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1、实验一实验一 真核细胞染色体真核细胞染色体DNADNA的的 分离、纯化和检测分离、纯化和检测 实实 验验 目目 的的n n通过实验学习从血液中制备染色体DNA的方法。n n学习琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的纯度、DNA的构型、含量以及分子量的大小。n n掌握DNA样品的纯化和定量检测方法。 n n红细胞裂解液裂解红细胞红细胞裂解液裂解红细胞n n细胞裂解液裂解白细胞细胞裂解液裂解白细胞n n用蛋白酶用蛋白酶K K水解蛋白质水解蛋白质n n有机溶剂酚、氯仿抽提有机溶剂酚、氯仿抽提n n在高盐条件下，用乙醇沉淀在高盐条件下，用乙醇沉淀DNADNAn n再用再用70%70%乙醇洗除沉淀中的盐分乙醇洗除
2、沉淀中的盐分n n即可获得染色体即可获得染色体DNADNA基因组提取实验原理基因组提取实验原理DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。前者由分子所带净电荷量的多少而定，后者则主要与分子大小及其构型有关。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动，在用电泳法测定DNA分子大小时，应当尽量减少电荷效应。增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应，使分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度的差异所决定，提高分辨率。同时适当减低电泳时的电压，也可使分子筛效应相对增加而提高分辨率。琼脂糖凝胶电泳实验原理琼脂糖凝胶电泳实验原理n n纯净的，制备的纯净的，制备的DNADNA样
3、品应该为样品应该为1.71.8 1.71.8 n n纯净的，制备的纯净的，制备的RNARNA样品应该大于样品应该大于n n如果制备的如果制备的DNADNA样品，说明样品中含酶和蛋白质过高，应将样品，说明样品中含酶和蛋白质过高，应将样品用酚、氯仿、异戊醇抽提，再用乙醇沉淀样品用酚、氯仿、异戊醇抽提，再用乙醇沉淀DNADNA；n nA260/A2802A260/A2802，说明样品中，说明样品中RNARNA过高，可用过高，可用RNaseRNase消化后，用消化后，用酚、氯仿、异戊醇抽提，再用乙醇沉淀酚、氯仿、异戊醇抽提，再用乙醇沉淀DNADNA；n n如果样品如果样品A260/A280A260/A
4、280为，说明样品中盐的含量过高，样品沉为，说明样品中盐的含量过高，样品沉淀后应用淀后应用70%70%乙醇多洗一遍。乙醇多洗一遍。n n提取的提取的RNARNA样品样品A260/A280A260/A280应大于。应大于。RNARNA样品含有蛋白质会样品含有蛋白质会使使A260/A280A260/A280比值下降。比值下降。DNA浓度测定实验原理浓度测定实验原理实实 验验 材材 料料红细胞裂解液红细胞裂解液红细胞裂解液红细胞裂解液KHCOKHCO3 3 1g (10mM) 1g (10mM)NHNH4 4Cl 8.3g (155mM)Cl 8.3g (155mM)EDTANaEDTANa2 2
5、37mg (0.1mM) 37mg (0.1mM) 裂解缓冲液（裂解缓冲液（裂解缓冲液（裂解缓冲液（lysis bufferlysis buffer）10mM Tris-Cl (pH8.0)10mM Tris-Cl (pH8.0)0.1M EDTA (pH8.0)0.1M EDTA (pH8.0)0.5%(m/v) SDS0.5%(m/v) SDSACDACD抗凝液抗凝液抗凝液抗凝液柠檬酸柠檬酸 柠檬酸钠柠檬酸钠 右旋葡萄糖右旋葡萄糖 加水至加水至100ml,100ml,使用时每使用时每6ml6ml新鲜血液加新鲜血液加1ml ACD1ml ACD液液组织细胞组织细胞组织细胞组织细胞动物血液样品
6、，将动物血液样品，将20ml20ml新鲜血液与抗凝液混匀，新鲜血液与抗凝液混匀，0 0下保存数天或下保存数天或-70-70下长期冻存，备用。下长期冻存，备用。n n酚：氯仿：异戊醇（酚：氯仿：异戊醇（2525：2424：1 1）n n70%70%乙醇乙醇n nTE bufferTE buffern nRNAseRNAsen n琼脂糖琼脂糖n nTAETAE电泳缓冲液电泳缓冲液n n电泳设备电泳设备n n紫外分光光度计紫外分光光度计n n凝胶成像系统凝胶成像系统实实 验验 材材 料料染色体染色体DNA的制备方法的制备方法1. 1. 取取800l800l抗凝血液抗凝血液置于置于5ml5ml离心管中
7、。离心管中。2. 2. 往管中加往管中加3ml3ml红细胞裂解液红细胞裂解液，轻摇数次，置冰上，轻摇数次，置冰上5 5分钟，期间间歇摇动分钟，期间间歇摇动 几次。几次。3. 4000rpm3. 4000rpm，室温离心，室温离心5 5分钟，弃上清。分钟，弃上清。4. 4. 往管中加入往管中加入3ml3ml红细胞裂解液，红细胞裂解液，重悬重悬沉淀，冰上沉淀，冰上5 5分钟，期间摇几次。分钟，期间摇几次。5. 4000rpm5. 4000rpm，离心，离心5 5分钟，弃上清。分钟，弃上清。6. 6. 重复步骤重复步骤4 4、5 5四至五遍，至出现明显白色沉淀。将残余红细胞弃去，留下四至五遍，至出现
8、明显白色沉淀。将残余红细胞弃去，留下 白色沉淀。白色沉淀。7. 7. 用用1PBS1PBS 3ml 3ml洗涤所得沉淀。洗涤所得沉淀。8. 4000rpm8. 4000rpm，离心，离心5 5分钟，弃上清。分钟，弃上清。9. 9. 每管中加入每管中加入500l500l白细胞裂解缓冲液（每小组配制白细胞裂解缓冲液（每小组配制1ml)1ml)，重悬细胞，加入，重悬细胞，加入 20l 20l proteinase Kproteinase K（20mg/ml20mg/ml），混匀后转移至离心管，置），混匀后转移至离心管，置5555水浴水浴 1 1小时。小时。10. 10. 加入加入酚：氯仿酚：氯仿50
9、0l500l，混匀后，混匀后10000rpm10000rpm，离心，离心5 5分钟，取分钟，取上清，至离心管，加入上清，至离心管，加入氯仿氯仿500l500l，混匀后，混匀后10000rpm10000rpm，离，离心心5 5分钟，取上清至分钟，取上清至5ml5ml离心管。离心管。 （两次取上清前用剪刀（两次取上清前用剪刀将枪头尖剪去将枪头尖剪去3mm)3mm)11. 11. 加入加入1ml1ml无水乙醇无水乙醇, ,轻轻混匀可见轻轻混匀可见DNADNA凝集。凝集。12. 12000rpm12. 12000rpm，离心，离心2 2分钟，弃上清。分钟，弃上清。13. 13. 用用1ml 70%1m
10、l 70%乙醇洗涤沉淀，乙醇洗涤沉淀，12000rpm12000rpm，离心，离心2 2分钟，弃上分钟，弃上清。清。14. 14. 开盖室温干燥沉淀开盖室温干燥沉淀5 5分钟。分钟。15. 15. 加入加入30l DDW30l DDW（无菌水）溶解（无菌水）溶解DNA,DNA,取取10l10l电泳。电泳。16. 16. 加入加入3ml DDW3ml DDW至剩余样品中，测至剩余样品中，测OD260OD260和和0D2800D280，计算，计算DNADNA浓度及浓度及ODOD260260/0D/0D280280。染色体染色体DNA的制备方法的制备方法琼脂糖凝胶电泳方琼脂糖凝胶电泳方 法法 1.1
11、.选择合适的电泳仪和水平式电泳槽，调节电泳槽平面至水平，检查稳压选择合适的电泳仪和水平式电泳槽，调节电泳槽平面至水平，检查稳压电源与正负极的线路。电源与正负极的线路。 2. 2. 将电泳板置于制胶器中或用玻璃胶带封好制胶板两端，防止浇板时出现将电泳板置于制胶器中或用玻璃胶带封好制胶板两端，防止浇板时出现渗漏。选择孔径大小适宜的点样梳，垂直架在电泳板负极的一端，使点样渗漏。选择孔径大小适宜的点样梳，垂直架在电泳板负极的一端，使点样梳底部电泳板水平面的距离为。梳底部电泳板水平面的距离为。 3. 3. 制备琼脂糖凝胶：按照被分离制备琼脂糖凝胶：按照被分离DNADNA分子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分
12、子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。称取琼脂糖，溶解在电泳缓冲液中，大电泳槽约分含量。称取琼脂糖，溶解在电泳缓冲液中，大电泳槽约160160毫升，小电毫升，小电泳槽约泳槽约3535毫升凝胶液，置微波炉或水浴锅中加热，至琼脂糖全部溶化。毫升凝胶液，置微波炉或水浴锅中加热，至琼脂糖全部溶化。 4. 4.待凝胶溶液冷至待凝胶溶液冷至5050左右时，在凝胶溶液中加入左右时，在凝胶溶液中加入EBEB（终浓度），摇匀，（终浓度），摇匀，轻轻倒入电泳板上，除去气泡。轻轻倒入电泳板上，除去气泡。5 5待凝胶冷却凝固后（约待凝胶冷却凝固后（约3030分钟），在电泳槽内加入电泳缓冲液，大电泳槽分钟），在电泳槽内
13、加入电泳缓冲液，大电泳槽约需约需1200ml1200ml，小电泳槽约，小电泳槽约180ml180ml。从制胶器取出电泳板，放入电泳槽，然后。从制胶器取出电泳板，放入电泳槽，然后小心取出点样梳，保持点样孔的完好，去除空内气泡。小心取出点样梳，保持点样孔的完好，去除空内气泡。6 6待测的待测的DNADNA样品中，加五分之一体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液样品中，加五分之一体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液（6loading Buffer6loading Buffer）。如果待测样品太小要用电泳缓冲液稀释，再加五分）。如果待测样品太小要用电泳缓冲液稀释，再加五分之一体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液。如点样体积之一
14、体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液。如点样体积10l10l样品与样品与2l2l溴酚蓝指溴酚蓝指示剂点样缓冲液，混匀后小心地进行点样，记录点样顺序和点样量。示剂点样缓冲液，混匀后小心地进行点样，记录点样顺序和点样量。7 7打开电源，打开电源，DNADNA的迁移速度与电压成正比，与琼脂糖含量有关。最高电压的迁移速度与电压成正比，与琼脂糖含量有关。最高电压不超过不超过5V/cm(5V/cm(大电泳槽不超过大电泳槽不超过200V200V，小电泳槽不超过，小电泳槽不超过150V)150V)。8 8电泳时间看实验的具体要求而定，在电泳途中可用紫外灯直接观察，电泳时间看实验的具体要求而定，在电泳途中可用紫外灯直接
15、观察，DNADNA各条条带分开后，可以结束电泳。一般各条条带分开后，可以结束电泳。一般2020分钟分钟22小时，取电泳凝胶块直接小时，取电泳凝胶块直接用凝胶成像系统成像和分析。用凝胶成像系统成像和分析。琼脂糖凝胶电泳方琼脂糖凝胶电泳方 法法DNADNA样品的纯化和定量检测方法样品的纯化和定量检测方法1 1取取DNADNA粗制样品，加入粗制样品，加入RNaseRNase至终浓度至终浓度10g/l10g/l，37 37 反应小时。反应小时。2 2加入酚：氯仿：异戊醇（加入酚：氯仿：异戊醇（2525：4 4：1 1）等体积抽提）等体积抽提1313次，次，12000 12000 rpmrpm，离心，离
16、心5 5分钟分钟, ,取上清。取上清。3 3加入加入1/101/10倍体积倍体积3M NaAc3M NaAc（），（），2 2倍体积无水乙醇混匀，室温下倍体积无水乙醇混匀，室温下3060min3060min。4 415000 rpm15000 rpm，离心，离心1010分钟。分钟。5 5DNADNA沉淀用冰预冷沉淀用冰预冷70 %70 %乙醇洗乙醇洗1 1次，开盖次，开盖37 37 干燥干燥10min10min（使乙（使乙醇挥发）。醇挥发）。6 6加入加入30l TE buffer30l TE buffer，37 37 水浴至沉淀溶解。水浴至沉淀溶解。7 7取取10 l DNA 1 %10 l
17、 DNA 1 %琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统记录和分析琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统记录和分析结果，估计样品结果，估计样品DNADNA分子量。分子量。8 8取取10 l DNA10 l DNA母液稀释至母液稀释至1000ul1000ul，在紫外分光光度计上测，在紫外分光光度计上测A260A260和和A280A280。计算样品。计算样品DNADNA浓度，判断样品浓度和浓度，判断样品浓度和DNADNA纯度。纯度。 DNA制备注意事项制备注意事项1 1. . 如要如要1111步中完整的步中完整的DNA,DNA,在在1212步时，挑出步时，挑出DNADNA沉淀，用沉淀，用70%70% 乙醇洗涤乙醇洗涤1
18、-21-2次。次。2. 2. 步骤步骤2 2、4 4、7 7中要颠倒摇动试管悬浮沉淀，不可用枪头中要颠倒摇动试管悬浮沉淀，不可用枪头 （尤其是没剪去枪头尖端）吹打沉淀。（尤其是没剪去枪头尖端）吹打沉淀。3. 3. 步骤步骤1010中吸上清枪头使用前必须粗吸头（微量移液枪的中吸上清枪头使用前必须粗吸头（微量移液枪的 枪头剪去尖端，并用火烧一下，使之圆钝），避免机械枪头剪去尖端，并用火烧一下，使之圆钝），避免机械 剪切力对剪切力对DNADNA链的损伤。链的损伤。4. 4. 为了获得高分子量的为了获得高分子量的DNADNA，操作中必须防止混匀、抽提及，操作中必须防止混匀、抽提及 沉淀时剧烈机械震荡造
19、成的沉淀时剧烈机械震荡造成的DNADNA的断裂。的断裂。5. 5. 如含有如含有RNA,RNA,可用可用100ng/ml100ng/ml的的RNaseRNase在在3737水解半小时。对水解半小时。对 于新血液，取于新血液，取ACDACD或或EDTAEDTA抗凝，抗凝，10ml10ml全血中加全血中加3.3ml ACD3.3ml ACD 或或1ml EDTA1ml EDTA。电泳注意事项 1. 1. 1. 1. 琼脂糖的质量：琼脂糖的质量：琼脂糖的质量：琼脂糖的质量： 琼脂糖（琼脂糖（agaroseagarose）是以质量较好的琼脂作原料制成的。琼脂）是以质量较好的琼脂作原料制成的。琼脂是由琼
20、脂糖和琼脂胶组成的复合物。琼脂胶是一种含有硫酸是由琼脂糖和琼脂胶组成的复合物。琼脂胶是一种含有硫酸根和羟基的多糖。它具有离子交换性质，这种性质将给电泳根和羟基的多糖。它具有离子交换性质，这种性质将给电泳带来电渗作用的不良影响，因而必须去除干净。所谓琼脂糖带来电渗作用的不良影响，因而必须去除干净。所谓琼脂糖的质量不过关就是琼脂糖内含有较高比例的琼脂胶。琼脂糖的质量不过关就是琼脂糖内含有较高比例的琼脂胶。琼脂糖是一种直链多糖，它由是一种直链多糖，它由D-D-半乳糖和半乳糖和3 3，6-6-脱水脱水-L-L-半乳糖的残半乳糖的残基交替排列组成的线性多聚糖。由于链状琼脂糖分子相互以基交替排列组成的线性
21、多聚糖。由于链状琼脂糖分子相互以氢键交联，因此与琼脂一样能形成凝胶。琼脂糖带有亲水性，氢键交联，因此与琼脂一样能形成凝胶。琼脂糖带有亲水性，不含有带电荷的基因，不引起不含有带电荷的基因，不引起DNADNA变性，又不吸附被分离的物变性，又不吸附被分离的物质，因此它是一种很好的凝胶剂。质，因此它是一种很好的凝胶剂。2. DNA2. DNA2. DNA2. DNA分子的迁移率：分子的迁移率：分子的迁移率：分子的迁移率： 影响影响DNADNA分子在电泳中的迁移率的因素是多方面的，除了分子在电泳中的迁移率的因素是多方面的，除了决定于决定于DNADNA分子大小与构型外，还有琼脂糖的浓度、电压分子大小与构型
22、外，还有琼脂糖的浓度、电压大小、缓冲液大小、缓冲液pHpH值和电泳时的温度等。为了精确测定其值和电泳时的温度等。为了精确测定其分子量的大小，采用一下措施：分子量的大小，采用一下措施：(1) (1) 每次测定时，要有已知分子量的每次测定时，要有已知分子量的DNADNA片段作为标准，片段作为标准， 进行对照。电泳。进行对照。电泳。(2) (2) 选择最合适的电泳条件。选择最合适的电泳条件。(3) (3) 提高分子筛效应，降低电荷效应。提高分子筛效应，降低电荷效应。电泳注意事项3. EB3. EB染色：染色：EBEB是核酸的显色剂，使用是核酸的显色剂，使用EBEB对对DNADNA染色的染色的3 3种
23、方法：种方法：(1) (1) 在制胶中与电泳缓冲液中同时加入在制胶中与电泳缓冲液中同时加入EBEB。(2) (2) 只在胶中加入只在胶中加入EBEB，在电泳缓冲液中不加。这样可减少操作时双手受，在电泳缓冲液中不加。这样可减少操作时双手受EBEB污污染的可能。染的可能。(3) (3) 在电泳结束后，取出凝胶，放在含有在电泳结束后，取出凝胶，放在含有EBEB的电泳缓冲液或的电泳缓冲液或DDWDDW中浸染中浸染10-3010-30分钟。分钟。4 4溴酚蓝指示剂缓冲溶液的作用：含有溴酚蓝指示剂缓冲溶液的作用：含有50%50%蔗糖，可增加上样蔗糖，可增加上样DNADNA溶液的密度，溶液的密度，以确保以确
24、保DNADNA样品沉入点样孔内，起样品沉入点样孔内，起DNADNA电泳时的前沿指示剂作用。一般溴酚电泳时的前沿指示剂作用。一般溴酚蓝的电泳迁移位置相当于蓝的电泳迁移位置相当于300400bp300400bp双链线状双链线状DNADNA。5 5点样量太高易产生拖尾与弥散现象，样品迁移速度减慢。点样量太少，分点样量太高易产生拖尾与弥散现象，样品迁移速度减慢。点样量太少，分辨不清，影响结果。辨不清，影响结果。6 6EBEB为强诱变剂，剧毒，操作时要带一次性手套，并在专区间操作。用过的为强诱变剂，剧毒，操作时要带一次性手套，并在专区间操作。用过的手套要及时将手套顺手翻过来，让有手套要及时将手套顺手翻过
25、来，让有EBEB的面朝里，有的面朝里，有EBEB的废液和器皿不能的废液和器皿不能随便丢弃，要用专门方法处理后丢弃。随便丢弃，要用专门方法处理后丢弃。电泳注意事项DNA定量检测注意事项定量检测注意事项n n测定光吸收值时，用稀释DNA样品的溶液做对照。n n选择稀释要适当，应在检测范围之内。思思 考考 题题1.实验中影响染色体实验中影响染色体DNADNA完整的因素有哪些？如完整的因素有哪些？如何减少这些因素对完整性的影响？何减少这些因素对完整性的影响？2.如何判断提取的染色体如何判断提取的染色体DNADNA样品的质量？样品的质量？3.为了获得清晰的为了获得清晰的DNADNA样品电泳图，在琼脂糖凝样品电泳图，在琼脂糖凝胶电泳过程中应该注意哪些问题？胶电泳过程中应该注意哪些问题？4.如何选择测量如何选择测量DNADNA的合适的稀释倍数？的合适的稀释倍数？5.为什么需要对为什么需要对DNADNA进行纯化？进行纯化？
