反应；）表面硅羟基与氯二甲基硅烷的反应；（b b）表面硅羟基与三官能团硅烷的反应；）表面硅羟基与三官能团硅烷的反应；（c c）表面硅羟基与三官能团烷基硅烷的反应）表面硅羟基与三官能团烷基硅烷的反应与硅胶担体共价键合硅烷的各种类型与硅胶担体共价键合硅烷的各种类型二、包敷与涂层：二、包敷与涂层：
12、1.1.可通过不同的途径制备稳定的聚合物涂层可通过不同的途径制备稳定的聚合物涂层。常常将选择的聚合物、寡聚物或单体以适宜溶剂将选择的聚合物、寡聚物或单体以适宜溶剂制成溶液，均匀分布于无机基质的全部表面上，制成溶液，均匀分布于无机基质的全部表面上，蒸去溶剂后，令高聚物或单体聚合，形成致密蒸去溶剂后，令高聚物或单体聚合，形成致密的聚合物涂层。的聚合物涂层。2.2.亦可亦可将将含双键的聚合物含双键的聚合物涂于硅胶表面，使其表涂于硅胶表面，使其表面带上双键，使其于面带上双键，使其于随后涂敷上去的第二单体随后涂敷上去的第二单体进行共聚。进行共聚。还可以还可以将含有双键的不饱和聚合物将含有双键的不饱和聚合
13、物涂于硅胶表面，以涂于硅胶表面，以自由基引发进一步交联自由基引发进一步交联，以，以获得理化性质更稳定的涂层。获得理化性质更稳定的涂层。三、整体修饰：三、整体修饰：指利用具有不同官能团的指利用具有不同官能团的卤代硅烷卤代硅烷或或烷氧基硅烷烷氧基硅烷的的水解、缩聚反应水解、缩聚反应，直接，直接制出空间交联型、含不同制出空间交联型、含不同R R基的硅胶。基的硅胶。四、硅烷化试剂：四、硅烷化试剂：氯硅烷：氯硅烷：容易和空气中微量水反应，容易和空气中微量水反应，放出放出HClHCl气，对环境造成危害。气，对环境造成危害。烷氧基硅烷：烷氧基硅烷：对环境和人体的危害性对环境和人体的危害性小。广泛应用。小。广
14、泛应用。各类无机色谱填料各类无机色谱填料正相色谱填料正相色谱填料反相色谱填料反相色谱填料凝胶过滤色谱填料凝胶过滤色谱填料高效离子交换色谱填料高效离子交换色谱填料高效亲和色谱填料高效亲和色谱填料高效疏水色谱填料高效疏水色谱填料第三节第三节 正相色谱填料正相色谱填料液相色谱分正相和反相色谱液相色谱分正相和反相色谱（依据相间的相对极性依据相间的相对极性） 正相正相：固定相极性大于流动相极性，：固定相极性大于流动相极性， 适用于非极性至中等极性的中小分子化合物适用于非极性至中等极性的中小分子化合物的分离，如脂溶性维生素、甾体激素、医药等的分离，如脂溶性维生素、甾体激素、医药等的分离分析。的分离分析。
15、反相反相：固定相极性小于流动相极性。：固定相极性小于流动相极性。正相色谱正相色谱液固吸附色谱液固吸附色谱柱填料：吸附剂，表面分布有活性吸附位点；柱填料：吸附剂，表面分布有活性吸附位点；竞争吸附：溶剂溶质分子，溶质溶质分子竞争吸附：溶剂溶质分子，溶质溶质分子 柱内保留时间差异柱内保留时间差异 物质分离！物质分离！1.1.硅胶硅胶 吸附色谱中吸附色谱中最常用最常用。但样品呈碱性时，。但样品呈碱性时，会造成严重吸附，溶质峰拖尾或难以洗脱，会造成严重吸附，溶质峰拖尾或难以洗脱，可选用可选用AlAl2 2O O3 3。 Al Al2 2O O3 3对于不饱和化合物，特别是芳香族对于不饱和化合物，特别是芳
16、香族化合物多核芳烃的保留能力较强，芳香异化合物多核芳烃的保留能力较强，芳香异构体可得到良好分离。构体可得到良好分离。硅胶硅胶 100-200100-200目目2.5KG 2.5KG 生产商生产商:Fisher :Fisher 产品价格产品价格:4500:4500元（元（RMBRMB）化学键合固定相：化学键合固定相：将各种不同有机基团通过化学反应键合到将各种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面的一种方法载体表面的一种方法。它代替了固定液的。它代替了固定液的机械涂渍，它的出现是液相色谱法的一个机械涂渍，它的出现是液相色谱法的一个重大突破。它是目前应用最广泛的一种固重大突破。它是目前应用最广泛的一
17、种固定相。据统计，约有定相。据统计，约有3/43/4以上的分离问题是以上的分离问题是在在化学键合固定相化学键合固定相上进行的。上进行的。 2.2.极性键合相填料极性键合相填料 键合固定相类型：键合固定相类型： 用来制备键合固定相的载体，几乎都用用来制备键合固定相的载体，几乎都用硅胶硅胶。利用硅胶表面的。利用硅胶表面的硅醇基硅醇基(Si(Si一一OH)OH)与与有机分有机分子子可成键可成键, ,即可得到各种性能的固定相。一般分即可得到各种性能的固定相。一般分3 3类：类：（1 1）疏水基团疏水基团 如不同链长的烷烃（如不同链长的烷烃（C8C8和和C18C18）和苯）和苯基。基。（2 2）极性基团
18、极性基团 如氨丙基、氰乙基、醚和醇等。如氨丙基、氰乙基、醚和醇等。（3 3）离子交换基团离子交换基团 如作为阴离子交换基团的胺基、如作为阴离子交换基团的胺基、季镀盐；作为阳离子交换季镀盐；作为阳离子交换 基团的磺酸等。基团的磺酸等。键合固定相成键类型键合固定相成键类型 a. a. 硅氧碳键型：硅氧碳键型： SiSiO OC C b. b. 硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：SiSiO OSi Si C C 稳稳定定，耐耐水水、耐耐光光、耐耐有有机机溶溶剂剂，应应用用最广；最广； c. c. 硅碳键型：硅碳键型： SiSiC C d. d. 硅氮键型：硅氮键型： SiSiN N键合固定相的制备键合固定
19、相的制备（l l）硅酸酯（）硅酸酯（SiSi一一OROR）键合固定相）键合固定相, , 最先最先用于液相色谱。用于液相色谱。用醇与硅醇基发生酯化反用醇与硅醇基发生酯化反应应： SiSi0H0HROHSiROHSiORORH H2 20 0 这类键合固定相的有机表面是一些单这类键合固定相的有机表面是一些单体，具有良好的传质特性体，具有良好的传质特性, ,但这些酯化过但这些酯化过的硅胶填料易水解且受热不稳定，因此的硅胶填料易水解且受热不稳定，因此仅仅适用于不含水或醇的流动相适用于不含水或醇的流动相。 共共价价键键键键合合固固定定相相不不易易水水解解，并并且且热热稳稳定定较较硅硅酸酸酯酯好好。缺缺点
20、点是是格格氏氏反反应应不不方方便便；当当使使用水溶液时，必须限制用水溶液时，必须限制pHpH在在4 48 8范围内范围内。（2 2）SiSiC C或或SiSi一一N N共价键合固定相制备反应如下：共价键合固定相制备反应如下： （3）硅烷化（硅烷化（SiSiO OSiSiC C）键合固定相）键合固定相制备反应如下：制备反应如下： 这类键合固定相具有热稳定好，不易吸这类键合固定相具有热稳定好，不易吸水，耐有机溶剂的优点。水，耐有机溶剂的优点。能在能在7070以下，以下，PH=2PH=28 8范围内正常工作，应用较广泛范围内正常工作，应用较广泛。第四节第四节 反相填料及色谱柱反相填料及色谱柱非极性固
21、定相，极性流动相非极性固定相，极性流动相在色谱的应用中，反相模式占在色谱的应用中，反相模式占5757。反相色谱填料的种类与性质反相色谱填料的种类与性质品种繁多，性质各异。品种繁多，性质各异。市场主流：市场主流：无机材料无机材料为基质制备的填料为基质制备的填料在硅胶基质的填料中，以在硅胶基质的填料中，以键合有键合有C C1818、C C8 8、C C4 4及及C C3 3的球形、全多孔填料的球形、全多孔填料最常见。最常见。参见参见P P239239：表：表11116 6；P P242242244244：表：表11117 7。第五节第八节第五节第八节 其它色谱类型填料其它色谱类型填料自学！自学！请
22、注意掌握几个要点：请注意掌握几个要点：色谱的分离原理色谱的分离原理色谱填料的种类与性能色谱填料的种类与性能色谱填料的制备色谱填料的制备常见的色谱填料常见的色谱填料第九节第九节 生化分离用色谱填料的新进展生化分离用色谱填料的新进展未来液相色谱的特点：两极分化式发展未来液相色谱的特点：两极分化式发展 适应制备色谱需要：高效、适应制备色谱需要：高效、高选择性、高速、低成本高选择性、高速、低成本液相色谱液相色谱 适应分析色谱需要适应分析色谱需要 ：高效、高选择性、高通量、快速：高效、高选择性、高通量、快速 主要体现：主要体现：提高柱效提高柱效提高选择性提高选择性提高化学稳定性提高化学稳定性提高分离速度
23、提高分离速度提高生物相容性提高生物相容性提高性能重现性提高性能重现性提高性能价格比提高性能价格比具体地：具体地：细粒径填料：细粒径填料：粒径减小，理论塔板数增加，但柱子粒径减小，理论塔板数增加，但柱子渗透性降低，操作压力升高。若缩短柱长可适当缓解，但渗透性降低，操作压力升高。若缩短柱长可适当缓解，但单柱柱效不明显。单柱柱效不明显。降低硅胶填料的非特异性吸附：降低硅胶填料的非特异性吸附：长期问题长期问题对碱性溶质非特异性吸附，乃因硅胶中的杂质金属离子对碱性溶质非特异性吸附，乃因硅胶中的杂质金属离子及键合时在硅胶表面引起的硅羟基。及键合时在硅胶表面引起的硅羟基。贯流色谱：贯流色谱：既有通常的微孔或
24、大孔，又有贯穿整个既有通常的微孔或大孔，又有贯穿整个颗粒的超大孔。同时具高流速、高效率、高样品负载量和颗粒的超大孔。同时具高流速、高效率、高样品负载量和低操作压力的特点。低操作压力的特点。整体柱：整体柱：即连续固定相，用原位聚合和类似浇铸的方即连续固定相，用原位聚合和类似浇铸的方法，形成整体、连续的柱体，不需用细粒径的填料填装。法，形成整体、连续的柱体，不需用细粒径的填料填装。放大放大13001300倍的君影草倍的君影草放大放大1010倍的拟南芥根部倍的拟南芥根部Bellco GlassBellco Glass生物反应器生物反应器放大放大1313倍的结晶混合物倍的结晶混合物放大放大100100倍的专业纸纤维倍的专业纸纤维放大放大200200倍的链孢霉倍的链孢霉晶体森林晶体森林人体免疫系统抵御病菌人体免疫系统抵御病菌鱿鱼吸管鱿鱼吸管Thank you!
