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1、温敏温敏突变突变株的株的筛选筛选定义定义诱变诱变富集富集筛选筛选抗生素法抗生素法过滤或离心法过滤或离心法H3前体法前体法重层琼脂法多次分离重层琼脂法多次分离重层琼脂法多次分离重层琼脂法多次分离敏感菌敏感菌敏感菌敏感菌离心上清为高效价噬离心上清为高效价噬离心上清为高效价噬离心上清为高效价噬菌体菌体菌体菌体效价测定效价测定效价测定效价测定诱变诱变诱变诱变平板平板平板平板分离分离分离分离摇瓶摇瓶摇瓶摇瓶分离分离分离分离抗性抗性抗性抗性测定测定测定测定被感染后被感染后被感染后被感染后的噬菌斑的噬菌斑的噬菌斑的噬菌斑 敏感菌敏感菌敏感菌敏感菌纯纯纯纯化化化化高效价高效价高效价高效价噬菌体噬菌体噬菌体噬菌
2、体的制备的制备的制备的制备效价效价效价效价(U/ml)=(U/ml)=平均每皿噬菌斑数平均每皿噬菌斑数平均每皿噬菌斑数平均每皿噬菌斑数 稀释倍数稀释倍数稀释倍数稀释倍数 取样量取样量取样量取样量第八章 工业微生物代谢控制育种生物合成途径生物合成途径代谢调节机制代谢调节机制解除或绕过代谢途径解除或绕过代谢途径有用产物大量积累有用产物大量积累第一节 概论新陈代谢：新陈代谢： 初级代谢初级代谢 次级代谢次级代谢一、初级代谢（primary matabolism） 通常把微生物产生的对自身生长和通常把微生物产生的对自身生长和繁殖必须的物质称为初级代谢产物。繁殖必须的物质称为初级代谢产物。而产生这些物质
3、的代谢体系称为初级而产生这些物质的代谢体系称为初级代谢。代谢。uu分解代谢体系分解代谢体系uu素材性生物合成素材性生物合成uu结构性生物合成体系结构性生物合成体系二、次级代谢（secondary matabolism）uu 次级代谢产物是指对产生他们的生次级代谢产物是指对产生他们的生物体本身不需要的一种产物。物体本身不需要的一种产物。三、初级代谢与次级代谢的关系次级代谢是初级代谢衍生出来的。次级代谢是初级代谢衍生出来的。基本代谢途径有基本代谢途径有7种：种：uu葡萄糖碳架掺入途径葡萄糖碳架掺入途径uu莽草酸途径莽草酸途径uu与核苷有关的途径与核苷有关的途径uu聚酮体和聚丙酸途径聚酮体和聚丙酸途
4、径uu由氨基酸衍生途径由氨基酸衍生途径uu甲羟戊酸途径甲羟戊酸途径uu其他复合途径其他复合途径第二节 初级代谢的调节控制酶合成量调节酶合成量调节（反馈阻遏）（反馈阻遏）酶活力调节酶活力调节（反馈抑制）（反馈抑制）一、基本概念一、基本概念1诱导（诱导（Induction）同时诱导同时诱导 顺序诱导顺序诱导2阻遏（阻遏（Repression）末端产物阻遏（末端产物阻遏（end product repression）分解代谢阻遏（分解代谢阻遏（catabolite repression）operonpromoter operatorpOZYRegulatorgenestucturegeneRegul
5、atoryproteinEffectorinducercorepressorrepressoraporepressor酶合成调节酶合成调节操纵子操纵子operonpromoter operatorpOZYRegulatorgenestucturegeneRegulatoryproteininducerrepressorRNAploymaseCAP或或CRPcAMP+诱导型操纵子诱导型操纵子operonpromoter operatorpOZYRegulatorgenestucturegeneRegulatoryproteincorepressoraporepressorRNAploymase阻
6、遏操纵子阻遏操纵子二、酶活性的调节前体激活：前体激活： 指在分解代谢途径中，后面的反应可指在分解代谢途径中，后面的反应可被较前面的中间产物所促进。被较前面的中间产物所促进。反馈抑制：反馈抑制： 指某代谢途径的末端产物过量时，这指某代谢途径的末端产物过量时，这个产物可反过来直接抑制该途径中第一个个产物可反过来直接抑制该途径中第一个酶的活性，促进整个反应过程减慢或停止酶的活性，促进整个反应过程减慢或停止从而避免了末端产物过量积累。从而避免了末端产物过量积累。（一）反馈抑制类型（1）直线式代谢途径中的反馈抑制）直线式代谢途径中的反馈抑制苏氨酸苏氨酸苏氨酸苏氨酸- - 酮丁酸酮丁酸酮丁酸酮丁酸异亮氨酸
7、异亮氨酸异亮氨酸异亮氨酸苏氨酸脱氢酶苏氨酸脱氢酶苏氨酸脱氢酶苏氨酸脱氢酶反馈抑制反馈抑制反馈抑制反馈抑制（2）分支代谢途径中的反馈抑制）分支代谢途径中的反馈抑制优先合成：优先合成： 分支途径中一个终产物优先合成，分支途径中一个终产物优先合成，浓度过量后，抑制自身合成途径，浓度过量后，抑制自身合成途径，使代谢转向合成另一个终产物。例使代谢转向合成另一个终产物。例如黄色短杆菌优先合成谷氨酸，当如黄色短杆菌优先合成谷氨酸，当谷氨酸过量后，使代谢转向合成天谷氨酸过量后，使代谢转向合成天冬氨酸。冬氨酸。ABEGJuu协同反馈抑制（协同反馈抑制（concerted feedback inhibition）
8、uu合作反馈抑制合作反馈抑制uu累积反馈抑制累积反馈抑制uu顺序反馈抑制顺序反馈抑制ABEGABEGABEGuu同功酶调节同功酶调节(isoenzyme) ABEG（二）反馈阻遏和反馈抑制的比较反馈阻遏反馈阻遏反馈抑制反馈抑制调节对象调节对象调控开关调控开关调控的水平调控的水平调控的方式调控的方式调控的动作调控的动作形成的控制形成的控制酶的合成酶的合成终产物浓度终产物浓度DNA mRNA 蛋白蛋白质质终产物与阻遏蛋白亲终产物与阻遏蛋白亲和力和力阻遏蛋白与操纵基因阻遏蛋白与操纵基因结合不能合成结合不能合成RNA开关控制开关控制酶活性酶活性终产物浓度终产物浓度酶蛋白构象酶蛋白构象终产物与变终产物与
9、变构亲和力构亲和力酶构象发生酶构象发生变化变化控制酶活性控制酶活性的大小的大小第三节 次级代谢的调节控制 抗生素的生物合成途径中，反馈调抗生素的生物合成途径中，反馈调节作用包括：节作用包括：1.1.抗生素本身积累就能起反馈调节作用抗生素本身积累就能起反馈调节作用2.2.初级代谢产物作为抗生素合成的前体，初级代谢产物作为抗生素合成的前体，当其受到反馈调节时，必然会影响抗当其受到反馈调节时，必然会影响抗生素的合成。生素的合成。 一、次级代谢产物的诱导调节uu诱导机制可能按两种方式进行：诱导机制可能按两种方式进行：诱导物诱导物刺激影响初刺激影响初级代谢造成级代谢造成代谢流改变代谢流改变大量合成次级大
10、量合成次级代谢产物代谢产物诱导物诱导物次级代谢物次级代谢物合成酶的合合成酶的合成成大量合成次级大量合成次级代谢产物代谢产物二、次级代谢产物碳源分解调节 抗生素受碳源分解调节的机制，存在抗生素受碳源分解调节的机制，存在两种解释两种解释 ： 第一，可能与菌体生长速率控制抗生素第一，可能与菌体生长速率控制抗生素合成有关，合成有关， 菌体生长最好的碳源能抑菌体生长最好的碳源能抑制抗生素合成。制抗生素合成。 第二，可能与分解代谢产物的堆积浓度第二，可能与分解代谢产物的堆积浓度有关。有关。三、次级代谢产物氮源调节 主要指含氮底物的酶的合成受快速利用的主要指含氮底物的酶的合成受快速利用的氮源，尤其是氨的阻遏
11、。氮源，尤其是氨的阻遏。 （如蛋白酶、硝酸还原酶、酰胺酶、组氨酸（如蛋白酶、硝酸还原酶、酰胺酶、组氨酸酶和脲酶）酶和脲酶）例证：例证： uu铵盐有利于灰色链霉菌的迅速生长，不利铵盐有利于灰色链霉菌的迅速生长，不利于链霉素的合成。脯氨酸和黄豆饼粉起到于链霉素的合成。脯氨酸和黄豆饼粉起到良好作用。良好作用。uu红霉素生产时加入红霉素生产时加入NH4Cl甘氨酸和大豆饼甘氨酸和大豆饼粉会使产量下降。粉会使产量下降。四、次级代谢的反馈调节（一）次级代谢自身产物的反馈调节一）次级代谢自身产物的反馈调节抗生素对自身产物的抑制有一定的抗生素对自身产物的抑制有一定的规律：规律： 抑制特定产生菌合成抗生素所需抑制
12、特定产生菌合成抗生素所需浓度与生产水平具有相关性，一般产浓度与生产水平具有相关性，一般产生菌产量高，对自身抗生素的耐受性生菌产量高，对自身抗生素的耐受性强，反之则越敏感。强，反之则越敏感。（二）分支代谢中初级代谢物的反馈调节对次级代谢的影响第一种方式：第一种方式：次级途径和初级途径具有共同的分叉中间次级途径和初级途径具有共同的分叉中间体，由分叉中间体产生的初级代谢终产物体，由分叉中间体产生的初级代谢终产物的反馈调节可能影响次级代谢产物的形成的反馈调节可能影响次级代谢产物的形成第二种方式：第二种方式：在抗生素生物合成途径中，初级代谢的终在抗生素生物合成途径中，初级代谢的终产物作为前体合成次级代谢
13、产物。终产物产物作为前体合成次级代谢产物。终产物受初级代谢反馈调节，因而，势必影响抗受初级代谢反馈调节，因而，势必影响抗生素的合成。生素的合成。例例酮戊二酸酮戊二酸+ +乙酰辅酶乙酰辅酶A A高柠檬酸高柠檬酸氨基氨基己二酸己二酸赖氨酸赖氨酸苄基青霉素苄基青霉素缬氨酸掺入缬氨酸掺入同型柠檬酸同型柠檬酸合成酶合成酶例例2赤藓糖赤藓糖4 4磷酸磷酸+ +磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸莽草酸莽草酸预苯酸预苯酸L L- -苏对氨基苏对氨基苯丝氨酸苯丝氨酸DAPHDAPH分支分支酸酸L-L-对氨基对氨基苯丙氨酸苯丙氨酸氯霉素氯霉素酪氨酸酪氨酸邻氨基苯甲邻氨基苯甲酸酸色氨酸色氨酸PABAPABA杀假丝杀假
14、丝菌素菌素苯丙氨酸苯丙氨酸五、磷酸盐的调节 已发现过量的磷酸盐对四环类、氨基已发现过量的磷酸盐对四环类、氨基糖苷类和多烯大环内酯类等糖苷类和多烯大环内酯类等32种抗生素种抗生素的合成产生阻抑作用。的合成产生阻抑作用。 磷酸盐浓度磷酸盐浓度 0.310mmol/L促进生长促进生长 10mmol/L 产生阻产生阻遏遏机制：直接效应：磷酸盐自身影响抗生机制：直接效应：磷酸盐自身影响抗生 素的合成素的合成间接效应：磷酸盐调节细胞内其他效应剂间接效应：磷酸盐调节细胞内其他效应剂ATP cAMP六、细胞膜透性的调节六、细胞膜透性的调节uu产物不分泌，必然反馈调节。产物不分泌，必然反馈调节。uu营养不进入，影响产物合成。营养不进入，影响产物合成。
