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1、分子细胞遗传学分子细胞遗传学原位杂交原位杂交(In situ hybridization)1）同位素原位杂交同位素原位杂交(Isotopic in situ hybridization) 70年代年代 2）非同位素原位杂交）非同位素原位杂交(Non-isotopic in situ hybridization) 80年代中后期年代中后期 （1）免疫酶联）免疫酶联 （2）荧光原位杂交（）荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization, FISH)*同位素原位杂交的不足之处：同位素原位杂交的不足之处：1）不稳定；）不稳定；2）低特异性；）低特异性；3）高背景；）
2、高背景；4）暴光时间长；）暴光时间长；5）结果统计学处理繁琐。）结果统计学处理繁琐。Lichter P. Cremer T. Ward D.C.FISH: (Fluorescent In Situ Hybridization).FISH is the detection of highly specific DNA probes which have been hybridized to either interphase or metaphase chromosomes using fluorescence microscopy. DNA for probe use is labeled w
3、ith fluorescent (direct method) or non fluorescent molecules which are then detected by fluorescent antibodies (indirect method). The probes bind to a specific region or regions on the target chromosome. The chromosomes are then stained using a contrasting color, and the cells are viewed using a flu
4、orescence microscope.*荧光原位杂交的特点：荧光原位杂交的特点：1）快速；）快速；2）信号强；）信号强；3）特异性高；）特异性高；4）多色。）多色。*FISH有上述优点的原因：有上述优点的原因：1）使用了荧光标记与检测系统取代放射性标记与检测系统）使用了荧光标记与检测系统取代放射性标记与检测系统标记探针的物质：标记探针的物质：（1）生物素）生物素(biotin)/地高辛地高辛(digoxigenin) 半半抗原报告分子（间接标记）抗原报告分子（间接标记） （2）荧光物质（直接标记）荧光物质（直接标记） Cy2或或FluorX(绿色绿色) / Cy3(橙色橙色) / Cy3.
5、5(猩红色猩红色) / Cy5(红色红色) / Aqua(兰兰色色) 间接标记的信号检测（抗间接标记的信号检测（抗biotin或或digoxigenin抗体上连接荧光物质）物质：抗体上连接荧光物质）物质： conjugated to avidin or antibody of digoxigenin (1)Fluorescein isothiocyanate(FITC)或或Bidopy绿色绿色 (2)Texas Red, Rhodamine, 红色红色 (3)AMCA兰色兰色染色体复染的物质染色体复染的物质: Propidium Iodide (PI)（红色），红色），DAPI（兰色），兰色）
6、，quinacrine（绿色），绿色），chromomycine A3（绿色）绿色） 2）染色体）染色体“原位抑制原位抑制”杂交（杂交（chromosome in situ suppression, CISS)克服散在的重复序列造成的杂交背景，提高信号的特异性，在探针中加入过量克服散在的重复序列造成的杂交背景，提高信号的特异性，在探针中加入过量的未标记的竞争性的未标记的竞争性DNA(competitor DNA)，如如human Cot-1 DNA，进行杂交前进行杂交前的预复性。探针中的重复序列与加入的竞争物中的大量重复序列优先复性，而的预复性。探针中的重复序列与加入的竞争物中的大量重复序列优
7、先复性，而特异性的单拷贝序列因竞争物中同源序列拷贝数少，绝大部分仍保持单链状态。特异性的单拷贝序列因竞争物中同源序列拷贝数少，绝大部分仍保持单链状态。*FISH技术的应用技术的应用1）基因（或）基因（或DNA片段）的染色体定位；片段）的染色体定位；2）染色体数目与结构异常的检测；）染色体数目与结构异常的检测；3）间期细胞遗传学（绒毛）间期细胞遗传学（绒毛/羊水羊水/精子精子/卵裂球卵裂球/其它间期细胞研究与诊断）；其它间期细胞研究与诊断）；4）肿瘤遗传学研究）肿瘤遗传学研究*用于用于FISH的探针的探针1）单拷贝探针：）单拷贝探针： （1）种类：）种类：YAC， BAC， Cosmid，Pla
8、smid， cDNA片段片段 （2）应用）应用 （a）定位定位DNA片段及嵌合体克隆验证；片段及嵌合体克隆验证； （b）确定染色体微小缺失与重复；确定染色体微小缺失与重复； （c）染色体断裂点分析。染色体断裂点分析。 （d）间期细胞染色体数目异常诊断。间期细胞染色体数目异常诊断。左：左：DNA片段的染色体定位片段的染色体定位 右：嵌合体检出右：嵌合体检出FISH检测微小缺失检测微小缺失染色体片段重复染色体片段重复 Dup 19(p13.2-13.1ABABDirect DupNormalNormal左图：染色体断裂点分析左图：染色体断裂点分析 21号染色体长臂断裂点精确定位号染色体长臂断裂点精
9、确定位右图：右图：21q22.2 BAC克隆在克隆在Down综合征间期细胞中的杂交信号综合征间期细胞中的杂交信号BAC 1D9 on 2p21 Detected Amplifications on Thyroid Tumor Cell Line WRO2）简单重复序列探针）简单重复序列探针(simple repetitive probes)异染色质着丝粒探针异染色质着丝粒探针(heterochromatic centromer probes)其靶序列为其靶序列为卫星卫星DNA或卫星或卫星III DNA(alpha satellite/satellite III DNA)多位于染色多位于染色体的
10、着丝粒和异染色质区域，重复数百次至数千次。体的着丝粒和异染色质区域，重复数百次至数千次。特点：信号强特点：信号强应用：应用：(a)标记染色体识别标记染色体识别 (b)染色体数目异常检测染色体数目异常检测 (c)间期细胞遗传学研究和临床诊断间期细胞遗传学研究和临床诊断 *间期细胞遗传学的意义：间期细胞遗传学的意义：细胞分裂期仅占整个细胞周期的几分之一至几十细胞分裂期仅占整个细胞周期的几分之一至几十分之一，经细胞培养和相应处理才能获得染色体。分之一，经细胞培养和相应处理才能获得染色体。人体的大部分细胞并不进行分裂，很难通过培养人体的大部分细胞并不进行分裂，很难通过培养获得中期染色体分裂相，间期获得
11、中期染色体分裂相，间期FISH为这一时期遗为这一时期遗传物质的研究提供了可能，而且快速。传物质的研究提供了可能，而且快速。3）染色体涂染探针）染色体涂染探针(chromosome painting probes)整条染色体探针或染色体区带特异性探针整条染色体探针或染色体区带特异性探针探针来源：探针来源：（1）含有人单条染色体的人）含有人单条染色体的人-啮齿类啮齿类(human-rodent)体细胞杂种组体细胞杂种组织融合的产物；织融合的产物；（2）荧光激活的流式细胞仪）荧光激活的流式细胞仪(fluorescence-activated cell sorter,FACS)分离整条染色体分离整条染
12、色体DNA，并以载体克隆并以载体克隆/PCR扩增；扩增；（3）显微切割得到染色体或染色体片段，）显微切割得到染色体或染色体片段，PCR扩增；扩增；染色体涂染方法：染色体涂染方法：（1）正向）正向(forward)：正常正常probe杂交到待检测的异常标本上；杂交到待检测的异常标本上；（2）逆向）逆向(reverse)：分离异常染色体制备探针，杂交到正常标本分离异常染色体制备探针，杂交到正常标本上。上。应用（应用（1）染色体数目和结构异常分析；）染色体数目和结构异常分析； （2）不同物种间的同源性比较；）不同物种间的同源性比较； （3）白血病及其它肿瘤的染色体诊断和研究。）白血病及其它肿瘤的染色
13、体诊断和研究。*不能用于间期不能用于间期FISHFISH检测（检测（chromosome painting)染色体易位染色体易位4）多色）多色FISH（muti-color FISH) 多色复合染色体多色复合染色体FISH探针探针(multiplex FISH, M-FISH probes)#两种以上不同的非同位素标记，不同的荧光检测系统，通过不同的滤光片组合两种以上不同的非同位素标记，不同的荧光检测系统，通过不同的滤光片组合或极少数几种非同位素标记探针后，按照不同的比例混合，可以显示多种颜色。或极少数几种非同位素标记探针后，按照不同的比例混合，可以显示多种颜色。 #采取结合或比率标记的方法进
14、行标记探针。采取结合或比率标记的方法进行标记探针。在一套特殊的滤光片和计算机软件系统辅助下，可制作在一套特殊的滤光片和计算机软件系统辅助下，可制作24条染色体的彩色核型。条染色体的彩色核型。应用：应用：(a)染色体数目和结构异常及断裂点分析染色体数目和结构异常及断裂点分析多色多色FISH或或M-FISH (b)标记染色体识别标记染色体识别多色多色FISH或或M-FISH (c)不同种属间基因组同源性比较不同种属间基因组同源性比较多色多色FISH (d)多个多个DNA片段同时定位片段同时定位多色多色FISH*M-FISH不能检测染色体内的倒位、小片段缺失与重复。不能检测染色体内的倒位、小片段缺失
15、与重复。多色多色FISHM-FISH技术技术5）彩色显带）彩色显带FISH（Rx-FISH）探针探针根据灵长类动物与人类基因组的同源性制作探针，使人根据灵长类动物与人类基因组的同源性制作探针，使人类的类的24条染色体显示出彩色带型。条染色体显示出彩色带型。*比较基因组杂交比较基因组杂交(comparative in situ hybridization)探针位整个基因组探针位整个基因组DNA，而不是一个点或一个区域，主要用于而不是一个点或一个区域，主要用于确定未知区域的确定未知区域的DNA扩增或缺失。特别是回避了实体肿瘤染色扩增或缺失。特别是回避了实体肿瘤染色体制备的难题，是其它体制备的难题，
16、是其它FISH方法难以替代的。但操作难度较大。方法难以替代的。但操作难度较大。应用：应用：(a)肿瘤遗传学研究肿瘤遗传学研究发现新的癌基因和抑癌基因；发现新的癌基因和抑癌基因； (b)相关种属间和同一种属内不同个体之间基因组差异；相关种属间和同一种属内不同个体之间基因组差异； (c)染色体不平衡片段识别和染色体重排研究。染色体不平衡片段识别和染色体重排研究。比较基因组杂交比较基因组杂交(comparative genomic hybridization，CGH)*染色质染色质 fiber FISH染色质从细胞中释放出来后，做染色质从细胞中释放出来后，做FISH。信号由中期或间期的点状，信号由中
17、期或间期的点状，形成线状排列。可提高定位的分辨率。形成线状排列。可提高定位的分辨率。应用：应用：(a)估计估计cosmid和和YAC或或BAC克隆重叠群的重叠程度，以及克隆重叠群的重叠程度，以及 gap的有的有无和大小；无和大小； (b)确定确定DNA微小缺失与重复；微小缺失与重复； (c)染色质结构研究。染色质结构研究。*引物原位标记或引物原位标记或DNA合成合成 (PRIMED In Situ labeling / Primed In Situ DNA synthesis, PRINS)特点：特点：(a)背景低；背景低； (b)分析时间短；分析时间短； (c)信号强。信号强。*DNA fiber FISH杂交靶不是细胞或染色体等组织，而是杂交靶不是细胞或染色体等组织，而是DNA克隆。克隆。
