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1、第一章第一章 蛋蛋 白白 质 第一节第一节 蛋白质通论蛋白质通论蛋白质存在于一切的蛋白质存在于一切的生物细胞中，是构成生物细胞中，是构成生物体最根本的构造生物体最根本的构造物质和功能物质。物质和功能物质。蛋白质是生命活动的蛋白质是生命活动的物质根底，它参与了物质根底，它参与了几乎一切的生命活动几乎一切的生命活动过程。过程。一、蛋白质的功能多样性一、蛋白质的功能多样性1.1.催化功能催化功能 2.2.构造功能构造功能 3.3.运运输输功能功能 4.4.储储存功能存功能 5.5.运运动动功能功能 6.6.防御功能防御功能 7.7.调调理功能理功能 8.8.信息信息传传送功能送功能 9.9.遗传调遗
2、传调控功能控功能 10.10.其它功能其它功能 蛋白质蛋白质(protein)是由许多氨基酸是由许多氨基酸(aminoacids)经过经过肽键肽键(peptidebond)相连构成的高分子含氮化合物。相连构成的高分子含氮化合物。二、蛋白质的分类二、蛋白质的分类一按分子组成特点分类：一按分子组成特点分类： 单纯蛋白质单纯蛋白质 结合蛋白质结合蛋白质二按分子外形分类：二按分子外形分类： 球状蛋白质球状蛋白质 纤维状蛋白质纤维状蛋白质三按生物学功能分类：活性蛋白质三按生物学功能分类：活性蛋白质 非活性蛋白质非活性蛋白质 四按溶解度分类：四按溶解度分类： 可溶性蛋白质可溶性蛋白质 醇溶性蛋白质醇溶性蛋
3、白质 不溶性蛋白质不溶性蛋白质二、蛋白质的分类二、蛋白质的分类一按分子外形分类一按分子外形分类 1. 1.球状蛋白球状蛋白 球形，多溶于水，球形，多溶于水，多具有活性，多具有活性，长长度度与直径之比普通小与直径之比普通小于于1010。 如如酶酶、转转运蛋白、运蛋白、蛋白激素、抗体等。蛋白激素、抗体等。 2. 2.纤维纤维状蛋白状蛋白 细长细长，分子量大，多，分子量大，多是构造蛋白。是构造蛋白。 如胶原蛋白，如胶原蛋白，弹弹性蛋性蛋白，角蛋白等。白，角蛋白等。 二、蛋白质的分类二、蛋白质的分类二按分子组成分类二按分子组成分类1.1.简单简单蛋白蛋白 由氨基酸由氨基酸组组成成7 7类类：清蛋白清蛋
4、白球蛋白球蛋白组组蛋白蛋白精蛋白精蛋白谷蛋白谷蛋白醇溶蛋白和硬蛋白。醇溶蛋白和硬蛋白。2.2.结结合蛋白合蛋白 由蛋白由蛋白质质和非蛋白成分和非蛋白成分组组成，后者称成，后者称为辅为辅基。基。7 7类类：核蛋白核蛋白脂蛋白脂蛋白糖蛋白糖蛋白磷蛋白磷蛋白血血红红素蛋白素蛋白黄素蛋白和金属蛋白。黄素蛋白和金属蛋白。三、蛋白质的元素组成与分子量三、蛋白质的元素组成与分子量 元素元素组成：成： 、含量含量 ： 克克 6.25 6.25克克 蛋白蛋白质每克每克样品中含品中含N N克数克数6.251006.25100 =100 =100克克样品中蛋白品中蛋白质的含量克的含量克% %四、蛋白质的水解四、蛋白
5、质的水解1 1、酸水解、酸水解蛋白质蛋白质 氨基酸混合物氨基酸混合物 6 mol/LHCl6 mol/LHCl或或4 mol/L4 mol/L的的H2SO4H2SO4105 105 2020小小时时 四、蛋白质的水解四、蛋白质的水解 2 2、碱水解、碱水解蛋白质蛋白质 氨基酸混合物氨基酸混合物 5 mol/L NaOH5 mol/L NaOH煮沸煮沸10h-20h10h-20h四、蛋白质的水解四、蛋白质的水解 3 3、酶水解、酶水解蛋白质蛋白质 肽段肽段 蛋白酶蛋白酶 proteinaseproteinase第二节第二节 氨基酸氨基酸一、氨基酸的构造与分类一、氨基酸的构造与分类一根本氨基酸一根
6、本氨基酸二不常见的蛋白质氨基酸二不常见的蛋白质氨基酸 三氨基酸的生物学功能三氨基酸的生物学功能二、氨基酸的性质二、氨基酸的性质一物理性质一物理性质 二化学性质二化学性质 一、氨基酸的构造与分类一、氨基酸的构造与分类一根本氨基酸一根本氨基酸组成蛋白质的氨基酸，组成蛋白质的氨基酸，2020种。种。二稀有氨基酸二稀有氨基酸是多肽合成后由根本氨基酸经酶促修饰而来。是多肽合成后由根本氨基酸经酶促修饰而来。三氨基酸的生物学功能三氨基酸的生物学功能一根本氨基酸一根本氨基酸1 1、种氨基酸的化学称号及构造通式：、种氨基酸的化学称号及构造通式： 2 2、构型：、构型：从蛋白从蛋白质质水解得到的水解得到的氨基酸属
7、氨基酸属 L L 氨基酸氨基酸 COOHCOOH H2 N H2 N C CH H R R代表氨基酸的代表氨基酸的侧链侧链 基基团团 。 不同的氨基酸，基不同的氨基酸，基团团不同。不同。氨基酸的分类氨基酸的分类根据氨基酸的根据氨基酸的侧链R R基基团的化学构造分的化学构造分类：脂肪族氨基酸：甘、丙、脂肪族氨基酸：甘、丙、缬、亮、异亮、亮、异亮、 蛋、半胱、蛋、半胱、丝、苏、谷、谷、 谷谷酰、天、天、天、天酰、赖、精、精芳香族氨基酸：苯丙、酪、色芳香族氨基酸：苯丙、酪、色杂环氨基酸：氨基酸： 组、脯、脯杂环亚氨基酸：脯氨基酸：脯 氨基酸 基团 基团上有功能基团 丝Ser 羟基 半胱Cysh 巯基
8、 天酰Asn 酰胺基谷酰Gln天冬Asp 羧基谷Glu 赖Lys 2氨基 精Arg 胍基 组His 咪唑基极性氨基酸：极性氨基酸：极性不极性不带电带电荷：甘、荷：甘、丝丝、苏苏、天、天酰酰、 谷谷酰酰、 酪、半胱酪、半胱 极性极性带负电带负电荷：天、谷荷：天、谷极性极性带带正正电电荷：荷：组组、赖赖、精、精非极性氨基酸：丙、非极性氨基酸：丙、缬缬、亮、异亮、亮、异亮、 苯丙、蛋、脯、色苯丙、蛋、脯、色根据氨基酸的侧链根据氨基酸的侧链R R基团的极性分类：基团的极性分类：必需氨基酸：必需氨基酸： 机机体体维维持持正正常常代代谢谢、生生长长所所必必需需，而而本本身身不不能能合合成成，需需从从外外界
9、界获获取取的的氨氨基基酸酸。如如：PhePhe、TrpTrp、LysLys、MetMet、LeuLeu、I1eI1e、ThrThr、ValVal、HisHis、ArgArg。非必需氨基酸：非必需氨基酸： 体内能合成的氨基酸。体内能合成的氨基酸。1212种种二不常二不常见蛋白蛋白质氨基酸氨基酸r-r-氨基丁酸氨基丁酸GABAGABA谷氨酸脱羧酶谷氨酸脱羧酶谷氨酸谷氨酸r-氨基丁酸氨基丁酸2r-氨基丁酸的功能氨基丁酸的功能:它是一种抑制性神经递质，对中枢神经它是一种抑制性神经递质，对中枢神经原有普遍抑制造用，对突触前、突触后也有原有普遍抑制造用，对突触前、突触后也有一定抑制造用。一定抑制造用。三氨
10、基酸的生物学功能三氨基酸的生物学功能1、合成蛋白质，以满足机体生长发、合成蛋白质，以满足机体生长发育和组织的更新修复等需求。育和组织的更新修复等需求。2、转变成具有重要生理功能的含氮、转变成具有重要生理功能的含氮化合物如核苷酸、尼克酰胺、儿茶酚化合物如核苷酸、尼克酰胺、儿茶酚胺类激素、甲状腺素等。胺类激素、甲状腺素等。3、转变成糖类或脂肪。、转变成糖类或脂肪。4、氧化供能。、氧化供能。二、氨基酸的重要理化性质一物理性质一物理性质二化学性质二化学性质氨基酸的构型、旋光性和光吸收氨基酸的构型、旋光性和光吸收1、氨基酸的构型与旋光性、氨基酸的构型与旋光性Gly一种构型一种构型,无旋光性无旋光性Thr
11、和和Ile有四种光学异构体。有四种光学异构体。其其他他17种种氨氨基基酸酸有有两两种种光光学学异异构构体体：L型、型、D型。型。构构成成蛋蛋白白质质的的氨氨基基酸酸均均属属L-型型 L-苏苏氨氨酸酸 。一物理性质一物理性质 氨基酸的旋光性符号和大小取决于氨基酸的旋光性符号和大小取决于它的它的R R基的性质，并与溶液的基的性质，并与溶液的PHPH值有关。值有关。 外消旋物：外消旋物：D-D-型和型和L-L-型的等摩尔混合物。型的等摩尔混合物。 L- L-苏氨酸和苏氨酸和D-D-苏氨酸组成消旋物。苏氨酸组成消旋物。内消旋物：分子内消旋内消旋物：分子内消旋胱胱氨氨酸酸有有三三种种立立体体异异构构体体
12、：L-胱胱氨氨酸酸、D-胱胱氨氨酸酸、内内消旋胱氨酸。消旋胱氨酸。L-胱氨酸和胱氨酸和D-胱氨酸是外消旋物胱氨酸是外消旋物2 2、氨基酸的光吸收性、氨基酸的光吸收性 构成蛋白质的构成蛋白质的2020种氨基酸种氨基酸在可见光区都没有光吸收，在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区但在远紫外区(220nm)(220nm)均均有光吸收。有光吸收。 在近紫外区在近紫外区(220-300nm)(220-300nm)只只需酪氨酸、苯丙氨酸和色需酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的才干。氨酸有吸收光的才干。 酪氨酸的酪氨酸的 maxmax275nm275nm， 275=1.4x103;275=1.4x103; 苯
13、丙氨酸的苯丙氨酸的 maxmax257nm257nm， 257=2.0x102;257=2.0x102; 色氨酸的色氨酸的 maxmax280nm280nm， 280=5.6x103;280=5.6x103;与苯异硫与苯异硫氰氰酸酸酯酯(PITC)的反的反响响 COOH COOH | |+ H2N-CH+ H2N-CH | | R R在弱碱中在弱碱中-NH-C-NH-CH-COOH苯氨基硫甲酰氨基酸苯氨基硫甲酰氨基酸(PTC-(PTC-氨基酸氨基酸) )S | RH+环化环化-N=C=S苯异硫氰酸酯苯异硫氰酸酯(PITC )(PITC )-NOCCH-RC NHS苯乙内酰硫脲氨基酸苯乙内酰硫脲
14、氨基酸(PTH-(PTH-氨基酸氨基酸) ) 无色无色EdmanEdman反响反响二化学性质二化学性质与与2,4-二硝基氟苯反响二硝基氟苯反响 COOH COOH | |+ H2N-CH+ H2N-CH | | R R在弱碱中在弱碱中O2N-|NO2-F2,4-2,4-二硝基氟苯二硝基氟苯(DNFB(DNFB或或FDNB)FDNB)O2N-|NO2-2,4-2,4-二硝基苯二硝基苯- -氨基酸氨基酸(DNP-(DNP-氨基酸氨基酸) ) 黄色黄色 COOH COOH | | NH-CH NH-CH | | R R+HFSanger反响Sanger 反响2.4一二硝基氟苯DNFBDNP-氨基酸，
15、黄色，层析法鉴定，被Sanger用来测定多肽的NH2末端氨基酸 与与茚茚三三酮酮的反响的反响RCHCOOHNH2 氨基酸氨基酸OOOHOH2+沸腾沸腾蓝紫色化合物蓝紫色化合物成成肽肽反响反响 R1 R2 H2NCHCOOH H2NCHCOOH R1 R2 H2NCHCOHN CH COOH肽键肽键二二肽- H2O两性解离和等两性解离和等电电点点氨基酸的兼性离子方式氨基酸的兼性离子方式 氨基酸在晶体和水溶液中主要以兼性离子氨基酸在晶体和水溶液中主要以兼性离子方式存在。方式存在。晶体熔点高晶体熔点高离子晶格，不是分子晶格。离子晶格，不是分子晶格。 不溶于非极性溶不溶于非极性溶剂剂极性分子极性分子介
16、介电电常数高常数高水溶液中的氨基酸是极性分子。水溶液中的氨基酸是极性分子。氨基酸的等氨基酸的等电点点 当溶液当溶液为为某一某一pHpH值时值时，氨基酸分子，氨基酸分子中所含的中所含的-NH3+-NH3+和和-COO-COO-数目正好相等，数目正好相等，净电净电荷荷为为0 0。这这一一pHpH值值即即为为氨基酸的等氨基酸的等电电点点 pIpI 。在等。在等电电点点时时，氨基酸既不向正极，氨基酸既不向正极也不向也不向负负极挪极挪动动，即氨基酸，即氨基酸处处于两性离于两性离子形状。子形状。 不同的氨基酸，其等不同的氨基酸，其等电电点点 pIpI 不同。不同。氨基酸的等氨基酸的等电点点 侧链侧链不含离
17、解基不含离解基团团的中性氨基酸，其等的中性氨基酸，其等电电点是它的点是它的pK1pK1和和pK2pK2的算的算术术平均平均值值： pI = (pK1 + pK2 )/2 pI = (pK1 + pK2 )/2 对对于于侧链侧链含有可解离基含有可解离基团团的氨基酸，其的氨基酸，其pIpI值值也决也决议议于两于两性离子两性离子两边边的的pKpK值值的算的算术术平均平均值值。 酸性氨基酸：酸性氨基酸：pI = (pK1 + pK2 )/2 pI = (pK1 + pK2 )/2 碱性氨基酸：碱性氨基酸：pI = (pK2 + pK3 )/2 pI = (pK2 + pK3 )/2 对于丙氨酸等一氨基
18、一羧基的中性型氨基酸来说对于丙氨酸等一氨基一羧基的中性型氨基酸来说, ,由于羧由于羧基电离度略大于氨基电离度基电离度略大于氨基电离度, ,所以溶于水时所以溶于水时, ,其负离子数其负离子数将多于正离子数将多于正离子数, ,因此在纯水中显微酸性因此在纯水中显微酸性. .CH2SHCH2SHCHNH2CHNH2COOHCOOHCH2CH2CHNH2CHNH2COOHCOOHHSHS+ +CH2SCH2SCHNH2CHNH2COOHCOOHCH2CH2CHNH2CHNH2COOHCOOHS S+ +-2H-2H+2H+2H构成二硫键构成二硫键构成二硫键构成二硫键第三节第三节 肽肽一、肽键及肽链二、肽
19、的命名及构造三、天然存在的活性寡肽 蛋白质的根本构造单位是氨基酸，由20 种氨基酸组成了各种各样的蛋白质。 研讨证明，蛋白质是由许多氨基酸按照一定的陈列顺序经过肽键衔接起来的生物大分子。一、肽键及肽链 肽键肽键 peptide bondpeptide bond 是蛋白是蛋白质质分子分子中氨基酸之中氨基酸之间间的主要的主要衔衔接方式，它是由接方式，它是由一个氨基酸的一个氨基酸的-羧羧基与另一个氨基酸的基与另一个氨基酸的-氨基氨基缩缩合脱水而构成的合脱水而构成的酰酰胺胺键键。 R1 R2 H2NCHCOOH H2NCHCOOH R1 R2 H2NCHCOHN CH COOH肽键肽键二二肽 - H2
20、O 一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基之间失去一分子水相互衔接而成的化合物称为肽peptide，由2 个氨基酸缩合构成的肽叫二肽dipeptide，由3 个氨基酸缩合构成的肽叫三肽tripeptide，少于10 个氨基酸的肽称为寡肽oligopeptide，由10个以上氨基酸构成的肽叫多肽polypeptide。二、肽的命名及构造 肽链中的氨基酸由于参与肽键的构成曾经不是原来完好的分子，因此称为氨基酸残基amino acidresidues。肽的命名是从肽链的N-末端开场，按照氨基酸残基的顺序而逐一命名。氨基酸残基用酰来称谓，称为某氨基酰某氨基酰某氨基酸。 例如，由丝氨酸、甘氨酸、酪氨酸
21、、丙氨酸和亮氨酸组成的五肽就命名为丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸。 甘丙丝缬亮蛋赖赖精谷 Gly-Ala-Ser-Val-Leu-Met-Lys-Lys-Arg-Glu G-A-S-V-L-M-K-K-R-E 在书写时，含自在氨基的一端总是写在左边，含自在羧基的一端总是写在右边。多多肽链肽链R1R2R3H2NCHCOHNCHCOHNCHCOOH多多肽链中中单位位氨基酸残基；氨基酸残基；多多肽链有两端：氨基末端端有两端：氨基末端端 羧基末端端基末端端多多肽链的主的主链：侧链：各基：各基团谷胱甘谷胱甘肽的构造：的构造：SHCH2H2N-CH-CH2-CH2-CO-HN-CH-CO-HN-CH2-C
22、OOHCOOH-2H2G-SHG-S-S-G复原型复原型+2H氧化型氧化型巯基三、天然存在的活性寡肽谷胱甘肽的功能谷胱甘肽的功能 GSH GSH可与氧化剂如可与氧化剂如H2O2H2O2起反响，从而维护起反响，从而维护一些含巯基的蛋白质或酶免遭氧化而丧一些含巯基的蛋白质或酶免遭氧化而丧失正常构造与功能。失正常构造与功能。 如红细胞中的如红细胞中的GSHGSH可以维护细胞膜上含巯可以维护细胞膜上含巯基的蛋白质和酶，以维护膜的完好性和基的蛋白质和酶，以维护膜的完好性和酶活性。酶活性。谷胱甘肽的功能谷胱甘肽的功能H2O22H2O2GSHGSSGNADP+NADPH+H+GSH过氧化物酶过氧化物酶GSH
23、复原酶复原酶 生物体中还有许多其它的多肽，也具有重要的生理意义。如牛加压素、催产素、舒缓激肽都是具有激素作用的多肽。第四节 蛋白质的分子构造 蛋白质的构造可以分为四个层次来研讨，即一级构造、二级构造、三级构造和四级构造。其中一级构造又称蛋白质的化学构造chemical structure、共价构造或初级构造。而二级构造、三级构造和四级构造又称为蛋白质的空间构造或三维构造(three dimensional structure)。一、蛋白质的一级构造1.蛋白质的一级构造 所谓蛋白质的一级构造是指蛋白质多肽链中氨基酸的陈列顺序以及二硫键的位置。 一级构造是蛋白质分子构造的根底，它包含了决议蛋白质分
24、子一切构造层次构象的全部信息。蛋白质一级构造研讨的内容包括蛋白质的氨基酸组成、氨基酸陈列顺序和二硫键的位置，肽链数目，末端氨基酸的种类等。一级构造是蛋白质的肽键维系的。2.蛋白质一级构造的测定 蛋白质一级构造的测定就是测定蛋白质多肽链中氨基酸的陈列顺序，这是提示生命本质，阐明构造与功能的关系，研讨酶的活性中心和酶蛋白高级构造的根底，也是基因表达、克隆和核酸顺序分析的重要内容。蛋白质一级构造的测定主要包括以下根本步骤： 测定蛋白质的分子量和氨基酸组成 获取一定量纯的蛋白质样品，测定其分子量。将一部分样品完全水解，确定其氨基酸种类、数目和每种氨基酸的含量。进展末端分析，确定蛋白质的肽链数目及N-端
25、和C-端氨基酸的种类 测定N-末端氨基酸的方法有多种，常用的有二硝基氟苯DNFB法和异硫氰酸苯酯PTH法如氨基酸的化学性质中所引见的。还可以用丹磺酰氯DNS-CL法测定N-末端氨基酸。 测定C-末端氨基酸常用的方法有肼解法和复原法等。肼解法的原理为：多肽链和过量的无水肼在100反响510h，一切肽键被水解，除C-末端氨基酸自在存在外，其他氨基酸都转变为氨基酸酰肼。拆开二硫键并分别出每条多肽链 拆开二硫键最常用的方法是用过甲酸即过氧化氢甲酸将二硫键氧化，或用过量的-巯基乙醇处置，将二硫键复原。复原法应留意用碘乙酸烷基化试剂维护复原生成的半胱氨酸中的巯基，以防止二硫键的重新生成。分析每条多肽链的N
26、-末端和C-末端残基 取每条多肽链的部分样品进展N-末端和C-末端氨基酸的鉴定，以便建立两个重要的氨基酸顺序参考点。方法如前所述。用两种不同方法将肽链专注性地水解成两套肽段并进展分别 将每条多肽链用两种不同方法进展部分水解，这是一级构造测定中的关键步骤。目前用于顺序分析的方法一次能测定的顺序都不太长，然而天然的蛋白质分子大多在100个残基以上，因此必需设法将多肽断裂成较小的肽段，以便测定每个肽段的氨基酸顺序。水解肽链的方法可采用酶法或化学法，通常是选择专注性很强的蛋白酶来水解。 Trypsin Trypsin ：R1=R1=赖氨赖氨酸酸LysLys和精氨酸和精氨酸ArgArg侧侧链专注性较强，
27、水链专注性较强，水解速度快。解速度快。肽链水解位点水解位点胰胰蛋蛋白白酶肽链水解位点水解位点糜糜蛋蛋白白酶 或胰凝乳蛋白酶或胰凝乳蛋白酶ChymotrypsinChymotrypsin：R1=R1=苯丙氨酸苯丙氨酸Phe,Phe,色氨酸色氨酸Trp,Trp,酪氨酸酪氨酸Tyr; Tyr; 亮氨酸亮氨酸LeuLeu，蛋氨酸蛋氨酸MetMet和组氨和组氨酸酸HisHis水解稍慢。水解稍慢。肽链水解位点水解位点 胃胃蛋蛋白白酶酶 Pepsin Pepsin：R1R1和和R2R2R1=R1=苯丙氨酸苯丙氨酸Phe,Phe,色色氨酸氨酸Trp,Trp,酪氨酸酪氨酸Tyr; Tyr; 亮氨酸亮氨酸LeuL
28、eu以以及其它疏水性氨基及其它疏水性氨基酸，水解速度较快。酸，水解速度较快。肽链水解位点水解位点thermolysin)thermolysin)：R2=R2=苯丙氨酸苯丙氨酸Phe,Phe,色氨酸色氨酸Trp,Trp,酪氨酸酪氨酸Tyr; Tyr; 亮氨酸亮氨酸LeuLeu，异亮氨酸，异亮氨酸Ileu,Ileu,蛋氨酸蛋氨酸MetMet以及其它疏水性强以及其它疏水性强的氨基酸，水解速度较快。的氨基酸，水解速度较快。 嗜嗜热热菌菌蛋蛋白白酶酶 肽链水解位点水解位点羧肽酶和和氨氨肽酶n分别从肽链羧分别从肽链羧基端和氨基端基端和氨基端水解。水解。测定各个肽段的氨基酸陈列顺序并拼凑出完好肽链的氨基酸陈
29、列顺序 多肽链部分水解后分别得到的各个肽段需进展氨基酸陈列顺序的测定，序列测定可用氨基酸序列分析仪。然后用重叠顺序法将两种水解方法得到的两套肽段的氨基酸顺序进展比较分析，根据交叉重叠部分的顺序推导出完好肽链的氨基酸顺序。 比如有一蛋白质肽链的一个片段为十肽，用两种方法水解，水解法A 得到四个小肽，分别为Al：Ala-Phe；A2：Gly-Lys-Asn-Tyr；A3：Arg-Tyr；A4：His-Val。水解法B 得到三个小肽，分别为B1：Ala-Phe-Gly-Lys；B2：Asn-Tyr-Arg；B3：Tyr-His-Val。将两套肽段进展比较分析得出如下结果：二硫键位置确实定 根据知氨基
30、酸顺序选择适宜的专注性蛋白水解酶，在不翻开二硫键的情况下部分水解蛋白质，将水解得到的肽段进展分别。将分别得到的含有二硫键的肽段进展氧化或复原，切断二硫键。分别切断二硫键以后生成的两个肽段，并确定这两个肽段的氨基酸顺序。将这两个肽段的氨基酸顺序与多肽链的氨基酸顺序比较，即可推断出二硫键的位置。二、蛋白质的二级构造 蛋白质的二级构造secondary structure是指蛋白质多肽链本身的折叠和环绕的方式。研讨证明，蛋白质的二级构造主要有-螺旋、-折叠和转角。氢键是稳定二级构造的主要作用力。(一)肽单位的构象 肽单位peptide group是多肽链中从一个-碳原子到相邻-碳原子之间的构造。 肽
31、单位的构象具有三个显著的特征：1肽单位是一个刚性的平面构造 肽键中羰基碳原子与氮原子之间所构成的键不能自在旋转，由于这个键C-N 键的长度为0.132nm，比普通的C-N 单键0.147nm要短些，而比普通的C=N 双键0.127nm要长些，所以具有部分双键的性质，不能自在旋转，这样使得肽单位所包含的六个原子处于同一个平面上，这个平面又称为酰胺平面或肽平面。2肽平面中羰基氧与亚氨基氢几乎总是处于相反的位置 由于衔接在相邻两个-碳上的侧链基团之间的立体干扰不利于顺式构象的构成，而有利于伸展的反式构象的构成，所以蛋白质中几乎一切的肽单位都是反式构象.3C和亚氨基N 及C与羰基C 之间的键是单键，可
32、以自在旋转 -碳原子与羰基碳原子之间的键是一个纯粹的单键，-碳原子与亚氨基氮原子之间的键也是一个纯粹的单键，因此，可以自在旋转。C-N 键旋转的角度通常用表示；C-C 键旋转的角度用表示，它们被称为C原子的二面角或肽单位二面角.(二)蛋白质的二级构造 1951 年，Pauling 和Corey 根据对一些简单化合物如氨基酸和寡肽的X-射线晶体图的数据，提出了两个周期性的多肽构造模型，分别称为-螺旋构造和-折叠构造。1-螺旋(-helix)构造-螺旋构造具有以下主要特征：1-螺旋构造是一个类似棒状的构造，从外观看，严密卷曲的多肽链主链构成了螺旋棒的中心部分，一切氨基酸残基的R 侧链伸向螺旋的外侧
33、，这样可以减少立体妨碍。肽链围绕其长轴环绕成右手螺旋体。2-螺旋每圈包含3.6 个氨基酸残基，螺距为0.54nm，即螺旋每上升一圈相当于向上平移0.54nm。相邻两个氨基酸残基之间的轴心距为0.15nm，每个残基绕轴旋转100。3-螺旋构造的稳定主要靠链内的氢键维持。螺旋中每个氨基酸残基的羰基氧与它后面第4 个氨基酸残基的-氨基氮上的氢之间构成氢键，一切氢键与长轴几乎平行。螺旋内的一个氢键对构造的稳定性的作用并不大，但-螺旋内的许多氢键的总体效应却能稳定螺旋的构象。实践上，-螺旋构造是最稳定的二级构造。2-折叠构造 又称为-折叠片层-plated sheet构造和-构造等。这是Pauling
34、和Corey 继发现-螺旋构造后在同年又发现的另一种蛋白质二级构造。-折叠构造是一种肽链相当伸展的构造，多肽链呈扇面状折叠。-折叠构造的特点如下：1在-折叠构造中，多肽链几乎是完全伸展的。相邻的两个氨基酸之间的轴心距为0.35nm。侧链R 交替地分布在片层的上方和下方，以防止相邻侧链R 之间的空间妨碍。2在-折叠构造中，相邻肽链主链上的C=O 与N-H 之间构成氢键，氢键与肽链的长轴近于垂直。一切的肽键都参与了链间氢键的构成，因此维持了-折叠构造的稳定。3相邻肽链的走向可以是平行和反平行两种。在平行的-折叠构造中，相邻肽链的走向一样，氢键不平行。在反平行的-折叠构造中，相邻肽链的走向相反，但氢
35、键近于平行。从能量角度思索，反平行式更为稳定。3-转角构造 -转角构造-turn又称为-弯曲、-回折、发夹构造和U型转机等。蛋白质分子多肽链在构成空间构象的时候，经常会出现180的回折转机，回折处的构培育称为-转角构造，普通由四个延续的氨基酸组成。三、超二级构造和构造域一超二级构造 蛋白质分子中的多肽链在三维折叠中构成有规那么二级构造聚集体，如-螺旋聚集体型、-折叠聚集体型以及-螺旋和-折叠的聚集体，常见的是型聚集体。在球状蛋白质中常见的是两个聚集体连在一同，构成构造，称为Rossmann 卷曲。这种由二级构造间组合的构造层次称为超二级构造。超二级构造普通以一个整体参与三维折叠，作为三级构造的
36、构件。二构造域 构造域structural domain是介于二级和三级构造之间的另一种构造层次。所谓构造域是指蛋白质亚基构造中明显分开的严密球状构造区域，又称为辖区。多肽链首先是在某些区域相邻的氨基酸残基构成有规那么的二级构造，然后，又由相邻的二级构造片段集装在一同构成超二级构造，在此根底上多肽链折叠成近似于球状的三级构造。四、蛋白质的三级构造一蛋白质的三级构造及其特点 蛋白质的三级构造tertiary structure是指多肽链在二级构造、超二级构造以及构造域的根底上，进一步卷曲折叠构成复杂的球状分子构造。三级构造包括多肽链中一切原子的空间陈列方式。维持这种特定构象稳定的作用力主要是次级
37、键，它们使多肽链在二级构造的根底上构成更复杂的构象。肽链中的二硫键可以使远离的两个肽段连在一同，所以对三级构造的稳定也起到重要作用。蛋白质的三级构造有以下共同特点：1具备三级构造的蛋白质普通都是球蛋白，都有近似球状或椭球状的外形，而且整个分子陈列严密，内部有时只能包容几个水分子。2大多数疏水性氨基酸侧链都埋藏在分子内部，它们相互作用构成一个致密的疏水核，这对稳定蛋白质的构象有非常重要的作用，而且这些疏水区域经常是蛋白质分子的功能部位或活性中心。3大多数亲水性氨基酸侧链都分布在分子的外表，它们与水接触并剧烈水化，构成亲水的分子外壳，从而使球蛋白分子可溶于水。二维持蛋白质构象的作用力 蛋白质的构象
38、包括从二级构造到四级构造的一切高级构造，其稳定性主要依赖于大量的非共价键，又称次级键，其中包括氢键、离子键、疏水键和范德华力。此外，二硫键也在维持蛋白质空间构象的稳定中起重要作用。主要的次级键有以下几种：1氢键 由一个极性很强的XH 基上的氢原子与另一个电负性强的原子Y如O、N、F 等相互作用构成的一种吸引力，本质上仍属于弱的静电吸引作用。氢键是坚持肽链折叠构造的主要要素。2离子键 带相反电荷的基团之间的静电引力，也称为静电键或盐键。蛋白质的多肽链由各种氨基酸组成，有些氨基酸残基带正电，如赖氨酸和精氨酸，有些氨基酸残基带负电，如谷氨酸和天冬氨酸。带相反电荷的基团，如羧基和氨基、胍基、咪唑基等基
39、团之间都可以构成离子键。3疏水键 蛋白质分子含有许多非极性侧链和一些极性很小的基团，这些非极性基团避开水相互相聚集在一同而构成的作用力称为疏水键hydrophobic bond，也称疏水作用力。这种疏水相互作用在维持蛋白质的三级构造中也起到重要作用。4范德华力 范德华力Vander Waals interactions是一种非特异性引力，任何两个相距0.30.4nm的原子之间都存在范德华力，范德华力比离子键弱，但在生物体系中却是非常重要的。五、蛋白质的四级构造 具有独立三级构造的多肽链彼此经过非共价键相互衔接而构成的聚合体构培育是蛋白质的四级构造quaternary structure。在具有
40、四级构造的蛋白质中，每一个具有独立的三级构造的多肽链称为该蛋白质的亚单位或亚基subunit。亚基之间经过其外表的次级键衔接在一同，构成完好的寡聚蛋白质分子。第五节 蛋白质构造与功能的关系 蛋白质的种类很多，各种蛋白质都有其独特的生物学功能，而实现其生物功能的根底就是蛋白质分子所具有的构造，其中包括一级构造和空间构造，从根本上来说取决于它的一级构造。一、蛋白质一级构造与功能的关系一分子病与构造的关系 分子病是指蛋白质分子一级构造的氨基酸陈列顺序与正常顺序有所不同的遗传病，如镰刀型贫血病就是一例。镰刀形红细胞贫血症血红蛋白遗传信息的异常镰刀形红细胞贫血症血红蛋白遗传信息的异常DNADNA.TGT
41、 GGG CTT CTT TTT .TGT GGG CTT CTT TTT mRNA ACA CCC GAA GAA AAA.mRNA ACA CCC GAA GAA AAA.Hb A Hb A 链链链链N N端端端端 苏苏苏苏 脯脯脯脯 谷谷谷谷 谷谷谷谷 赖赖赖赖.正常正常正常正常DNADNA.TGT GGG CAT CTT TTT .TGT GGG CAT CTT TTT mRNA ACA CCC GUA GAA AAA.mRNA ACA CCC GUA GAA AAA.HbSHbS链链链链N N端端端端 . .苏苏苏苏 脯脯脯脯 缬缬缬缬 谷谷谷谷 赖赖赖赖.异常异常异常异常HbAHb
42、A：正常成人：正常成人HbHbHbsHbs：镰刀形红细胞贫血症：镰刀形红细胞贫血症HbHb二同功能蛋白质中氨基酸顺序的种属差别 有些蛋白质存在于不同的生物体中，但具有一样的生物学功能，这些蛋白质被称为同功能蛋白质或同源蛋白质。研讨发现，不同种属的同一种蛋白质其一级构造上有些变化，这就是所谓的种属差别。三一级构造的部分断裂与蛋白质的激活 生物体中的很多酶、蛋白激素、凝血因子等蛋白质都具有重要的生物学功能，但它们在体内往往以无活性的前体precursor方式储存着，酶的无活性的前体称为酶原。这些酶原在体内被切去一个或几个段肽后才干被激活成有催化活性的酶。二、蛋白质的空间构造与功能的关系一核糖核酸酶
43、的变性与复性 蛋白质的变性是可逆的，同时也阐明，蛋白质分子多肽链的氨基酸陈列顺序包含了自动构成正确的空间构象所需求的全部信息，蛋白质的特定的空间构造是其特有的生物功能的根底。二蛋白质的变构景象 一些蛋白质由于受某些要素的影响，其一级构造不变而空间构造发生变化，导致其生物功能的改动，称为蛋白质的变构景象或别构景象。变构景象是蛋白质表现其生物功能的一种普遍而非常重要的景象，也是调理蛋白质生物功能的极为有效的方式。 NH3 + Pr COOH NH3+ Pr COO- NH3 Pr COO- OH-OH-H+H+阳离子阳离子阴离子阴离子兼性离子兼性离子pHPI pH=PI pHPI一、蛋白质的两性性
44、质和等电点第六节 蛋白质的重要性质 溶液中蛋白质的带电情况与其所处环境的pH 有关。当溶液在某一特定的pH 条件下，蛋白质分子所带的正电荷数与负电荷数相等，即净电荷为零，此时蛋白质分子在电场中不挪动，这时溶液的pH 称为该蛋白质的等电点，此时蛋白质的溶解度最小。由于不同蛋白质的氨基酸组成不同，所以都有其特定的等电点，在同一pH 条件下所带净电荷不同。 带电质点在电场中向相反电荷的电极挪动，这种景象称为电泳electrophoresis。由于蛋白质在溶液中解离成带电的颗粒，因此可以在电场中挪动，挪动的方向和速度取决于所带净电荷的正负性和所带电荷的多少以及分子颗粒的大小和外形。由于各种蛋白质的等电
45、点不同，所以在同一pH 溶液中带电荷不同，在电场中挪动的方向和速度也各不一样，根据此原理就可利用电泳的方法将混合的各种蛋白质别分开。二、蛋白质的胶体性质 蛋白质是生物大分子，蛋白质溶液是稳定的胶体溶液，具有胶体溶液的特征，其中电泳景象和不能透过半透膜对蛋白质的分别纯化都是非常有用的。蛋白质之所以能以稳定的胶体存在主要是由于：1蛋白质分子大小已到达胶体质点范围颗粒直径在1100nm 之间，具有较大外表积。2蛋白质分子外表有许多极性基团，这些基团与水有高度亲和性，很容易吸附水分子。3蛋白质分子在非等电形状时带有同性电荷，即在酸性溶液中带有正电荷，在碱性溶液中带有负电荷。由于同性电荷相互排斥，所以使
46、蛋白质颗粒相互排斥，不会聚集沉淀。 NH3 + Pr COOH NH3+ Pr COO- NH3 Pr COO- OH-OH-H+H+阳离子阳离子阴离子阴离子兼性离子兼性离子pHPI pH=PI pHPI三、蛋白质的变性与复性 蛋白质因受某些物理或化学要素的影响，分子的空间构象被破坏，从而导致其理化性质发生改动并失去原有的生物学活性的景象称为蛋白质的变性作用。变性作用并不引起蛋白质一级构造的破坏，而是二级构造以上的高级构造的破坏，变性后的蛋白质称为变性蛋白。 引起蛋白量变性的要素很多，物理要素有高温、紫外线、X-射线、超声波、高压、猛烈的搅拌、震荡等。化学要素有强酸、强碱、尿素、胍盐、去污剂、
47、重金属盐如Hg2+、Ag+、Pb2+等三氯乙酸，浓乙醇等。不同蛋白质对各种要素的敏感程度不同。蛋白量变性后许多性质都发生了改动，主要有以下几个方面：一生物活性丧失二某些理化性质的改动三生物化学性质的改动 假设变性条件猛烈耐久，蛋白质的变性是不可逆的。假设变性条件不猛烈，这种变性作用是可逆的，阐明蛋白质分子内部构造的变化不大。这时，假设除去变性要素，在适当条件下变性蛋白质可恢复其天然构象和生物活性，这种景象称为蛋白质的复性renaturation。四、蛋白质的颜色反响 蛋白质分子中的肽键、苯环、酚以及分子中的某些氨基酸可与某些试剂产生颜色反响，这些颜色反响可运用于蛋白质的分析任务，定性定量地测定
48、蛋白质。一双缩脲反响 双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物。将尿素加热到180，2 分子尿素缩合成1 分子双缩脲并放出1 分子氨： 双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反响产生红紫色络合物，此反响称双缩脲反响biuret reaction。蛋白质分子中含有许多肽键，构造与双缩脲类似，因此也能产生双缩脲反响，所以可用此反响来定性定量地测定蛋白质。凡含有两个或两个以上肽键构造的化合物都可有双缩脲反响。二蛋白质黄色反响 蛋白质溶液遇硝酸后先产生白色沉淀，加热那么白色沉淀变成黄色，再加碱，颜色加深呈橙黄色。这是由于硝酸将蛋白质分子中的苯环硝化，产生了黄色硝基苯衍生物。第八节 蛋白质的分别纯化及鉴定一、蛋白质分
49、别纯化的普通原那么 蛋白质提纯的目的是添加产品的纯度和产量，同时又要坚持和提高产品的生物活性。因此，要分别纯化某一种蛋白质，首先应选择一种含目的蛋白质较丰富的资料。其次，应设法防止蛋白量变性，以制备有活性的蛋白质。对于大多数蛋白质来说，纯化操作都是在04的低温下进展的。同时也应防止过酸、过碱的条件以及猛烈的搅拌和振荡。二、分别纯化蛋白质的普通程序分别纯化蛋白质的普通程序可分为以下几个步骤：一资料的预处置及细胞破碎 分别提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并坚持原来的天然形状，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有：1. 机械破碎法2.
50、浸透破碎法3. 反复冻融法4. 超声波法5. 酶法(二) 蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。三蛋白质粗制品的获得 选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白别分开来。常用的有以下几种方法： 1.透析透析将蛋白质溶液将蛋白质溶液(不纯不纯)放入透析袋中，放在放入透析袋中，放在流水中纯水，让低分子杂质如盐类流水中纯水，让低分子杂质如盐类透过半透膜分散入水内，蛋白质那么留透过半透膜分散入水内，蛋白质那么留在袋中，分别纯化蛋白质。在袋中，分别纯化蛋白质。半透膜阻留半透膜阻留prpr分子，分子，而让小
51、的溶质分子而让小的溶质分子和水经过，以到达和水经过，以到达除去蛋白质溶液中除去蛋白质溶液中小分子盐、低分小分子盐、低分子酸等。子酸等。 2. 利用分别蛋白质的沉淀作用 蛋白质的沉淀作用是指在蛋白质溶液中参与适当试剂，破坏了蛋白质的水化膜或中和了其分子外表的电荷，从而使蛋白质胶体溶液变得不稳定而发生沉淀的景象。以下方法可使蛋白质产生沉淀并可有效地用于蛋白质的分别。盐析 在蛋白质溶液中参与一定量的中性盐如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等使蛋白质溶解度降低并沉淀析出的景象称为盐析salting out。这是由于这些盐类离子与水的亲和性大，又是强电解质，可与蛋白质争夺水分子，破坏蛋白质颗粒外表的水膜。另外，大
52、量中和蛋白质颗粒上的电荷，使蛋白质成为既不含水膜又不带电荷的颗粒而聚集沉淀。 另外，当在蛋白质溶液中参与中性盐的浓度较低时，蛋白质溶解度会添加，这种景象称为盐溶salting in，这是由于蛋白质颗粒上吸附某种无机盐离子后，使蛋白质颗粒带同种电荷而相互排斥，并且与水分子的作用加强，从而溶解度添加。调pH至等电点 当蛋白质溶液处于等电点pH 时，蛋白质分子主要以两性离子方式存在，净电荷为零。此时蛋白质分子失去同种电荷的排斥作用，极易聚集而发生沉淀。有机溶剂 有些与水互溶的有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等可使蛋白质产生沉淀，这是由于这些有机溶剂和水的亲和力大，能夺取蛋白质外表的水化膜，从而使蛋白质的溶
53、解度降低并产生沉淀。重金属盐 当蛋白质溶液的pH 大于其等电点时，蛋白质带负电荷，可与重金属离子如Cu2+、Hg2+、Pb2+、Ag+等结合构成不溶性的蛋白盐而沉淀。生物碱试剂 生物碱是植物组织中具有显著生理作用的一类含氮的碱性物质。可以沉淀生物碱的试剂称为生物碱试剂。生物碱试剂都能沉淀蛋白质，如单宁酸、苦味酸、三氯乙酸等都能沉淀生物碱。由于普通生物碱试剂都为酸性物质，而蛋白质在酸性溶液中带正电荷，所以能和生物碱试剂的酸根离子结合构成溶解度较小的盐类而沉淀。四样品的进一步分别纯化 常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需求这几种方法结合运用才干得到较高纯度的蛋
54、白质样品。1. 凝胶过滤层析 又称为分子排阻层析或分子筛层析。它是根据蛋白质分子大小和外形的差别建立起来的一种方法.也可用此方法进展蛋白质分子量的测定.2. 纤维素柱层析法 该法是利用蛋白质的酸碱性质作为分别的根底。离子交换纤维素cellulose ionexchanger是人工合成的纤维素衍生物，它具有松散的亲水性网状构造，有较大的外表积，使蛋白质大分子可以自在经过。因此常用于蛋白质的分别。3. 亲和层析 亲和层析affinity chromatography分别技术是根据许多蛋白质对特定的化学基团具有专注性结合的原理。这些能被生物大分子如蛋白质所识别并与之结合的基团称为配基或配体ligan
55、d。亲和层析是一种极有效的分别纯化蛋白质的方法。三、蛋白质的分析测定1.蛋白质含量的测定2.蛋白质纯度的鉴定3.蛋白质相对分子质量的测定思索题：1.记忆20种氨基酸及其分类.2.氨基酸的化学性质(两性解离).3.蛋白质的一级构造及其测定.4.蛋白质的高级构造(重点二级构造).5.蛋白质的性质有哪些.6.蛋白质分别纯化的方法有哪些.7.名词解释： 必需氨基酸、盐析、蛋白质的一级构造、凝胶电泳、蛋白质的二级构造、氢键、发夹构造、构象、蛋白质的四级构造、稀有氨基酸、超二级构造、氨基酸等电点、非蛋白质氨基酸、蛋白质的变性、构造域、构型、盐溶、蛋白质的三级构造、蛋白质的复性、分子杂交、蛋白质的沉淀作用、层析、两性离子、蛋白质的等电点、蛋白质折叠
