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1、第三章第三章 细胞培育的基细胞培育的基 本方法本方法教学目的和要求：教学目的和要求：2 2学时学时重点和难点：重点和难点：掌握细胞培育中无菌操作技术及操作过程掌握细胞培育中无菌操作技术及操作过程中需求留意哪些问题；中需求留意哪些问题；预防污染是无菌操作的关键。预防污染是无菌操作的关键。 组织培育中最重要的，也是最根本的要求组织培育中最重要的，也是最根本的要求就是各项操作均应从无毒害、无污染的培就是各项操作均应从无毒害、无污染的培育环境来思索。培育基、器皿资料、接种育环境来思索。培育基、器皿资料、接种工具、操作环境、培育室和超净任务台等工具、操作环境、培育室和超净任务台等各个环节都应留意。各个环
2、节都应留意。第一节第一节 无菌操作技术无菌操作技术一、实验器具等的洗涤和资料的预备一、实验器具等的洗涤和资料的预备 培育玻璃器具的洗涤是非常重要培育玻璃器具的洗涤是非常重要的。用完后应洗净，再用蒸馏水冲一的。用完后应洗净，再用蒸馏水冲一遍，烘干；遍，烘干； 用适宜的方法灭菌。用适宜的方法灭菌。二、培育室和超净台的消毒二、培育室和超净台的消毒一、无菌范畴一、无菌范畴灭菌任务是极其重要的。对于初学者来灭菌任务是极其重要的。对于初学者来说，首先应建立有菌和无菌的概念。说，首先应建立有菌和无菌的概念。有菌的范畴：凡是暴露在空气中的物体，有菌的范畴：凡是暴露在空气中的物体，至少其外表都是有菌的。如植物外
3、表、至少其外表都是有菌的。如植物外表、超净任务台的台面，未处置的工具、手超净任务台的台面，未处置的工具、手等。等。无菌的范畴：无菌的范畴：物理或化学处置的物体工具、器皿、物理或化学处置的物体工具、器皿、培育基等培育基等 ；安康的动植物不与外部外表接触的组织安康的动植物不与外部外表接触的组织内部能够是无菌的有时也有内生菌，内部能够是无菌的有时也有内生菌，但不会影响培育，也不会污染。但不会影响培育，也不会污染。二无菌操作室，任务前后室内清扫、拖地，以防菌在空气中流动，特别真菌孢子。运用前，室内及超净任务台紫外灯杀菌30分钟，超净任务台酒精75%杀菌，任务中不断吹风。三、洗手和着装三、洗手和着装任务
4、服、帽子、口罩；任务服、帽子、口罩；洗手洗手四、无菌操作四、无菌操作1 1、点燃酒精灯，一切操作均在、点燃酒精灯，一切操作均在火焰近处并经过烧灼进展；火焰近处并经过烧灼进展；2 2、冷却后才干运用；、冷却后才干运用；3 3、操作时，翻开试管盖，要进、操作时，翻开试管盖，要进展烧灼灭菌，但是时间要短。在展烧灼灭菌，但是时间要短。在火焰上烧瓶口。保证容器倾斜。火焰上烧瓶口。保证容器倾斜。4、进展操作时动作要准确矫捷，但是不宜、进展操作时动作要准确矫捷，但是不宜太快，防止空气流动，添加污染的时机；太快，防止空气流动，添加污染的时机；5、超净任务台上的器具和用品要摆放合理；、超净任务台上的器具和用品要
5、摆放合理；6、操作时器具不能触及瓶口以防止污染；、操作时器具不能触及瓶口以防止污染；7、不要说话、不要说话接种时在近火焰处翻开瓶口，使瓶倾斜，以接种时在近火焰处翻开瓶口，使瓶倾斜，以免空气中微生物落入瓶中免空气中微生物落入瓶中正正 确确 错 误 整个接种操作应在近火焰处进展，且动作要整个接种操作应在近火焰处进展，且动作要迅速迅速正正 确确 错 误 防止操作带来的污染防止操作带来的污染接种过程中尽能够到达悬空要求接种过程中尽能够到达悬空要求正正 确确 错 误 正正 确确 错 误 接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口瓶盖朝上放，接种终了后立刻盖好瓶口瓶盖朝上放，接种终了
6、后立刻盖好瓶口正正 确确 错 误 接种完一瓶用火烧器具以防止交叉污染产生接种完一瓶用火烧器具以防止交叉污染产生种子和分生组织：培育时通常将其贴放在培育基外种子和分生组织：培育时通常将其贴放在培育基外种子和分生组织：培育时通常将其贴放在培育基外种子和分生组织：培育时通常将其贴放在培育基外表，而不是插到培育基内部，以免供氧缺乏表，而不是插到培育基内部，以免供氧缺乏表，而不是插到培育基内部，以免供氧缺乏表，而不是插到培育基内部，以免供氧缺乏正正 确确 错 误 接种茎段：留意形状学下端插入培育基内，而形接种茎段：留意形状学下端插入培育基内，而形接种茎段：留意形状学下端插入培育基内，而形接种茎段：留意形
7、状学下端插入培育基内，而形状学上端露于空气中状学上端露于空气中状学上端露于空气中状学上端露于空气中正正 确确 错 误 污染资料应及时去除，高压灭菌。菌有两污染资料应及时去除，高压灭菌。菌有两种，细菌成粘液状，真菌有菌丝。种，细菌成粘液状，真菌有菌丝。 特别真特别真菌危害极大。菌危害极大。五、运用超净台本卷须知五、运用超净台本卷须知1 1、超净台安装在清洁无尘的房间内，最好、超净台安装在清洁无尘的房间内，最好为隔离的无菌间，以免尘土过多易使滤器为隔离的无菌间，以免尘土过多易使滤器阻塞，降低净化效果，缩短运用寿命；阻塞，降低净化效果，缩短运用寿命；2、长期未运用或新安装的超净台运用前、长期未运用或
8、新安装的超净台运用前必需对任务台和周围环境进展清扫，再必需对任务台和周围环境进展清扫，再采用化学灭菌或紫外线灭菌法进展灭菌采用化学灭菌或紫外线灭菌法进展灭菌处置；处置；3 3、运用前用、运用前用7575酒精擦洗台面，并提早酒精擦洗台面，并提早用紫外线灭菌用紫外线灭菌30min30min。封锁紫外灯后应启。封锁紫外灯后应启动鼓风机运转几分钟后再进展培育操作；动鼓风机运转几分钟后再进展培育操作；4 4、净化任务区不应存放不用要的物品，、净化任务区不应存放不用要的物品，以坚持干净气流型不受干扰；以坚持干净气流型不受干扰；5 5、用后任务台要用、用后任务台要用7575酒精擦洗，以备酒精擦洗，以备后面任
9、务人员运用；后面任务人员运用；6 6、及时改换滤器。、及时改换滤器。 条件：条件： 温度：依培育对象选择适宜的温度。温度：依培育对象选择适宜的温度。 光照：光照时间和光照强度光照：光照时间和光照强度 1 1培育架培育架 放置培育物放置培育物 2 2空调空调 调理温度调理温度 3 3配配电电板板 设设熔熔电电器器和和开开关关，用用以以管管理理室室内的电源内的电源 4 4时控器时控器 自动关灯、开灯自动关灯、开灯 5 5温度自动纪录仪温度自动纪录仪第二节第二节 、培育、培育 实体显微镜解剖镜实体显微镜解剖镜 倒置显微镜倒置显微镜 生物显微镜生物显微镜 照相设备照相设备 对培育资料进展细对培育资料进
10、展细胞学鉴定和研讨胞学鉴定和研讨第三节第三节 培育细胞的察看培育细胞的察看1 1、细胞计数法、细胞计数法cell countingcell counting 用血细胞计数板计数细胞悬液中用血细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数目，以测定细胞增殖和调整细的细胞数目，以测定细胞增殖和调整细胞浓度的一种方法。胞浓度的一种方法。2 2、细胞生长曲线、细胞生长曲线cell growth curvecell growth curve 是察看细胞在一代生存期内的增生是察看细胞在一代生存期内的增生过程的重要目的。过程的重要目的。横坐标为培育时间横坐标为培育时间纵坐标为细胞密度纵坐标为细胞密度留意：只需具备本身稳定
11、生长特性的细胞留意：只需具备本身稳定生长特性的细胞才适宜察看。才适宜察看。3 3、细胞分裂指数、细胞分裂指数 指分裂期细胞在全部细胞中所占的指分裂期细胞在全部细胞中所占的百分率，用以表示细胞的增殖旺盛程度。百分率，用以表示细胞的增殖旺盛程度。普通要计算和察看普通要计算和察看10001000个细胞中的细胞个细胞中的细胞分裂相数。分裂相数。4 4、细胞贴壁率、细胞贴壁率 细胞贴壁率又称接种存活率，用于细胞贴壁率又称接种存活率，用于察看贴壁附着生长细胞，主要反映细胞察看贴壁附着生长细胞，主要反映细胞的生存才干和部分底物资料的相容性。的生存才干和部分底物资料的相容性。5、细胞周期、细胞周期 细胞周期：
12、一个细胞的分裂生长周期时细胞周期：一个细胞的分裂生长周期时 间。间。 倍增时间：指在对数生长期细胞数量添加倍增时间：指在对数生长期细胞数量添加一倍所用的时间，这一时间内普通有些细胞一倍所用的时间，这一时间内普通有些细胞参与分裂有些细胞能够不参与分裂，有些能参与分裂有些细胞能够不参与分裂，有些能够分裂两次或数次，但细胞总数量添加够分裂两次或数次，但细胞总数量添加1倍。倍。第四节第四节 细胞培育中常用的染色方细胞培育中常用的染色方法法活体染色活体染色 体外活体染色就是在体外条件下用某种染体外活体染色就是在体外条件下用某种染色剂即活体染料对活的组织或细胞进展染色，色剂即活体染料对活的组织或细胞进展染
13、色，而不影响活细胞的生命活动的一种方法。利用这而不影响活细胞的生命活动的一种方法。利用这种方法，可以对培育物进展染色察看，染色后的种方法，可以对培育物进展染色察看，染色后的培育物还可以继续进展培育。培育物还可以继续进展培育。1、活体染料的类别 碱性染料碱性染料酸性染料酸性染料中性红，甲基兰中性红，甲基兰刚果红，台盼蓝刚果红，台盼蓝第五节第五节 细胞培育的污染与检测细胞培育的污染与检测污染是组织培育的大敌，防止污染的发生。污染是组织培育的大敌，防止污染的发生。污染普通包括微生物污染细菌、真菌、支原体污染普通包括微生物污染细菌、真菌、支原体和病毒、化学物影响细胞生存的非细胞所需和病毒、化学物影响细
14、胞生存的非细胞所需的化学成分、细胞非同种的其他细胞。的化学成分、细胞非同种的其他细胞。1、污染途径、污染途径A. 空气空气 措施：减少空气流动措施：减少空气流动B. 器材器材 措施：消毒彻底，洗刷干净，定期消措施：消毒彻底，洗刷干净，定期消毒毒C. 操作操作 措施：严厉进展无菌操作，防止交措施：严厉进展无菌操作，防止交叉叉 感染感染D. 组织样本组织样本 很难防止很难防止2 2、污染对培育细胞的影响及检测、污染对培育细胞的影响及检测影响：细胞生长缓慢、分裂相减少、细胞影响：细胞生长缓慢、分裂相减少、细胞变得粗糙、细胞轮廓加强、重者细胞停顿变得粗糙、细胞轮廓加强、重者细胞停顿增殖、分裂相消逝、细
15、胞质中出现大量堆增殖、分裂相消逝、细胞质中出现大量堆积物、细胞变圆或解体从瓶壁零落。积物、细胞变圆或解体从瓶壁零落。A. 细菌的污染及检测细菌的污染及检测 取悬液培育，培育液颜色变黄，混取悬液培育，培育液颜色变黄，混浊。浊。B. 真菌的污染及检测真菌的污染及检测 可见菌丝，显微镜下可察看到链状可见菌丝，显微镜下可察看到链状陈列的菌珠，散在细胞周围和细胞之间陈列的菌珠，散在细胞周围和细胞之间生长。生长。C. 支原体污染支原体污染 常见而棘手，与细胞共存。借助显常见而棘手，与细胞共存。借助显微镜、电镜、微镜、电镜、DNA荧光处置法等察看。荧光处置法等察看。D. 病毒的污染及检测病毒的污染及检测 E
16、. 细胞交叉污染及检测细胞交叉污染及检测 操作不当、共同培育导致不同种类之间发操作不当、共同培育导致不同种类之间发生混乱，细胞生长特征、形状发生变化。生混乱，细胞生长特征、形状发生变化。有效防止细胞的交叉污染：有效防止细胞的交叉污染：1在进展多种细胞培育时器具要严厉区分；在进展多种细胞培育时器具要严厉区分；2器具不要触及培育瓶口以免把细胞带到培器具不要触及培育瓶口以免把细胞带到培育瓶中；育瓶中；3保管细胞，污染后可以复苏。保管细胞，污染后可以复苏。3.污染的预防污染的预防防止污染，预防是关键。防止污染，预防是关键。1、培育操作前的预备、培育操作前的预备 超净台坚持清洁；超净台坚持清洁； 运用消毒后的器皿。运用消毒后的器皿。 2、培育操作时的本卷须知、培育操作时的本卷须知 见无菌操作的本卷须知。见无菌操作的本卷须知。4、污染的排除、污染的排除1、运用抗生素；、运用抗生素；2、加温处置；、加温处置；3、动物体内接种除菌法；、动物体内接种除菌法；4、巨噬细胞吞噬法、巨噬细胞吞噬法思索题思索题1、细胞培育时如何预防污染？、细胞培育时如何预防污染？2、列举无菌操作的本卷须知。、列举无菌操作的本卷须知。
