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1、基因工程的主要操作技术及基因工程的主要操作技术及原理原理基因工程的主要操作技术及原理DNADNA提取提取o总总总总DNADNADNADNA提取提取提取提取n1 1 1 1、植物总植物总植物总植物总DNADNADNADNA提取提取提取提取n2 2 2 2、动物总、动物总、动物总、动物总DNADNADNADNA提取提取提取提取n3 3 3 3、大肠杆菌总、大肠杆菌总、大肠杆菌总、大肠杆菌总DNADNADNADNA提取提取提取提取n4 4、质粒、质粒DNADNA提取提取基因工程的主要操作技术及原理总总DNADNA提取提取oDNADNADNADNA的应用的应用的应用的应用构建基因组文库：构建基因组文库
2、：构建基因组文库：构建基因组文库：100kb100kb100kb100kbSouthernSouthernSouthernSouthern杂交杂交杂交杂交( ( ( (包括包括包括包括RFLP) 50kbRFLP) 50kbRFLP) 50kbRFLP) 50kbPCRPCRPCRPCR分离基因等分离基因等分离基因等分离基因等 50kb50kb50kb50kb基因工程的主要操作技术及原理1.1.因材施提因材施提因材施提因材施提2.2.根据不同研究需要，保证结构的相应完根据不同研究需要，保证结构的相应完根据不同研究需要，保证结构的相应完根据不同研究需要，保证结构的相应完整性整性整性整性3.3.尽
3、量排除其它大分子成分的污染尽量排除其它大分子成分的污染尽量排除其它大分子成分的污染尽量排除其它大分子成分的污染( ( ( (蛋白质、蛋白质、蛋白质、蛋白质、多糖及多糖及多糖及多糖及RNARNARNARNA等等等等) ) ) )4.4.保证提取样品中不含对酶有抑制作用的保证提取样品中不含对酶有抑制作用的保证提取样品中不含对酶有抑制作用的保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属离子有机溶剂及高浓度的金属离子有机溶剂及高浓度的金属离子有机溶剂及高浓度的金属离子在在DNADNA提取过程中应做到提取过程中应做到基因工程的主要操作技术及原理1 1、植物细胞总、植物细胞总DNADNA提取提取
4、o总原则：总原则：总原则：总原则：o取材（尽量新鲜）取材（尽量新鲜）取材（尽量新鲜）取材（尽量新鲜）-液氮研磨液氮研磨液氮研磨液氮研磨-裂裂裂裂解解解解-去蛋白和细胞物去蛋白和细胞物去蛋白和细胞物去蛋白和细胞物-浓缩。浓缩。浓缩。浓缩。基因工程的主要操作技术及原理（1 1）CTABCTAB法：法：CTAB (cetyltriethyl ammonium CTAB (cetyltriethyl ammonium bromide) (bromide) (十六烷基三甲基溴化铵十六烷基三甲基溴化铵) )oo原理：原理：原理：原理： CTAB CTAB CTAB CTAB是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜
5、并能是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜并能是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜并能是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜并能与核酸形成复合物，该复合物在高盐溶液中与核酸形成复合物，该复合物在高盐溶液中与核酸形成复合物，该复合物在高盐溶液中与核酸形成复合物，该复合物在高盐溶液中(0.7mol/L (0.7mol/L (0.7mol/L (0.7mol/L NaCl)NaCl)NaCl)NaCl)是可溶的，当降低溶液盐浓度到是可溶的，当降低溶液盐浓度到是可溶的，当降低溶液盐浓度到是可溶的，当降低溶液盐浓度到0.3mol/L NaCl0.3mol/L NaCl0.3mol/L NaCl0.3mol/L NaCl
6、时，时，时，时，从溶液中沉淀，通过离心就可将其与蛋白，多糖类物质从溶液中沉淀，通过离心就可将其与蛋白，多糖类物质从溶液中沉淀，通过离心就可将其与蛋白，多糖类物质从溶液中沉淀，通过离心就可将其与蛋白，多糖类物质分开，在经过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等分开，在经过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等分开，在经过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等分开，在经过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质。最后通过乙醇或异丙醇沉淀杂质。最后通过乙醇或异丙醇沉淀杂质。最后通过乙醇或异丙醇沉淀杂质。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNADNADNADNA。ooCTABCTABCTABCTAB溶于乙醇或异丙醇进
7、而除去溶于乙醇或异丙醇进而除去溶于乙醇或异丙醇进而除去溶于乙醇或异丙醇进而除去 在高离子强度的溶液在高离子强度的溶液在高离子强度的溶液在高离子强度的溶液中中中中(0.7mol/L NaCl)(0.7mol/L NaCl)(0.7mol/L NaCl)(0.7mol/L NaCl)， CTABCTABCTABCTAB与蛋白质和多聚糖形成复与蛋白质和多聚糖形成复与蛋白质和多聚糖形成复与蛋白质和多聚糖形成复合物，不能沉淀核酸。合物，不能沉淀核酸。合物，不能沉淀核酸。合物，不能沉淀核酸。ooCTABCTABCTABCTAB溶液在低于溶液在低于溶液在低于溶液在低于15151515时会形成沉淀析出，因此，
8、在将其时会形成沉淀析出，因此，在将其时会形成沉淀析出，因此，在将其时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于低于低于低于15151515。另外，它还能保护。另外，它还能保护。另外，它还能保护。另外，它还能保护DNADNADNADNA不受内源核酸酶的降不受内源核酸酶的降不受内源核酸酶的降不受内源核酸酶的降解。解。解。解。 基因工程的主要操作技术及原理高盐提取高盐提取-低盐沉淀低盐沉淀-高盐溶解高盐溶解-乙醇乙醇沉淀
9、沉淀o经典的经典的经典的经典的CTABCTABCTABCTAB法使用两种缓冲液，法使用两种缓冲液，法使用两种缓冲液，法使用两种缓冲液， o高盐提取缓冲液：高盐提取缓冲液：高盐提取缓冲液：高盐提取缓冲液：1 1 1 1（冷冻干燥材料）或（冷冻干燥材料）或（冷冻干燥材料）或（冷冻干燥材料）或2 2 2 2CTABCTABCTABCTAB（新鲜材料）、（新鲜材料）、（新鲜材料）、（新鲜材料）、0.7mol0.7mol0.7mol0.7mol或或或或1.4mol/L NaCl1.4mol/L NaCl1.4mol/L NaCl1.4mol/L NaClo沉淀缓冲液：沉淀缓冲液：沉淀缓冲液：沉淀缓冲液：
10、1 1 1 1CTABCTABCTABCTAB，不含，不含，不含，不含NaclNaclNaclNacl基因工程的主要操作技术及原理操作步骤操作步骤o1、取幼嫩的植物叶片（3-5g）剪碎液氮研磨成粉，转入1.5ml离心管内。加入等体积的65预热的DNA提取缓冲液置于65的恒温水浴摇床上1-2h(1.5h)。o2、加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，轻轻上下颠倒5分钟，静置5分钟，之后于12000rpm离心10分钟。 3、吸取上层水相，重复步骤2一次。o4、吸取上层水相，加入预冷2/3体积的异丙醇，轻缓颠倒2分钟并置-20冰箱内10min，待DNA沉淀后于12000rpm离心收集，收集的DNA于
11、70%乙醇中洗2-3次。将弃去乙醇风干后的DNA加适量水使其溶解。基因工程的主要操作技术及原理o5、待DNA完全溶解后加入1-2l不含RNAaseA（10mg/ml），37保温1h以除去DNA中的RNA。 6、于Eppendorf管中加入1mL氯仿：异戊醇（24：1）轻轻上下颠倒10分钟后10000rpm离心10分钟。o7、吸取上层水相并先后加入1/10体积的3M醋酸钠及2倍总体积的预冷的无水乙醇，接着置于-20冰箱，10分钟后10000rpm离心10分钟，弃去无水乙醇，加入70乙醇洗涤2-3次，风干，最后将DNA溶于适量（200-500l） TE中。o8、待DNA完全溶解后进行1%琼脂糖凝胶
12、电泳，检查DNA的质量并据已知的DNA 分子量标准估计其浓度。调整浓度后的DNA置于-20备用。 基因工程的主要操作技术及原理CTABCTAB法的优点法的优点o能很好地去除糖类杂质对于含糖较高的材料可能很好地去除糖类杂质对于含糖较高的材料可能很好地去除糖类杂质对于含糖较高的材料可能很好地去除糖类杂质对于含糖较高的材料可优先使用。优先使用。优先使用。优先使用。o在提取时能同时得到高质量的在提取时能同时得到高质量的在提取时能同时得到高质量的在提取时能同时得到高质量的DNADNADNADNA及及及及RNARNARNARNA。可根。可根。可根。可根据需要分别进行纯化，如只需要据需要分别进行纯化，如只需
13、要据需要分别进行纯化，如只需要据需要分别进行纯化，如只需要DNADNADNADNA，则可用，则可用，则可用，则可用RNaseRNaseRNaseRNase（核糖核酸酶）水解掉（核糖核酸酶）水解掉（核糖核酸酶）水解掉（核糖核酸酶）水解掉RNARNARNARNA。基因工程的主要操作技术及原理 (2) SDS(2) SDS法法 n利用高浓度的利用高浓度的利用高浓度的利用高浓度的SDSSDSSDSSDS，在较高温度，在较高温度，在较高温度，在较高温度(55(55(55(5565)65)65)65)条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变条件下裂解细胞，使染色体离析，
14、蛋白质变条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的做法使蛋白质及多糖杂质沉淀低温度的做法使蛋白质及多糖杂质沉淀低温度的做法使蛋白质及多糖杂质沉淀低温度的做法使蛋白质及多糖杂质沉淀( ( ( (最最最最常用的是加入常用的是加入常用的是加入常用的是加入5mol5mol5mol5molL L L L的的的的KAcKAcKAcKAc于冰上保温，在于冰上保温，在于冰上保温，在于冰上保温，在低温条件下低温条件下低温条件下低温条件下KACKACKACKA
15、C与蛋白质及多糖结合成不溶与蛋白质及多糖结合成不溶与蛋白质及多糖结合成不溶与蛋白质及多糖结合成不溶物物物物) ) ) )，离心除去沉淀后，上清液中的，离心除去沉淀后，上清液中的，离心除去沉淀后，上清液中的，离心除去沉淀后，上清液中的DNADNADNADNA用酚用酚用酚用酚氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的的的的DNADNADNADNA。基因工程的主要操作技术及原理操作步骤操作步骤o1. 将1g植物材料于液氮速冻，然后在研钵中将其磨碎，将粉末转至2 ml离心管中。o2. 加入1.2ml
16、预热至65的提取缓冲液(3V)，轻缓振荡混匀，加入120l 20%SDS(达到终浓度2%)，混匀，置65水浴中放置30分钟，不时颠倒混匀。o3. 加入0.45ml 5M的醋酸钾（1/10V），混匀，冰浴20分钟，在10000 rpm离心20 min。需要的话，Miracloth纱布过滤除去沉淀，取上清液转入另一离心管中。o4. 加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀， 12000 rpm离心15 min。基因工程的主要操作技术及原理o5. 转移上清液到另一新离心管中，加入0.7V冰预冷异丙醇，轻轻颠倒混匀，（见丝状沉淀）-20放置30分钟沉淀核酸。 o6. 25，12000 rpm，
17、离心10 min，收集沉淀。o7. 弃上清，70乙醇洗两次。o8. 凉干DNA，溶于50 l ddH2O（或TE buffer），4保存备用。基因工程的主要操作技术及原理SDS SDS 法的优缺点法的优缺点o优点：优点：优点：优点：SDSSDSSDSSDS法操作简单、温和，也可提取到分子法操作简单、温和，也可提取到分子法操作简单、温和，也可提取到分子法操作简单、温和，也可提取到分子量较高的量较高的量较高的量较高的DNADNADNADNA。o缺点：产物含糖类杂质较多。缺点：产物含糖类杂质较多。缺点：产物含糖类杂质较多。缺点：产物含糖类杂质较多。o该方法所得的该方法所得的该方法所得的该方法所得的D
18、NADNADNADNA样品也可直接用于样品也可直接用于样品也可直接用于样品也可直接用于SouthernSouthernSouthernSouthern杂杂杂杂交，但在限制性内切酶消化时需加大酶用量，并交，但在限制性内切酶消化时需加大酶用量，并交，但在限制性内切酶消化时需加大酶用量，并交，但在限制性内切酶消化时需加大酶用量，并适当延长反应时间。适当延长反应时间。适当延长反应时间。适当延长反应时间。基因工程的主要操作技术及原理2 2、动物细胞总、动物细胞总DNADNA提取提取o取材，液氮研磨，裂解，去蛋白和细胞物，浓取材，液氮研磨，裂解，去蛋白和细胞物，浓取材，液氮研磨，裂解，去蛋白和细胞物，浓取
19、材，液氮研磨，裂解，去蛋白和细胞物，浓缩。缩。缩。缩。o裂解采用：裂解采用：裂解采用：裂解采用：SDSSDSSDSSDS和蛋白酶和蛋白酶和蛋白酶和蛋白酶 K K K K。基因工程的主要操作技术及原理操作步骤操作步骤1.1.切取组织切取组织切取组织切取组织5g5g5g5g左右左右左右左右, , , ,剔除结缔组织剔除结缔组织剔除结缔组织剔除结缔组织, , , ,吸水纸吸干吸水纸吸干吸水纸吸干吸水纸吸干血液血液血液血液, , , ,剪碎放入研钵剪碎放入研钵剪碎放入研钵剪碎放入研钵( ( ( (越细越好越细越好越细越好越细越好) ) ) )。 2.2.倒入液氮倒入液氮倒入液氮倒入液氮, , , ,磨
20、成粉末磨成粉末磨成粉末磨成粉末, , , ,加加加加10ml10ml10ml10ml分离缓冲液。分离缓冲液。分离缓冲液。分离缓冲液。 3.3.加加加加1ml 10% SDS, 1ml 10% SDS, 1ml 10% SDS, 1ml 10% SDS, 混匀混匀混匀混匀, , , ,此时样品变得很粘稠。此时样品变得很粘稠。此时样品变得很粘稠。此时样品变得很粘稠。 4.4.加加加加50ul50ul50ul50ul或或或或1mg 1mg 1mg 1mg 蛋白酶蛋白酶蛋白酶蛋白酶 K, 37K, 37K, 37K, 37保温保温保温保温1-21-21-21-2小时小时小时小时, , , , 直到组织
21、完全解体。直到组织完全解体。直到组织完全解体。直到组织完全解体。5.5.加加加加1ml 5mol/L NaCl, 1ml 5mol/L NaCl, 1ml 5mol/L NaCl, 1ml 5mol/L NaCl, 混匀混匀混匀混匀,10000rpm,10000rpm,10000rpm,10000rpm离心数离心数离心数离心数秒钟。秒钟。秒钟。秒钟。6.6.取上清液于新离心管，用等体积酚取上清液于新离心管，用等体积酚取上清液于新离心管，用等体积酚取上清液于新离心管，用等体积酚: : : :氯仿氯仿氯仿氯仿: : : :异异异异戊醇戊醇戊醇戊醇(25:24:1)(25:24:1)(25:24:1
22、)(25:24:1)抽提。待分层后抽提。待分层后抽提。待分层后抽提。待分层后,10000rpm,10000rpm,10000rpm,10000rpm离离离离心心心心 5 5 5 5分钟。分钟。分钟。分钟。基因工程的主要操作技术及原理7.7. 取上清加取上清加取上清加取上清加1/10 1/10 1/10 1/10 体积体积体积体积3mol/L NaAc, 3mol/L NaAc, 3mol/L NaAc, 3mol/L NaAc, 及及及及2 2 2 2倍体倍体倍体倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀积无水乙醇颠倒混合沉淀积无水乙醇颠倒混合沉淀积无水乙醇颠倒混合沉淀DNADNADNADNA。室温下静止。室
23、温下静止。室温下静止。室温下静止10-2010-2010-2010-20分钟，分钟，分钟，分钟，DNADNADNADNA沉淀形成白色絮状物。沉淀形成白色絮状物。沉淀形成白色絮状物。沉淀形成白色絮状物。8.8.4444，12000 g12000 g12000 g12000 g离心离心离心离心10101010分钟，弃上清。分钟，弃上清。分钟，弃上清。分钟，弃上清。9.9.70%70%70%70%乙醇洗涤；乙醇洗涤；乙醇洗涤；乙醇洗涤；4444，12000 g12000 g12000 g12000 g离心离心离心离心5 5 5 5分钟，弃分钟，弃分钟，弃分钟，弃上清，重复本步骤上清，重复本步骤上清，
24、重复本步骤上清，重复本步骤1 1 1 1次。次。次。次。10.10.自然干燥后加入自然干燥后加入自然干燥后加入自然干燥后加入1TE1TE1TE1TE或超纯水或超纯水或超纯水或超纯水30-50l30-50l30-50l30-50l，4 or -204 or -204 or -204 or -20保存。保存。保存。保存。基因工程的主要操作技术及原理3 3、大肠杆菌总、大肠杆菌总DNADNA提取提取o基本思路：基本思路：基本思路：基本思路：o（1 1 1 1） a culture of bacteria is grown a culture of bacteria is grown a cultur
25、e of bacteria is grown a culture of bacteria is grown and then harvested and then harvested and then harvested and then harvested o（2 2 2 2） the cells are broken open to the cells are broken open to the cells are broken open to the cells are broken open to release their contentsrelease their content
26、srelease their contentsrelease their contents基因工程的主要操作技术及原理o裂解裂解裂解裂解机械裂解机械裂解机械裂解机械裂解化学裂解：溶菌酶化学裂解：溶菌酶化学裂解：溶菌酶化学裂解：溶菌酶 or EDTA or both or EDTA or both or EDTA or both or EDTA or both SDSSDSSDSSDS基因工程的主要操作技术及原理o(3) this cell extract is treated to (3) this cell extract is treated to (3) this cell extrac
27、t is treated to (3) this cell extract is treated to remove all component except the DNAremove all component except the DNAremove all component except the DNAremove all component except the DNAn去蛋白：酚氯仿抽提去蛋白：酚氯仿抽提去蛋白：酚氯仿抽提去蛋白：酚氯仿抽提o(4) The resulting DNA solution is (4) The resulting DNA solution is (4
28、) The resulting DNA solution is (4) The resulting DNA solution is concentratedconcentratedconcentratedconcentratedn浓缩：乙醇，加单价阳离子，如浓缩：乙醇，加单价阳离子，如浓缩：乙醇，加单价阳离子，如浓缩：乙醇，加单价阳离子，如Na+Na+Na+Na+n-20-20-20-20放置放置放置放置, , , ,离心。离心。离心。离心。基因工程的主要操作技术及原理基因工程的主要操作技术及原理操作步骤操作步骤1.1.1.1.100ml 100ml 100ml 100ml 细菌过夜培养液细菌
29、过夜培养液细菌过夜培养液细菌过夜培养液, 5000rpm, 5000rpm, 5000rpm, 5000rpm离心离心离心离心10101010分钟分钟分钟分钟, , , , 去上清去上清去上清去上清液。液。液。液。2.2.2.2.加加加加9.5ml TE9.5ml TE9.5ml TE9.5ml TE悬浮沉淀悬浮沉淀悬浮沉淀悬浮沉淀, , , , 并加并加并加并加0.5ml 10% SDS, 50l 0.5ml 10% SDS, 50l 0.5ml 10% SDS, 50l 0.5ml 10% SDS, 50l 20mg/ml(20mg/ml(20mg/ml(20mg/ml(或或或或1mg1m
30、g1mg1mg干粉干粉干粉干粉) ) ) )蛋白酶蛋白酶蛋白酶蛋白酶 K, K, K, K, 混匀混匀混匀混匀, 37, 37, 37, 37保温保温保温保温1 1 1 1小时。小时。小时。小时。 3.3.3.3.加加加加1.5ml 5mol/L NaCl, 1.5ml 5mol/L NaCl, 1.5ml 5mol/L NaCl, 1.5ml 5mol/L NaCl, 混匀。混匀。混匀。混匀。 4.4.4.4.加加加加1.5ml CTAB/NaCl1.5ml CTAB/NaCl1.5ml CTAB/NaCl1.5ml CTAB/NaCl溶液溶液溶液溶液, , , , 混匀混匀混匀混匀, 65
31、, 65, 65, 65保温保温保温保温20202020分钟。分钟。分钟。分钟。 5.5.5.5.用等体积酚用等体积酚用等体积酚用等体积酚: : : :氯仿氯仿氯仿氯仿: : : :异戊醇异戊醇异戊醇异戊醇(25:24:1)(25:24:1)(25:24:1)(25:24:1)抽提抽提抽提抽提, 5000rpm, 5000rpm, 5000rpm, 5000rpm离心离心离心离心10101010分钟分钟分钟分钟, , , , 将上清液移至干净离心管。将上清液移至干净离心管。将上清液移至干净离心管。将上清液移至干净离心管。 6.6.6.6.用等体积氯仿用等体积氯仿用等体积氯仿用等体积氯仿: :
32、: :异戊醇异戊醇异戊醇异戊醇(24:1)(24:1)(24:1)(24:1)抽提抽提抽提抽提, , , , 取上清液移至干净取上清液移至干净取上清液移至干净取上清液移至干净管中。管中。管中。管中。 基因工程的主要操作技术及原理操作步骤操作步骤7.7.加加加加1 1 1 1倍体积异丙醇倍体积异丙醇倍体积异丙醇倍体积异丙醇, , , , 颠倒混合颠倒混合颠倒混合颠倒混合, , , , 室温下静止室温下静止室温下静止室温下静止10101010分钟，沉淀分钟，沉淀分钟，沉淀分钟，沉淀DNADNADNADNA。 8.8.4444，12000 g12000 g12000 g12000 g离心离心离心离心
33、10101010分钟，弃上清；分钟，弃上清；分钟，弃上清；分钟，弃上清；9.9.70%70%70%70%乙醇洗涤；乙醇洗涤；乙醇洗涤；乙醇洗涤；4444，12000 g12000 g12000 g12000 g离心离心离心离心5 5 5 5分钟，弃上分钟，弃上分钟，弃上分钟，弃上清，重复本步骤清，重复本步骤清，重复本步骤清，重复本步骤1 1 1 1次次次次; ; ; ;10.10.自然干燥后加入自然干燥后加入自然干燥后加入自然干燥后加入1TE1TE1TE1TE或超纯水或超纯水或超纯水或超纯水30-50l30-50l30-50l30-50l，4 4 4 4 or -20or -20or -20o
34、r -20保存。保存。保存。保存。基因工程的主要操作技术及原理4 4、质粒、质粒DNADNA提取提取o如何区分细菌和质粒如何区分细菌和质粒如何区分细菌和质粒如何区分细菌和质粒DNA?DNA?DNA?DNA?二者二者二者二者DNADNADNADNA分子的构型不同分子的构型不同分子的构型不同分子的构型不同大肠杆菌染色体大肠杆菌染色体大肠杆菌染色体大肠杆菌染色体DNADNADNADNA构型：线性的或开环的构型：线性的或开环的构型：线性的或开环的构型：线性的或开环的DNADNADNADNA分子分子分子分子 质粒：共价闭合环状的质粒：共价闭合环状的质粒：共价闭合环状的质粒：共价闭合环状的DNA (ccc
35、DNA)DNA (cccDNA)DNA (cccDNA)DNA (cccDNA)分子分子分子分子基因工程的主要操作技术及原理碱法提取质粒的原理碱法提取质粒的原理oopHpHpHpH值值值值12.012.012.012.012.612.612.612.6。oo线性的线性的线性的线性的DNADNADNADNA会被变性，两条链彻底分开。会被变性，两条链彻底分开。会被变性，两条链彻底分开。会被变性，两条链彻底分开。oo而而而而cccDNAcccDNAcccDNAcccDNA则不会被变性。但氢键会被断裂，互补的则不会被变性。但氢键会被断裂，互补的则不会被变性。但氢键会被断裂，互补的则不会被变性。但氢键会
36、被断裂，互补的两条链仍然会紧密地结合在一起。两条链仍然会紧密地结合在一起。两条链仍然会紧密地结合在一起。两条链仍然会紧密地结合在一起。oo中性中性中性中性pHpHpHpH值值值值cccDNA:cccDNA:cccDNA:cccDNA:迅速地复性。迅速地复性。迅速地复性。迅速地复性。oo线性的染色体线性的染色体线性的染色体线性的染色体DNA:DNA:DNA:DNA:不能复性不能复性不能复性不能复性, , , ,聚集形成网状的结构。聚集形成网状的结构。聚集形成网状的结构。聚集形成网状的结构。oo离心离心离心离心: : : : 在上清液在上清液在上清液在上清液-cccDNA-cccDNA-cccDN
37、A-cccDNA。oo沉淀中：线性沉淀中：线性沉淀中：线性沉淀中：线性DNADNADNADNA和细胞残骸蛋白。和细胞残骸蛋白。和细胞残骸蛋白。和细胞残骸蛋白。基因工程的主要操作技术及原理提取的主要步骤提取的主要步骤细菌的培养细菌的培养质粒质粒DNA的分离和纯化的分离和纯化细菌的收集和裂解细菌的收集和裂解基因工程的主要操作技术及原理试剂试剂1.1.溶液溶液溶液溶液: 50mM: 50mM: 50mM: 50mM葡萄糖，葡萄糖，葡萄糖，葡萄糖，25mM Tris-HCl (pH 25mM Tris-HCl (pH 25mM Tris-HCl (pH 25mM Tris-HCl (pH 8.0)8.
38、0)8.0)8.0)，10 mM EDTA (pH 8.010 mM EDTA (pH 8.010 mM EDTA (pH 8.010 mM EDTA (pH 8.0）2.2.溶液溶液溶液溶液: 0.2 M NaOH: 0.2 M NaOH: 0.2 M NaOH: 0.2 M NaOH，1% SDS1% SDS1% SDS1% SDS3.3.溶液溶液溶液溶液:醋酸钾（醋酸钾（醋酸钾（醋酸钾（3M KAc3M KAc3M KAc3M KAc）缓冲液，）缓冲液，）缓冲液，）缓冲液，pH 4.8pH 4.8pH 4.8pH 4.84.4.TETETETE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)
39、10mM Tris-HCl(pH 8.0)10mM Tris-HCl(pH 8.0)10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA (pH 1mM EDTA (pH 1mM EDTA (pH 1mM EDTA (pH 8.0)8.0)8.0)8.0)5.5.苯酚苯酚苯酚苯酚/ / / /氯仿氯仿氯仿氯仿/ / / /异戊醇（异戊醇（异戊醇（异戊醇（25252525: 24242424: 1 1 1 1）6.6.乙醇（无水乙醇、乙醇（无水乙醇、乙醇（无水乙醇、乙醇（无水乙醇、70%70%70%70%乙醇）乙醇）乙醇）乙醇）基因工程的主要操作技术及原理挑取挑取LBLB固体培养基上生长
40、的单菌落，接种于固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0mL 2.0mL LBLB（含相应抗生素）液体培养基中，（含相应抗生素）液体培养基中，3737、250g250g振荡培养过夜（约振荡培养过夜（约12-14hr12-14hr）。）。用用2ml2ml离心管收集培养菌液；离心管收集培养菌液；44，12000 g12000 g离心离心1 1分钟，弃上清。分钟，弃上清。加入加入100l100l冰浴的质粒提取液冰浴的质粒提取液I I，涡旋混匀。，涡旋混匀。加加200l 200l 新配制的质粒提取液新配制的质粒提取液IIII，盖紧管口，轻，盖紧管口，轻轻颠倒数次，冰浴轻颠倒数次，冰浴5 5分钟。分钟。加
41、加150l150l冰浴的质粒提取液冰浴的质粒提取液IIIIII，轻轻颠倒数次，轻轻颠倒数次，冰浴冰浴5 5分钟。分钟。操作步骤操作步骤基因工程的主要操作技术及原理操作步骤操作步骤44，12000 g12000 g离心离心510510分钟，将上清移至新离心管中，分钟，将上清移至新离心管中，加入加入10l RNA10l RNA酶酶(1g/l)(1g/l)，3737处理处理2 2小时。小时。用等体积酚用等体积酚用等体积酚用等体积酚: : : :氯仿氯仿氯仿氯仿: : : :异戊醇异戊醇异戊醇异戊醇(25:24:1)(25:24:1)(25:24:1)(25:24:1)抽提，充分混匀；抽提，充分混匀；
42、抽提，充分混匀；抽提，充分混匀；4444，12000 g12000 g12000 g12000 g离心离心离心离心5 5 5 5分钟，将上清移入新的离心管中。分钟，将上清移入新的离心管中。分钟，将上清移入新的离心管中。分钟，将上清移入新的离心管中。加入等体积的氯仿：异戊醇加入等体积的氯仿：异戊醇(24(24：1)1)，充分混匀；，充分混匀；44，12000 g12000 g离心离心5 5分钟，将上清移入新的离心管中。分钟，将上清移入新的离心管中。加加2 2倍体积的预冷的无水乙醇，轻轻混匀，倍体积的预冷的无水乙醇，轻轻混匀，-20-20放置放置3030分钟分钟11小时。小时。44，12000 g
43、12000 g离心离心1010分钟，弃上清。分钟，弃上清。k k70%70%乙醇洗涤；乙醇洗涤；44，12000 g12000 g离心离心5 5分钟，弃上清，重分钟，弃上清，重复本步骤复本步骤1 1次。次。l l自然干燥后加入自然干燥后加入1TE1TE或超纯水或超纯水30-50l30-50l，4 or -4 or -2020保存。保存。基因工程的主要操作技术及原理氯化铯密度梯度离心法纯化质粒氯化铯密度梯度离心法纯化质粒DNADNA o大大大大肠肠肠肠杆杆杆杆菌菌菌菌染染染染色色色色体体体体DNADNADNADNA构构构构型型型型：线线线线性性性性的的的的或或或或开开开开环环环环的的的的DNAD
44、NADNADNA分分分分子子子子因因因因其其其其具具具具有有有有游游游游离离离离的的的的末末末末端端端端而而而而易易易易于于于于解解解解旋旋旋旋，故故故故可可可可结结结结合相当大量的合相当大量的合相当大量的合相当大量的EBEBEBEB分子浮力密度小分子浮力密度小分子浮力密度小分子浮力密度小。o质质质质粒粒粒粒共共共共价价价价闭闭闭闭合合合合环环环环状状状状的的的的DNA(cccDNA)DNA(cccDNA)DNA(cccDNA)DNA(cccDNA)分分分分子子子子，由由由由于于于于没没没没有有有有游游游游离离离离的的的的末末末末端端端端，只只只只能能能能发发发发生生生生有有有有限限限限的的的
45、的解解解解旋旋旋旋反反反反应应应应， 便便便便限制了限制了限制了限制了EBEBEBEB分子的结合数量，浮力密度大。分子的结合数量，浮力密度大。分子的结合数量，浮力密度大。分子的结合数量，浮力密度大。基因工程的主要操作技术及原理RNARNA的提取的提取基因工程的主要操作技术及原理防止防止RNARNA降解，抑制降解，抑制RNAseRNAse活性活性oo所有的组织中均存在所有的组织中均存在所有的组织中均存在所有的组织中均存在RNARNARNARNA酶，人的皮肤、手指、试剂、酶，人的皮肤、手指、试剂、酶，人的皮肤、手指、试剂、酶，人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染。容器等均可能被污染。容器等均可
46、能被污染。容器等均可能被污染。1.1.1.1.需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。2.2.2.2.所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中 200200200200烘烤烘烤烘烤烘烤2 2 2 2小时以小时以小时以小时以上。上。上。上。3.3.3.3.材料如塑料容器等皆可用材料如塑料容器等皆可用材料如塑料容器等皆可用材料如塑料容器等皆可用0.1%0.1%0.1%0.1%的焦碳酸二乙酯的焦
47、碳酸二乙酯的焦碳酸二乙酯的焦碳酸二乙酯(DEPC)(DEPC)(DEPC)(DEPC)水溶液处理水溶液处理水溶液处理水溶液处理, , , ,高压灭菌。高压灭菌。高压灭菌。高压灭菌。 DEPCDEPCDEPCDEPC: : : :一种高活性的烷基化试剂。常用做核酸酶抑制剂一种高活性的烷基化试剂。常用做核酸酶抑制剂一种高活性的烷基化试剂。常用做核酸酶抑制剂一种高活性的烷基化试剂。常用做核酸酶抑制剂( ( ( (特别是用于灭活广泛存在的核糖核酸酶特别是用于灭活广泛存在的核糖核酸酶特别是用于灭活广泛存在的核糖核酸酶特别是用于灭活广泛存在的核糖核酸酶) ) ) )、组氨酸残、组氨酸残、组氨酸残、组氨酸残
48、基修饰剂等。基修饰剂等。基修饰剂等。基修饰剂等。 基因工程的主要操作技术及原理DEPCDEPC使用方法使用方法1.1.1.1.DEPCDEPCDEPCDEPC是是是是RNARNARNARNA酶的化学修饰剂酶的化学修饰剂酶的化学修饰剂酶的化学修饰剂, , , ,它和它和它和它和RNARNARNARNA酶的活性基团组酶的活性基团组酶的活性基团组酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。2.2.2.2.DEPCDEPCDEPCDEPC与氨水溶液混合会产生致癌物与氨水溶液混合会产生致癌物与氨水溶液混合会产生致癌
49、物与氨水溶液混合会产生致癌物, , , ,因而使用时需小因而使用时需小因而使用时需小因而使用时需小心。心。心。心。3.3.3.3.试剂也可用试剂也可用试剂也可用试剂也可用DEPCDEPCDEPCDEPC处理处理处理处理, , , ,加入加入加入加入DEPCDEPCDEPCDEPC至至至至0.1%0.1%0.1%0.1%浓度高压灭菌浓度高压灭菌浓度高压灭菌浓度高压灭菌以消除残存的以消除残存的以消除残存的以消除残存的DEPC,DEPC,DEPC,DEPC,否则否则否则否则DEPCDEPCDEPCDEPC也能和腺嘌呤作用而破也能和腺嘌呤作用而破也能和腺嘌呤作用而破也能和腺嘌呤作用而破坏坏坏坏mRNA
50、mRNAmRNAmRNA活性。活性。活性。活性。4.4.4.4.DEPCDEPCDEPCDEPC能与胺和巯基反应能与胺和巯基反应能与胺和巯基反应能与胺和巯基反应, , , ,因而含因而含因而含因而含TrisTrisTrisTris和和和和DTTDTTDTTDTT的试剂不能的试剂不能的试剂不能的试剂不能用用用用DEPCDEPCDEPCDEPC处理。处理。处理。处理。TrisTrisTrisTris溶液可用溶液可用溶液可用溶液可用DEPCDEPCDEPCDEPC处理的水配制然后高处理的水配制然后高处理的水配制然后高处理的水配制然后高压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌压
51、灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌, , , ,可用可用可用可用DEPCDEPCDEPCDEPC处理处理处理处理水配制。水配制。水配制。水配制。基因工程的主要操作技术及原理提取方法提取方法o异硫氰酸胍热苯酚法异硫氰酸胍热苯酚法异硫氰酸胍热苯酚法异硫氰酸胍热苯酚法oTrizol Trizol Trizol Trizol 法法法法omRNA 3mRNA 3mRNA 3mRNA 3 末端含有多聚末端含有多聚末端含有多聚末端含有多聚(A)+ (A)+ (A)+ (A)+ 吸附纯化吸附纯化吸附纯化吸附纯化基因工程的主要操作技术及原理动植物组织动植物组织mRNAmRNA提取提取
52、o1 1 1 1、无、无、无、无RNARNARNARNA酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶装酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶装酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶装酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶装蒸馏水，然后加入蒸馏水，然后加入蒸馏水，然后加入蒸馏水，然后加入0.1%0.1%0.1%0.1%的的的的DEPCDEPCDEPCDEPC（体积（体积（体积（体积/ / / /体积），体积），体积），体积），处理过夜后高压灭菌。处理过夜后高压灭菌。处理过夜后高压灭菌。处理过夜后高压灭菌。 2 2 2 2、75%75%75%75%乙醇：用乙醇：用乙醇：用乙醇：用DEPCDEPCDEPCDEPC处理水配制处理水配制处理
53、水配制处理水配制75%75%75%75%乙醇，（用乙醇，（用乙醇，（用乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。璃瓶中，存放于低温冰箱。璃瓶中，存放于低温冰箱。璃瓶中，存放于低温冰箱。基因工程的主要操作技术及原理（一）动植物总（一）动植物总RNARNA提取提取-Trizol-Trizol法法 适用范围适用范围适用范围适用范围:人类、动物、植物、微生物的组人类、动物、植物、微生物的组人类、动物、植物、微生物的组人类、动物、植物、微生物的组织或培养
54、细菌，织或培养细菌，织或培养细菌，织或培养细菌，(mg-g)(mg-g)(mg-g)(mg-g)o 优点优点优点优点 ：无蛋白和：无蛋白和：无蛋白和：无蛋白和DNADNADNADNA污染。污染。污染。污染。o 用途用途用途用途 ：1.1.NorthernNorthernNorthernNorthern斑点分析，斑点杂交，斑点分析，斑点杂交，斑点分析，斑点杂交，斑点分析，斑点杂交，Poly(A)+Poly(A)+Poly(A)+Poly(A)+分分分分离。离。离。离。2.2.体外翻译体外翻译体外翻译体外翻译RNaseRNaseRNaseRNase封阻分析。封阻分析。封阻分析。封阻分析。3.3.分
55、子克隆。分子克隆。分子克隆。分子克隆。基因工程的主要操作技术及原理o 组织液氮研磨组织液氮研磨组织液氮研磨组织液氮研磨o加加加加Trizol Trizol Trizol Trizol （50-100mg/1ml 50-100mg/1ml 50-100mg/1ml 50-100mg/1ml TrizolTrizolTrizolTrizol）室温放置室温放置室温放置室温放置5 5 5 5分钟分钟分钟分钟0.2 ml0.2 ml0.2 ml0.2 ml氯仿氯仿氯仿氯仿/1ml Trizol/1ml Trizol/1ml Trizol/1ml Trizol离心取上清离心取上清离心取上清离心取上清每每每
56、每mlTrizolmlTrizolmlTrizolmlTrizol液加液加液加液加0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml异丙醇异丙醇异丙醇异丙醇室温放置室温放置室温放置室温放置10min10min10min10min，离心取沉淀，离心取沉淀，离心取沉淀，离心取沉淀75%75%75%75%乙醇洗沉淀，干燥乙醇洗沉淀，干燥乙醇洗沉淀，干燥乙醇洗沉淀，干燥剧烈摇晃剧烈摇晃剧烈摇晃剧烈摇晃15151515秒，室温放置秒，室温放置秒，室温放置秒，室温放置2-32-32-32-3分钟分钟分钟分钟 12000 g 12000 g 12000 g 12000 g ，10 minutes10 minutes1
57、0 minutes10 minutes， 4 4 4 4 基因工程的主要操作技术及原理（二）（二）mRNAmRNA纯化纯化 o原理：原理：原理：原理：omRNA 3mRNA 3mRNA 3mRNA 3 末端末端末端末端-poly(A)+-poly(A)+-poly(A)+-poly(A)+，oligo(dT)oligo(dT)oligo(dT)oligo(dT)纤纤纤纤维素维素维素维素-oligd(T)-oligd(T)-oligd(T)-oligd(T)o高盐缓冲液，高盐缓冲液，高盐缓冲液，高盐缓冲液，mRNAmRNAmRNAmRNA特异的吸附特异的吸附特异的吸附特异的吸附o低盐浓度或蒸馏水
58、中，低盐浓度或蒸馏水中，低盐浓度或蒸馏水中，低盐浓度或蒸馏水中，mRNAmRNAmRNAmRNA洗脱洗脱洗脱洗脱o两次两次两次两次oligo(dT) oligo(dT) oligo(dT) oligo(dT) 纤维素柱，可得到较纯的纤维素柱，可得到较纯的纤维素柱，可得到较纯的纤维素柱，可得到较纯的mRNAmRNAmRNAmRNA基因工程的主要操作技术及原理植物病毒植物病毒RNARNA提取提取 o取提纯的病毒颗粒取提纯的病毒颗粒取提纯的病毒颗粒取提纯的病毒颗粒TMV -TMV -TMV -TMV -等体积酚等体积酚等体积酚等体积酚/ / / /氯仿抽提氯仿抽提氯仿抽提氯仿抽提-取上清取上清取上清
59、取上清 -等体积等体积等体积等体积酚酚酚酚/ / / /氯仿抽提氯仿抽提氯仿抽提氯仿抽提-取上清取上清取上清取上清-等等等等体积氯仿抽提体积氯仿抽提体积氯仿抽提体积氯仿抽提-乙醇沉淀乙醇沉淀乙醇沉淀乙醇沉淀 基因工程的主要操作技术及原理o核酸电泳核酸电泳oPCRPCR扩增扩增o分子杂交分子杂交o测序测序主要检测技术基因工程的主要操作技术及原理o基本原理基本原理oDNADNA或者或者RNARNA中磷酸基团是呈离子态的，可以中磷酸基团是呈离子态的，可以说说DNADNA和和RNARNA的多核苷酸链可以叫做多聚阴离的多核苷酸链可以叫做多聚阴离子，在电场下会向正极移动。子，在电场下会向正极移动。 核酸电
60、泳基因工程的主要操作技术及原理DNA/RNA的琼脂糖凝胶检测 基因工程的主要操作技术及原理一、实验原理一、实验原理 电泳是现在用于分离和纯化DNA/RNA片段的最常用技术。当制备好的一块“胶”即一块包含电解质的多孔支持介质并把它置于静电场中，DNA/RNA分子将向阳极移动，这是因为DNA/RNA分子沿其双螺旋骨架两侧带有富含负电荷的磷酸根残基。基因工程的主要操作技术及原理o当DNA/RNA长度增加时，来自凝胶的阻力就会增加，不同长度的DNA/RNA片段就会出现不同的迁移率。因而就可依据DNA/RNA分子的大小使其分离。基因工程的主要操作技术及原理分离长度分离长度凝胶电泳凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼
61、脂糖凝胶电泳200bp近近50kb 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳 5500bp 分辨率高分辨率高o采用不同浓度的凝胶可以分辨范围广泛的采用不同浓度的凝胶可以分辨范围广泛的DNA分子分子。基因工程的主要操作技术及原理不同浓度琼脂糖凝胶的分离范围不同浓度琼脂糖凝胶的分离范围 凝胶中的琼脂糖含量%（W/V）DNA/RNA分子的分离范围（ kb ）0.35600.61200.70.8100.90.571.20.461.50.2320.12基因工程的主要操作技术及原理EB染料染料 o溴化乙锭（溴化乙锭（EB）是一种吖啶类染料，它）是一种吖啶类染料，它在紫外灯照射下能发射荧光，当在紫外灯照射下能发
62、射荧光，当DNA样样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的的EB就插入就插入DNA分子中形成荧光络合物，分子中形成荧光络合物，使使DNA发射的荧光增强几十倍，电泳后发射的荧光增强几十倍，电泳后就可直接紫外灯照射下检测琼脂糖中的就可直接紫外灯照射下检测琼脂糖中的DNA。 基因工程的主要操作技术及原理电泳缓冲液的组成电泳缓冲液的组成 1.Tris乙酸（乙酸（TAE）2.Tris硼酸（硼酸（TBE）3.Tris磷酸（磷酸（TPE） 其浓度约为其浓度约为50mmoL/L，PH为为7.57.8，这些缓冲液均含有，这些缓冲液均含有EDTA。这些缓。这些缓冲液通常配制成浓
63、缩液（母液），贮存于冲液通常配制成浓缩液（母液），贮存于室温。室温。 基因工程的主要操作技术及原理常用的电泳缓冲液的配制常用的电泳缓冲液的配制缓冲液冲液使用液使用液浓贮存液（每升）存液（每升）Tris乙酸乙酸（TAE）1：0.04moL/L Tris乙酸乙酸 0.001moL/L EDTA 50：242g Tris碱碱57.7mL 冰乙酸冰乙酸100mL 0.5moL/L EDTA (PH8.0)Tris磷酸磷酸（TPE）1：0.09moL/L Tris磷酸磷酸 0.002moL/L EDTA10：108g Tris碱碱15.5mL 85%磷酸磷酸40mL 0.5moL/L EDTA(PH8.
64、0)Tris硼酸硼酸（TBE）0.50.045moL/L Tris硼酸硼酸 0.001moL/L EDTA5：54g Tris碱碱27.5g硼酸硼酸20mL 0.5moL/L EDTA(PH8.0)基因工程的主要操作技术及原理电泳缓冲液比较电泳缓冲液比较缓冲液缓冲容量迁移速度分辨率用途TAE最低最快(高10)高分子量高高度复杂DNA混合物；超螺旋DNATBE很高较慢低分子量高价格昂贵，不常用TPE基因工程的主要操作技术及原理加样缓冲液加样缓冲液 缓冲液冲液类型型 6缓冲液冲液贮存温度存温度I 0.25%溴酚溴酚蓝 0.25%二甲苯青二甲苯青FF 40%（W/V）蔗糖水溶液）蔗糖水溶液4II 0
65、.25%溴酚溴酚蓝 0.25%二甲苯青二甲苯青FF 15%聚蔗糖水溶液聚蔗糖水溶液室温室温III 0.25%溴酚溴酚蓝 0.25%二甲苯青二甲苯青FF 30%甘油水溶液甘油水溶液4IV 0.25%溴酚溴酚蓝 40%（W/V蔗糖水溶液）蔗糖水溶液）4V（碱性加（碱性加样缓冲液）冲液） 300m moL/L NaoH 6 mmoL/L EDTA 18%聚蔗糖水溶液聚蔗糖水溶液 015%溴甲酚溴甲酚绿 025%二甲苯青二甲苯青FF4基因工程的主要操作技术及原理o加样缓冲液可以增大样品密度，以确保加样缓冲液可以增大样品密度，以确保DNA均匀进均匀进入样品孔内，还可以使样品呈现颜色，从而使加样入样品孔内
66、，还可以使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利。操作更为便利。o溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约为二甲苯青溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约为二甲苯青FF的的2.2倍，倍， 溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约与溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约与长长300bp的双链线性的双链线性DNA相同，而二甲苯青相同，而二甲苯青FF在在琼脂糖凝胶中移动的速率则与琼脂糖凝胶中移动的速率则与4kb双链线性双链线性DNA相相同。同。 基因工程的主要操作技术及原理DNA片段长度标记片段长度标记 oDNA片段长度标记通常叫作 DNA Marker, 实验使用的DNA片段长度标记，一般包括250bp ladder，DL20
67、00， DL5000，DL10000等，DNA Marker不仅可以作为凝胶中DNA片段长度的一个标记，还可以作为电泳的对照。基因工程的主要操作技术及原理基因工程的主要操作技术及原理基因工程的主要操作技术及原理基因工程的主要操作技术及原理将温热琼脂糖倒入胶床中，凝胶的厚度在将温热琼脂糖倒入胶床中，凝胶的厚度在35mm之间，凝固之间，凝固2060min。基因工程的主要操作技术及原理凝胶制备的注意事项凝胶制备的注意事项o1、配胶和电泳需要使用同一批次的缓冲液（一些限、配胶和电泳需要使用同一批次的缓冲液（一些限制酶缓冲液含有高浓度盐，能减慢制酶缓冲液含有高浓度盐，能减慢DNA的迁移，并可的迁移，并可
68、使临近孔泳带变斜）使临近孔泳带变斜）o2、琼脂糖要彻底熔化，时间不宜过长、琼脂糖要彻底熔化，时间不宜过长o3、EB含量要适当含量要适当o4、凝胶应存放在阴凉处，再次用时加入少量电泳液，、凝胶应存放在阴凉处，再次用时加入少量电泳液，再熔化再熔化o5、检查梳子、检查梳子o6、拔取梳子时应均匀用力，检查凝胶孔的整齐度、拔取梳子时应均匀用力，检查凝胶孔的整齐度o7、凝胶稍厚些，避免样品溢出、凝胶稍厚些，避免样品溢出基因工程的主要操作技术及原理注意事项与实验技巧注意事项与实验技巧o制胶和加样过程中要防治气泡的产生。制胶和加样过程中要防治气泡的产生。 oEB具有强诱变性，可致癌。必须戴手套操作，严格注意防
69、护。具有强诱变性，可致癌。必须戴手套操作，严格注意防护。o凝胶一定要加热熔解完全，均匀，可以对着光亮的地方看看清澈凝胶一定要加热熔解完全，均匀，可以对着光亮的地方看看清澈不清澈不清澈 ；o一般情况下，梳子越薄而长，条带越好看一般情况下，梳子越薄而长，条带越好看 ；o上样量不宜过多，会造成条带的相互挤压；上样量不宜过多，会造成条带的相互挤压； o如果点样孔多余，将样点到中间，尽量避免边缘效应如果点样孔多余，将样点到中间，尽量避免边缘效应 ，中间电，中间电场比较均匀场比较均匀 ；o做胶的缓冲液和跑胶的缓冲液浓度应该一致；做胶的缓冲液和跑胶的缓冲液浓度应该一致； o加样时不要太快，让其自然沉底，均匀
70、分布在电泳孔内，加样时不要太快，让其自然沉底，均匀分布在电泳孔内，Tip头头不宜插入样品孔太深，也不要穿破胶孔不宜插入样品孔太深，也不要穿破胶孔壁，否则样品渗漏或壁，否则样品渗漏或DNA带型不整齐带型不整齐；o电泳开始时可以采用低电压使其跑出孔后，再调高电压。电泳开始时可以采用低电压使其跑出孔后，再调高电压。基因工程的主要操作技术及原理迁移速率的决定因素 oDNADNADNADNA的分子大小的分子大小的分子大小的分子大小 线状双链线状双链线状双链线状双链DNADNADNADNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速
71、率与迁移速率与迁移速率与迁移速率与DNADNADNADNA分子量对数成反比。分子量对数成反比。分子量对数成反比。分子量对数成反比。o琼脂糖浓度琼脂糖浓度琼脂糖浓度琼脂糖浓度一个给定大小的线状一个给定大小的线状一个给定大小的线状一个给定大小的线状DNADNADNADNA分子分子分子分子, , , ,其迁移速度在不其迁移速度在不其迁移速度在不其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。o DNADNADNADNA分子的构象分子的构象分子的构象分子的构象 超螺旋超螺旋超螺旋超螺旋DNADNADNADNA移动环状
72、线状双链移动环状线状双链移动环状线状双链移动环状线状双链DNADNADNADNA基因工程的主要操作技术及原理oo电源电压电源电压电源电压电源电压 在低电压时在低电压时在低电压时在低电压时, , , ,线状线状线状线状DNADNADNADNA片段的迁移速率与所加电压片段的迁移速率与所加电压片段的迁移速率与所加电压片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的的的的DNADNADNADNA片段的迁移率将以不同的幅度增长片段的迁移率将以不同的幅度增长片段
73、的迁移率将以不同的幅度增长片段的迁移率将以不同的幅度增长, , , ,片段越片段越片段越片段越大大大大, , , ,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大, , , , 电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围减小。电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围减小。电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围减小。电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围减小。 电压不得超过电压不得超过电压不得超过电压不得超过5 5 5 5v/cmv/cmv/cmv/cm。 oo嵌入染料的存在嵌入染料的存在嵌入染料的存在嵌入染料的存在 E
74、BEBEBEB嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状的环状的环状的环状DNADNADNADNA，使其刚性更强使其刚性更强使其刚性更强使其刚性更强, , , ,还会使线状还会使线状还会使线状还会使线状DNADNADNADNA迁移率迁移率迁移率迁移率降低降低降低降低15151515。 。基因工程的主要操作技术及原理o 离子强度影响离子强度影响离子强度影响离子强度影响 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响电泳缓冲液的组成及其离子强度影响电泳缓冲液的组成及其离子强度影响电泳缓冲液
75、的组成及其离子强度影响DNADNADNADNA的电泳的电泳的电泳的电泳迁移率。在没有离子存在时迁移率。在没有离子存在时迁移率。在没有离子存在时迁移率。在没有离子存在时( ( ( (如误用蒸馏水配制如误用蒸馏水配制如误用蒸馏水配制如误用蒸馏水配制凝胶凝胶凝胶凝胶),),),),电导率最小电导率最小电导率最小电导率最小, , , ,DNADNADNADNA几乎不移动几乎不移动几乎不移动几乎不移动, , , ,在高离子强在高离子强在高离子强在高离子强度的缓冲液中度的缓冲液中度的缓冲液中度的缓冲液中( ( ( (如误加如误加如误加如误加10101010电泳缓冲液电泳缓冲液电泳缓冲液电泳缓冲液),),)
76、,),则电导则电导则电导则电导很高并明显产热很高并明显产热很高并明显产热很高并明显产热, , , ,严重时会引起凝胶熔化或严重时会引起凝胶熔化或严重时会引起凝胶熔化或严重时会引起凝胶熔化或DNADNADNADNA变性。变性。变性。变性。基因工程的主要操作技术及原理聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳基因工程的主要操作技术及原理 原理原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称 Acr)和 交 联 剂 N,N-甲 叉 双 丙 烯 酰 胺 (N， Nmethylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N，N四甲基乙二胺(N，N，N，Ntetramethyl
77、ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，简称AP)或核黄素(ribofavin即vita min B2，C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 (polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。基因工程的主要操作技术及原理o聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：1.在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；2.化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；3.
78、对pH和温度变化较稳定；4.几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；5.样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g；6.凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；7.分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。基因工程的主要操作技术及原理o凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关 分子量范围与凝胶浓度的关系 分子量范围 适用的凝胶浓度/(%) 蛋 白 质 104 20-30 1-4104 15-20 1-5104-1105 1
79、0-15 1105 5-10 5105 2-5 核酸(RNA) 104 1520 104105 5-10 105-2106 2-2.6基因工程的主要操作技术及原理o缓冲液：缓冲液：缓冲液：缓冲液：TBETBETBETBEo凝胶聚丙烯酰胺：丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺：丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺：丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺：丙烯酰胺/ / / / 亚甲双丙烯酰胺亚甲双丙烯酰胺亚甲双丙烯酰胺亚甲双丙烯酰胺（29292929：1 1 1 1）；）；）；）；TEMEDTEMEDTEMEDTEMED和过硫酸铵（和过硫酸铵（和过硫酸铵（和过硫酸铵（ 10101010 ）。）。）。）。o染色：一般为银染染色：一般为银染染
80、色：一般为银染染色：一般为银染聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳-DNA-DNA基因工程的主要操作技术及原理o缓冲系统的选择缓冲系统的选择 一般情况下，在被分析的蛋白质稳定的一般情况下，在被分析的蛋白质稳定的pH范围，凡不与范围，凡不与SDS发生相互作用的缓冲发生相互作用的缓冲液都可以使用，但缓冲液的选择对蛋白质的液都可以使用，但缓冲液的选择对蛋白质的分离和电泳的速度是非常关键的。分离和电泳的速度是非常关键的。SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳- -蛋白质蛋白质基因工程的主要操作技术及原理电泳缓冲液的种类：电泳缓冲液的种类：1、磷酸缓冲液、磷酸缓冲液2、Tris-醋酸钠缓冲
81、系统醋酸钠缓冲系统3、咪唑缓冲液系统：、咪唑缓冲液系统： 比磷酸缓冲系统的导电性低，电泳速度要比后者快一倍。比磷酸缓冲系统的导电性低，电泳速度要比后者快一倍。4、尿素系统：、尿素系统： 适用分子量低于适用分子量低于15kD的蛋白样品。的蛋白样品。5、Tris-甘氨酸系统：甘氨酸系统： 使用最多的缓冲液使用最多的缓冲液6、Tris-硼酸盐缓冲液：硼酸盐缓冲液： 测定糖蛋白的分子量测定糖蛋白的分子量基因工程的主要操作技术及原理oSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂
82、十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate,简称SDS)，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。因此可以利用SDS-PAGE测定蛋白质分子量。基因工程的主要操作技术及原理SDS及其作用及其作用o十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS)，是一种阴离子去污剂。它，是一种阴离子去污剂。它在水溶液中以单体（在水溶液中以单体（monomer）和分子）和分子团（团（micellae）的混合形式存在。）的混合形式存在。o作用：破坏作用：破坏蛋白质分子之间以及其他物质分蛋白质分子之间以及其他物质分子之间的子之间的非
83、共价键非共价键，使蛋白质变性而改变原，使蛋白质变性而改变原有的构象，保证蛋白质分子与有的构象，保证蛋白质分子与SDS充分结合充分结合而形成带负电荷的而形成带负电荷的蛋白质蛋白质-SDS复合物复合物。基因工程的主要操作技术及原理分离胶聚合之后分离胶聚合之后基因工程的主要操作技术及原理基因工程的主要操作技术及原理基因工程的主要操作技术及原理基因工程的主要操作技术及原理基因工程的主要操作技术及原理基因工程的主要操作技术及原理基因工程的主要操作技术及原理o纹理和脱尾理和脱尾现象：象：样品溶解不佳，加品溶解不佳，加样前离心。前离心。o蛋白蛋白带过宽：邻近泳道的蛋白加近泳道的蛋白加样量量过多。多。o指示指
84、示剂成微笑符号：凝胶不均匀冷却。成微笑符号：凝胶不均匀冷却。o指示指示剂成哭泣符号：凝胶和玻璃板成哭泣符号：凝胶和玻璃板组成成“三明治三明治”底部有气泡。底部有气泡。o凝胶凝胶时间不不对：凝胶太慢可能是：凝胶太慢可能是TEMED、 APS剂量不足或失效；凝胶太快：量不足或失效；凝胶太快：TEMED、 APS用用量量过多，胶太硬易裂。多，胶太硬易裂。SDS-PAGE 常见问题常见问题基因工程的主要操作技术及原理在在在在1983198319831983年，美国年，美国年，美国年，美国CetusCetusCetusCetus公司人类遗传研究室的公司人类遗传研究室的公司人类遗传研究室的公司人类遗传研究
85、室的科学家科学家科学家科学家K.B.MullisK.B.MullisK.B.MullisK.B.Mullis发明的。发明的。发明的。发明的。 PCRPCRPCRPCR是一种在体外快速扩增特定基因或是一种在体外快速扩增特定基因或是一种在体外快速扩增特定基因或是一种在体外快速扩增特定基因或DNADNADNADNA序序序序列的方法，又称之为体外扩增法。列的方法，又称之为体外扩增法。列的方法，又称之为体外扩增法。列的方法，又称之为体外扩增法。PCR技术基因工程的主要操作技术及原理核酸分子杂交（DNA/DNA or DNA/RNA）技术 核酸分子杂交技术，是在核酸分子杂交技术，是在核酸分子杂交技术，是在
86、核酸分子杂交技术，是在1968196819681968年由华盛顿卡年由华盛顿卡年由华盛顿卡年由华盛顿卡内基学院（内基学院（内基学院（内基学院（Cavnegie Institute of Cavnegie Institute of Cavnegie Institute of Cavnegie Institute of WashingtonWashingtonWashingtonWashington）的）的）的）的Roy BrittenRoy BrittenRoy BrittenRoy Britten及其同事发明的。所及其同事发明的。所及其同事发明的。所及其同事发明的。所依据的原理是，带有互补的特
87、定核苷酸序列的单依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链链链链DNADNADNADNA或或或或RNARNARNARNA，当它们混合在一起时，其相应的同，当它们混合在一起时，其相应的同，当它们混合在一起时，其相应的同，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。源区段将会退火形成双链的结构。源区段将会退火形成双链的结构。源区段将会退火形成双链的结构。 基因工程的主要操作技术及原理传统的传统的传统的传统的DNADNADNADNA序列分析法序列分析法序列分析法序列分析法1.1.SangerSangerSangerSanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法双脱氧链终止法双脱氧链终止法2.2.Maxam-GilbertMaxam-GilbertMaxam-GilbertMaxam-Gilbert化学分析法化学分析法化学分析法化学分析法 新发展的新发展的新发展的新发展的DNADNADNADNA测序法测序法测序法测序法DNA核苷酸序列分析基因工程的主要操作技术及原理此课件下载可自行编辑修改，供参考！此课件下载可自行编辑修改，供参考！感谢你的支持，我们会努力做得更好！感谢你的支持，我们会努力做得更好！
