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1、分子生物学研究法（上）分子生物学研究法（上）1 1、重组、重组DNADNA技术发展史上的重大事件技术发展史上的重大事件2 2、DNADNA操作技术操作技术3 3、RNARNA的基本操作技术的基本操作技术4 4、SNPSNP的理论与应用的理论与应用5 5、基因克隆技术基因克隆技术6 6、蛋白质组与蛋白质组学与技术、蛋白质组与蛋白质组学与技术整理课件 分子生物学从分子生物学从2020世纪中叶开始高速发展，最主世纪中叶开始高速发展，最主要的要的原因之一是基因操作和基因工程技术的进步原因之一是基因操作和基因工程技术的进步。基因操作：基因操作：DNADNA的切割和连接、核酸分子杂交、凝的切割和连接、核酸
2、分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析、基因的人工合胶电泳、细胞转化、核酸序列分析、基因的人工合成、定点突变和成、定点突变和PCRPCR扩增。这是分子生物学研究的扩增。这是分子生物学研究的核心技术。核心技术。 基因工程：基因工程：在体外将核酸分子插入载体分子中，使在体外将核酸分子插入载体分子中，使之进入寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。之进入寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。整理课件跨越天然物种屏障、把来自任何生物的跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力，之中的能力，是基因工程技术区别于其他技是基因工
3、程技术区别于其他技术的根本特征。本章将在回顾重组术的根本特征。本章将在回顾重组DNADNA技术史技术史上主要事件的基础上，讨论上主要事件的基础上，讨论DNADNA与与RNARNA操作技操作技术、基因克隆技术以及蛋白质组学等几个分术、基因克隆技术以及蛋白质组学等几个分子生物学研究方法的关键环节。子生物学研究方法的关键环节。整理课件重组重组DNADNA技术史上的重大事件技术史上的重大事件 半个世纪以来，分子生物学研究取得了前所半个世纪以来，分子生物学研究取得了前所未有的进步，主要有未有的进步，主要有3 3大成就大成就: : 第一，解决了第一，解决了遗传的物质基础问题遗传的物质基础问题- -基因的分
4、子基因的分子 载体是载体是DNA; DNA; 第二，第二，DNADNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制，解决了机制，解决了基因的自我复制和世代交替问题基因的自我复制和世代交替问题; ; 第三，第三，“中心法则中心法则”和操纵子学说，成功地破译和操纵子学说，成功地破译了遗传密码，阐明了了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。遗传信息的流动与表达机制。整理课件 DNA DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组技术的进步直接推动了重组DNADNA技术的产生和发展。技术的产生和发展。 重组重组DN
5、ADNA的核心是用限制性核酸内切酶和的核心是用限制性核酸内切酶和DNADNA连连接酶对接酶对DNADNA分子进行体外切割和连接。分子进行体外切割和连接。这些酶的发现这些酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件。限和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件。限制性核酸内切酶能从特定碱基序列位点切开制性核酸内切酶能从特定碱基序列位点切开DNADNA。 19721972，BoyerBoyer实验室发现核酸内切酶实验室发现核酸内切酶EcoRIEcoRI能特能特异识别异识别GAATTCGAATTC序列，将序列，将DNADNA在这个位点切开产生具有在这个位点切开产生具有粘性末端的小片段。粘性末端的小
6、片段。整理课件他们还发现，他们还发现，EcoRl酶切产生的任何不同来酶切产生的任何不同来源的源的DNADNA片段能通过粘性末端之间碱基互补作片段能通过粘性末端之间碱基互补作用而彼此用而彼此“粘合粘合”起来。起来。此后，大量类似于此后，大量类似于EcoRl 但具有独特识别序但具有独特识别序列的核酸内切酶被陆续发现。到目前为止，列的核酸内切酶被陆续发现。到目前为止，科学家已经几乎能随心所欲地把任何科学家已经几乎能随心所欲地把任何DNADNA分子分子切割成一系列不连续的片段，再利用凝胶电切割成一系列不连续的片段，再利用凝胶电冰技术将这些片段按照分子量大小逐一分开，冰技术将这些片段按照分子量大小逐一分
7、开，以供下一步研究。以供下一步研究。整理课件整理课件整理课件DNA操作技术操作技术核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳 1. 1.基本原理基本原理 生物大分子在一定生物大分子在一定pHpH条件下，通常会带电荷。条件下，通常会带电荷。将其放置到电场中，就会以一定的速度移向适当的将其放置到电场中，就会以一定的速度移向适当的电极。分子在电场作用下的电极。分子在电场作用下的迁移速度，与电场强度迁移速度，与电场强度和电泳分子所携带的净电荷数成正比，与分子的摩和电泳分子所携带的净电荷数成正比，与分子的摩擦系数成反比。擦系数成反比。摩擦系数是分子大小、极性及介质摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度的函数。根据粘度的函
8、数。根据分子大小、构型或形状的差异和分子大小、构型或形状的差异和带净电荷数，可通过电泳将蛋白质或核酸分子混合带净电荷数，可通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离物中的各种成分彼此分离。整理课件在生理条件下，核酸分子之糖在生理条件下，核酸分子之糖- -磷酸骨架中磷酸骨架中的磷酸基团，呈离子化状态，的磷酸基团，呈离子化状态，DNADNA和和RNARNA多核苷酸多核苷酸链称为链称为多聚阴离子多聚阴离子，把它们放置在电场当中，把它们放置在电场当中，会会向正电极向正电极的方向迁移。由于糖的方向迁移。由于糖- -磷酸骨架在结构磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链上的重复性质，相同数量的
9、双链DNADNA几乎具有等几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，方向迁移。在一定的电场强度下，DNADNA分子的迁分子的迁移速度，取决于核酸分子本身的移速度，取决于核酸分子本身的大小和构型大小和构型。这。这就是应用凝胶电泳技术分离就是应用凝胶电泳技术分离DNADNA片段的基本原理。片段的基本原理。整理课件2.2.琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖是一种线性多糖聚合物。将琼脂琼脂糖是一种线性多糖聚合物。将琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固便会形成良好糖粉末加热到熔点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质。的电泳介质。 经
10、过化学修饰的经过化学修饰的低熔点琼脂糖低熔点琼脂糖，在较低，在较低的温度下便会熔化，常用于的温度下便会熔化，常用于DNADNA片段的制备片段的制备电泳。电泳。整理课件整理课件琼脂糖凝胶分辨琼脂糖凝胶分辨DNADNA片段的范围为片段的范围为50kb之之间间; ;聚丙烯酰胺凝胶分辨范围为聚丙烯酰胺凝胶分辨范围为11000bp 之间。之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小, ,浓度浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。例如，越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。例如，20%20%的聚丙烯酰胺凝胶可分离的聚丙烯酰胺凝胶可分离1-6bp1-6bp的的DNADNA小片段
11、，小片段，而若要分离而若要分离1000bp1000bp的的DNADNA片段，就要用片段，就要用3%3%的聚丙的聚丙烯酰胺凝胶。再如，烯酰胺凝胶。再如，2%2%的琼脂糖凝胶可分离的琼脂糖凝胶可分离300bp300bp的双链的双链DNADNA分子，而分离大片段分子，而分离大片段DNADNA就要用就要用低浓度低浓度(0.3%(0.3%1.0%)1.0%)的琼脂糖凝胶。的琼脂糖凝胶。整理课件 在在凝凝胶胶电电泳泳中中，加加入入适适量量溴溴化化乙乙锭锭( (e et th hi id di iu um m b br ro om m i i d de e，简简称称E EB B) )染染料料对对核核酸酸分分
12、子子进进行行染染色色，然然后后将将电电泳泳标标本本放放置置在在紫紫外外光光下下观观察察，检检测测灵灵敏敏快快捷捷，D DN NA A 带带中中含含的的微微量量D DN NA A ，可可以以清清晰晰地地检检测测出出来来。E EB B能能插插入入到到D DN NA A 或或R RN NA A 分分子子的的相相邻邻碱碱基基之之间间，并并在在3 30 00 0n nm m波波长长的的紫紫外外光光照照射射下下发发出出荧荧光光。把把E EB B直直接接加加到到凝凝胶胶介介质质中中，染染料料便便会会与与D DN NA A 分分子子结结合合，却却不不能能与与凝凝胶胶相相结结合合。这这样样就就只只有有D DN
13、NA A 分分子子能能吸吸收收E EB B并并发发出出荧荧光光。在在适适当当的的染染色色条条件件下下，荧荧光光强强度度与与D DN NA A 片片段段的的数数量量成成正正比比。整理课件整理课件整理课件整理课件载载体体一载体的概念：一载体的概念： 1.1.要要把把一一个个有有用用的的基基因因（目目的的基基因因- -研研究究或或应应用用基基因因）通通过过基基因因工工程程手手段段送送到到生生物物细细胞胞（受受体体细细胞胞），需需要要运运载载工工具具（交交通通工工具具）携携带带外外源源基基因因进进入入受受体细胞，这种运载工具就叫做载体（体细胞，这种运载工具就叫做载体（vectorvector）。）。
14、2.2.凡凡来来源源于于质质粒粒或或噬噬菌菌体体的的DNADNA分分子子，可可以以插插入入或克隆或克隆DNADNA片段统称为片段统称为vectorvector。 3.3.基基因因工工程程所所用用的的vectorvector实实际际上上是是DNADNA分分子子，是是用来携带目的基因片段进入受体细胞的用来携带目的基因片段进入受体细胞的DNADNA整理课件 二、载体的分类二、载体的分类分类依据分类依据类类别别克隆扩增或表达克隆扩增或表达举举例例1.按功能分成按功能分成（1）克隆载体）克隆载体（2）表达载体）表达载体PBR322PCDN32.按进入受体细胞类按进入受体细胞类型分型分（1）原核载体）原核
15、载体（2）真核载体）真核载体（3）穿梭载体）穿梭载体PUC8PBUDCE41YE3.按克隆片段得大小按克隆片段得大小（克隆能力）分（克隆能力）分(1)1kb(2)10kb(3)22kb(4)2hr; 95 40min; 97 5minDNA聚合酶聚合酶整理课件A 变性变性 95 ，DNA模板变性成为单链，引物自身和引物间局部双模板变性成为单链，引物自身和引物间局部双链消除链消除B 退火，退火，Tm值减值减-25，使引物与模板，使引物与模板DNA结合互补成双链结合互补成双链C 延伸，延伸， DNA聚合酶在聚合酶在 72 催化催化DNA的合成的合成 PCR 的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性95
16、 延伸延伸72 退火退火Tm-5PCR仪25-30个循环个循环整理课件PCR的基本原理和操作程序的基本原理和操作程序整理课件RT-PCR（逆转录（逆转录-PCR） 以以mRNA为模板，先进行逆转录得到为模板，先进行逆转录得到cDNA（complementary DNA，cDNA），再进），再进行的行的PCR反应反应模板为模板为mRNA需逆转录酶需逆转录酶产物为产物为cDNART-PCR与与PCR区别区别整理课件RT-PCR的基本原理和操作程序的基本原理和操作程序整理课件基因的体外突变基因的体外突变DNA和和RNA的微量分析的微量分析DNA序列测定序列测定基因突变分析基因突变分析PCR的其他用途
17、的其他用途整理课件 实时定量荧光实时定量荧光PCRPCR技术于技术于19961996年由美国年由美国Applied Applied Biosystems Biosystems 公司推出，由于该技术不仅实现了公司推出，由于该技术不仅实现了PCRPCR从定性到从定性到定量的飞跃，而且定量的飞跃，而且与常规与常规PCRPCR相比，它具有相比，它具有特异性更强、有特异性更强、有效解决效解决PCRPCR污染问题、自动化程度高等特点。实时定量污染问题、自动化程度高等特点。实时定量PCR PCR 是指在是指在PCRPCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即
18、时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需要取出量，不需要取出PCRPCR产物进行分离。目前实时定量产物进行分离。目前实时定量PCRPCR作为作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。究的各个领域。实时定量实时定量PCRPCR（real time RT-PCRreal time RT-PCR）整理课件实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 技术的主要应用：技术的主要应用： 1. DNA 1. DNA 或或RNA RNA 的绝对定量分析：包括病原微生物或病毒含
19、的绝对定量分析：包括病原微生物或病毒含 量的检测量的检测, ,转基因动植物转基因拷贝数的检测，转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi RNAi 基因失基因失活率的检测等。活率的检测等。 2. 2. 基因表达差异分析：例如比较经过不同处理样本之间特定基因表达差异分析：例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异基因的表达差异( (如药物处理、物理处理、化学处理等如药物处理、物理处理、化学处理等 ) )，特，特定基因在不同时相的表达差异以及定基因在不同时相的表达差异以及cDNA cDNA 芯片或差显结果的确芯片或差显结果的确证。证。 3. 3. 基因分型：例如基因分型：例如SNP SNP 检测
20、，甲基化检测等检测，甲基化检测等 整理课件原理：原理： 根据荧光染料形成特异性荧光信号的强度，根据荧光染料形成特异性荧光信号的强度， 计算出模板计算出模板DNA或或mRNA的含量的含量 用途：用途：定量分析定量分析mRNA或或DNA优点：优点： 可进行自动化定量分析、降低假阳性可进行自动化定量分析、降低假阳性整理课件Real time PCR 常用的两种方法分别为常用的两种方法分别为：Sybrgreen（荧光染料掺入法）（荧光染料掺入法）和和Taqmanprobe（探针法）（探针法）SYBR green 在在PCRPCR反应体系中，加入过量反应体系中，加入过量SYBRSYBR荧光染料，荧光染料
21、，SYBRSYBR荧光染料特异荧光染料特异性地掺入性地掺入DNADNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBRSYBR染料分子染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCRPCR产物的增加产物的增加完全同步。完全同步。此方法适用：此方法适用：1 1、灵敏度高：使用、灵敏度高：使用SYBRSYBR可使荧光效果增强到可使荧光效果增强到10001000倍以上倍以上 2 2、通用性好、通用性好, ,不需要设计探针不需要设计探针, ,方法简便方法简便, ,省时省时, ,价格低廉。价格低廉。 3 3、通用型
22、方法，在国内外科研中普遍使用。、通用型方法，在国内外科研中普遍使用。 4 4、高通量大规模的定量、高通量大规模的定量PCRPCR检测检测 5 5、专一性要求不高的定量、专一性要求不高的定量PCRPCR检测。检测。 整理课件Taqman Probe PCRPCR扩增时在加入一对引物的同时扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧加入一个特异性的荧光探针光探针，该探针为一寡核苷酸，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；的荧光信号被淬灭基团吸收；P
23、CRPCR扩增时，扩增时，TaqTaq酶的酶的5 5- -3 3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条每扩增一条DNADNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与信号的累积与PCRPCR产物形成完全同步。产物形成完全同步。整理课件实时实时PCR的基本原理的基本原理整理课件实时定量实时定量PCR的基本过程的基本过程整理课件此方法适用：此方法适用：1 1、具有高适应性和可靠性，实验结果稳定重
24、复性好，特异、具有高适应性和可靠性，实验结果稳定重复性好，特异性更高。性更高。 2 2、适用于扩增序列专一的体系的检测。、适用于扩增序列专一的体系的检测。 3 3、样品中靶基因含量过低的定量、样品中靶基因含量过低的定量PCRPCR检测。检测。 4 4、靶基因的特异序列较短，无论怎样优化引物设计条件、靶基因的特异序列较短，无论怎样优化引物设计条件 都都不能解决。不能解决。 5 5、存在与靶基因同源的序列，在、存在与靶基因同源的序列，在PCRPCR中容易出现非特异性扩中容易出现非特异性扩增，对特异性要求较高的定量。增，对特异性要求较高的定量。 6 6、广泛用于人类传染病的诊断和病原定量、广泛用于人
25、类传染病的诊断和病原定量, ,在动物病原体基在动物病原体基 因的检测因的检测, ,畜禽产品的检验检疫畜禽产品的检验检疫, ,生物制品的鉴定。生物制品的鉴定。 整理课件实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR中的几个术语中的几个术语1. Ct 1. Ct 值：是指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时值：是指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。（如图所示）所经历的循环数。（如图所示）整理课件整理课件荧光域值（荧光域值（thresholdthreshold）：）：是指是指 PCR PCR 反应的前反应的前 15 15 个循环个循环的荧光信号，荧光域值的缺省设置是的荧光信号，荧光域值的
26、缺省设置是 3-15 3-15 个循环的荧光信个循环的荧光信号的标准偏差的号的标准偏差的 10 10 倍，即：倍，即：thresholdthreshold。Ct Ct 值与起始模板的关系：值与起始模板的关系：研究表明，每个模板的研究表明，每个模板的 Ct Ct 值值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，多， Ct Ct 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，只要获得未知样品的曲线，只要获得未知样品的 Ct Ct 值，即可从标准曲线上计算值，即可从标准曲线上计算出该样品的
27、起始拷贝数。出该样品的起始拷贝数。整理课件基因组基因组DNADNA文库构建文库构建 从生物组织细胞提取出全部从生物组织细胞提取出全部DNADNA，用物理方法（超声波、搅，用物理方法（超声波、搅拌剪力等）或酶法（限制性核酸内切酶的不完全酶解）将拌剪力等）或酶法（限制性核酸内切酶的不完全酶解）将DNADNA降降解成预期大小的片段，然后将这些片段与适当的载体（常用噬解成预期大小的片段，然后将这些片段与适当的载体（常用噬菌体、粘粒或菌体、粘粒或YACYAC载体）连接，转入受体细菌或细胞，这样每一载体）连接，转入受体细菌或细胞，这样每一个细胞接受了含有一个个细胞接受了含有一个基因组基因组DNADNA片段
28、与载体连接的重组片段与载体连接的重组DNADNA分分子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一个含有子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一个含有基因组基因组各各DNADNA片段克隆的集合体，就称为片段克隆的集合体，就称为基因组基因组DNADNA文库（文库（genomic DNA genomic DNA librarylibrary）。）。如果这个文库足够大，能包含该生物如果这个文库足够大，能包含该生物基因组基因组DNADNA全全部的序列，就是该生物完整的部的序列，就是该生物完整的基因组基因组文库，文库，能从这文库中钓取能从这文库中钓取该生物的全部基因或该生物的全部基因或DNADNA序列。从序列
29、。从基因组基因组含有生物生存、活动和含有生物生存、活动和繁殖的全部遗传信息的概念出发，繁殖的全部遗传信息的概念出发，基因组基因组文库是具有生物种属文库是具有生物种属特异性的。特异性的。 整理课件文库构建文库构建提取染色体提取染色体DNADNA片段片段插入适当的克隆载体插入适当的克隆载体转入受体菌扩增转入受体菌扩增基因组文库基因组文库基因组文库的构建基因组文库的构建机械法或限制机械法或限制性内切酶切割性内切酶切割整理课件整理课件整理课件整理课件基因文库构建示意图基因文库构建示意图整理课件RNARNA的基本操作技术的基本操作技术总总RNARNA的提取的提取RNARNA提取注意事项：提取注意事项：R
30、NARNA电泳：电泳： 28S;18S;5S28S;18S;5SRNARNA纯度和浓度的测定纯度和浓度的测定 整理课件mRNAmRNA分离分离最普遍的最普遍的mRNAmRNA分离依赖于与真核生物分离依赖于与真核生物mRNA3mRNA3端端poly(A)poly(A)互补的含互补的含有有20-3020-30胸腺嘧啶的胸腺嘧啶的oligodToligodT序列。通常将序列。通常将oligodToligodT链通过链通过5 5的磷酸键与纤维素基质连接，使用者可以通过其来分离纯化的磷酸键与纤维素基质连接，使用者可以通过其来分离纯化mRNAmRNA。AmbionAmbion公司提供了几种公司提供了几种P
31、oly(A)PuristPoly(A)Purist mRNA Purification Kit mRNA Purification Kit试剂盒，这试剂盒，这些试剂盒都是基于些试剂盒都是基于oligodT-oligodT-纤维素原理。纤维素原理。GEGE（Amersham BiosciencesAmersham Biosciences）公司也提供了几种利用）公司也提供了几种利用oligodT-oligodT-纤维素柱子纤维素柱子的的mRNAmRNA纯化试剂盒。纯化试剂盒。BDBD生物科学公司和生物科学公司和CLONTECHCLONTECH公司同样也提供了公司同样也提供了oligodT- cel
32、luloseoligodT- cellulose试剂盒。试剂盒。CLONTECHCLONTECH公司公司QIAGENQIAGEN公司现利用了乳胶磁珠代替了纤维素与公司现利用了乳胶磁珠代替了纤维素与oligodToligodT共价连共价连接。乳胶磁珠完美的球形表面能实现均一分布和最小的离心时间，产生纯化接。乳胶磁珠完美的球形表面能实现均一分布和最小的离心时间，产生纯化的的mRNAmRNA。整理课件cDNAcDNA的合成的合成cDNA第一链的合成 1.寡聚寡聚dTdT法：法：poly A tailpoly A tail 2. 2.随机引物法：随机引物法：整理课件cDNAcDNA第二链的合成方法有以
33、下第二链的合成方法有以下2 2种种: : 1 1、自身引导法、自身引导法: :合成的单链合成的单链cDNA 3cDNA 3端能够形成一短的发夹结构，端能够形成一短的发夹结构，这就为第二链的合成提供了现成的引物，当第一链合成反应产物这就为第二链的合成提供了现成的引物，当第一链合成反应产物的的DNA:RNADNA:RNA杂交链变性后利用大肠杆菌杂交链变性后利用大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 Klenow Klenow片段片段或反转录酶合成或反转录酶合成cDNAcDNA第二链，最后用对单链特异性的第二链，最后用对单链特异性的S1S1核酸酶消核酸酶消化该环，即可进一步克隆。目前很少使用。化该环，即可
34、进一步克隆。目前很少使用。2 2、置换合成法、置换合成法 该方法利用第一链在反转录酶作用下产生的该方法利用第一链在反转录酶作用下产生的cDNA:mRNAcDNA:mRNA杂交链不用碱变性，而是在杂交链不用碱变性，而是在dNTPdNTP存在下，利用存在下，利用RNARNA酶酶H H在杂交链的在杂交链的mRNAmRNA链上造成切口和缺口。从而产生一系列链上造成切口和缺口。从而产生一系列RNARNA引物，引物，使之成为合成第二链的引物，在大肠杆菌使之成为合成第二链的引物，在大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶的作用下的作用下合成第二链。该反应有合成第二链。该反应有3 3个主要优点个主要优点: (1) :
35、 (1) 非常有效；非常有效； (2) (2) 直接直接利用第一链反应产物，无须进一步处理和纯化；利用第一链反应产物，无须进一步处理和纯化； (3) (3) 不必使用不必使用S1S1核酸酶来切割双链核酸酶来切割双链cDNAcDNA中的单链发夹环。中的单链发夹环。整理课件细胞总细胞总mRNA 反转录酶反转录酶 cDNA 插入合适载体插入合适载体转入受体菌转入受体菌 cDNA文库文库cDNA文库的构建文库的构建整理课件 在组织和培养的细胞中，一个细胞中在组织和培养的细胞中，一个细胞中有些有些mRNAmRNA可拥有数千个拷贝，而有些可拥有数千个拷贝，而有些mRNAmRNA只有几个拷贝。根据只有几个拷
36、贝。根据mRNAmRNA分子含量的多寡，分子含量的多寡，可以将可以将mRNAmRNA划分为高丰度、中丰度和低丰划分为高丰度、中丰度和低丰度度3 3种不同的类型。种不同的类型。 整理课件整理课件 从表中看出低丰度从表中看出低丰度mRNAmRNA，其总量约，其总量约占总占总mRNAmRNA的的30%30%，约有，约有1100011000个左右的不个左右的不同种类的同种类的mRNAmRNA。如果获得。如果获得1100011000个克隆，个克隆，得到每一种低丰度得到每一种低丰度mRNAmRNA的可能只有的可能只有3030，因此，为了获得一个能够代表全部低丰因此，为了获得一个能够代表全部低丰度度mRNA
37、mRNA序列的序列的cDNAcDNA基因文库，必须的最基因文库，必须的最低克隆数低克隆数( (理论值理论值) )应是应是11000/011000/030370003037000。整理课件由于在实验中存在着取样差异，有些由于在实验中存在着取样差异，有些序列容易被克隆，有些序列不容易被克隆，序列容易被克隆，有些序列不容易被克隆，为了保证为了保证cDNAcDNA文库中能够包含所有的序列，文库中能够包含所有的序列，必须增加克隆的数目。为了使低丰度必须增加克隆的数目。为了使低丰度mRNAmRNA的的cDNAcDNA克隆达到克隆达到99%99%的期望率，需要筛选的期望率，需要筛选170000170000个
38、克隆个克隆。整理课件克隆基因的分离克隆基因的分离 1. 1.应用核酸探针分离克隆目的基因应用核酸探针分离克隆目的基因: : 把把cDNAcDNA文库转移到尼龙膜或硝酸纤维素文库转移到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上，就可以与特异性的核酸探针进滤膜上，就可以与特异性的核酸探针进行菌落杂交，以便筛选出具有目的基因行菌落杂交，以便筛选出具有目的基因的阳性克隆，这个过程叫作克隆基因的的阳性克隆，这个过程叫作克隆基因的分离或筛选。分离或筛选。整理课件应用核酸探针分离目的基因的方法应用核酸探针分离目的基因的方法叫作核酸杂交筛选法。适用于大规模筛叫作核酸杂交筛选法。适用于大规模筛选。只要有合适的现成可用的核酸探针，选。只要有合适的现成可用的核酸探针，就有可能从生物体的任何组织中分离到就有可能从生物体的任何组织中分离到目的基因，也就能够有效地检测任何一目的基因，也就能够有效地检测任何一种插入的外源种插入的外源DNADNA序列。序列。整理课件整理课件分离克隆基因的办法很多，根据不同的分离克隆基因的办法很多，根据不同的需要再去学习具体的方法，这里就不作一一需要再去学习具体的方法，这里就不作一一介绍了。介绍了。p177p177整理课件
