核酸的分离纯化课件

《核酸的分离纯化课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《核酸的分离纯化课件（76页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、第五章第五章 核酸的分离纯化核酸的分离纯化温州医学院温州医学院 彭彭 颖颖核酸的分离纯化DNADNA和和RNARNA是是生生物物体体中中最最重重要要的的核核酸酸分分子子，是是分子生物学和分子诊断的研究对象分子生物学和分子诊断的研究对象DNADNA和和RNARNA的的分分离离纯纯化化是是分分子子生生物物学学研研究究及及分分子诊断最基础的工作子诊断最基础的工作第五章第五章 核酸的分离纯化核酸的分离纯化核酸的分离纯化核酸分离纯化的核酸分离纯化的原则原则: :保持核酸一级结构的完整性保持核酸一级结构的完整性尽可能提高核酸制品的纯度尽可能提高核酸制品的纯度第五章第五章 核酸的分离纯化核酸的分离纯化核酸的

2、分离纯化第一节第一节 核酸分离纯化的设计及原则核酸分离纯化的设计及原则第二节第二节 基因组基因组DNADNA的分离纯化的分离纯化第三节第三节 质粒质粒DNADNA的提取与纯化的提取与纯化第四节第四节 RNA RNA的分离纯化的分离纯化第五章第五章 核酸的分离纯化核酸的分离纯化核酸的分离纯化第一节第一节 核酸分离纯化的设计及原则核酸分离纯化的设计及原则核酸的分离纯化一、材料与方法的选择一、材料与方法的选择二、技术路线的设计二、技术路线的设计三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存第一节第一节 核酸分离纯化的设计及原则核酸分离纯化的设计及原则核酸的分离纯化一、材料与方法的选择一、材料与方法的选择（

3、一）（一） 材料与方法的选择材料与方法的选择（二）（二） 选择原则选择原则 核酸的分离纯化（一）（一） 材料与方法的选择材料与方法的选择 不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及浓度有不同的要求。产量及浓度有不同的要求。需考虑制备核酸所需的时间与成本需考虑制备核酸所需的时间与成本应选择安全的试剂与制备方案应选择安全的试剂与制备方案 一、材料与方法的选择一、材料与方法的选择核酸的分离纯化 1.1.保持核酸碱基序列的完整性保持核酸碱基序列的完整性 2. 2.尽量清除其它分子的污染，保证核酸纯度尽量清除其它分子的污染，保证核酸纯度 3. 3.保持核酸的完整性保持

4、核酸的完整性 尽量简化分离纯化步骤，缩短提取时间尽量简化分离纯化步骤，缩短提取时间 尽量避免各种有害因素对核酸的破坏尽量避免各种有害因素对核酸的破坏 （二）（二） 选择原则选择原则一、材料与方法的选择一、材料与方法的选择核酸的分离纯化二、技术路线的设计二、技术路线的设计（一）核酸的释放（一）核酸的释放（二）核酸的分离与纯化（二）核酸的分离与纯化（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤核酸的分离纯化（一）核酸的释放（一）核酸的释放 DNADNA和和RNARNA均均位位于于细细胞胞内内（病病毒毒除除外外），因因此此核核酸酸分分离离与与纯纯化化的的第第一一步步即即是是裂裂解解细细胞胞

5、、释释放核酸。放核酸。二、技术路线的设计二、技术路线的设计核酸的分离纯化核酸的分离纯化 应该清除的杂质主要包括应该清除的杂质主要包括: : 1. 1.非核酸的大分子污染物非核酸的大分子污染物 蛋白质、多糖及脂类物质等蛋白质、多糖及脂类物质等 2. 2.非需要的核酸分子非需要的核酸分子 分离某一核酸分子时，其它核酸皆为杂质分离某一核酸分子时，其它核酸皆为杂质 3. 3.加入的有机溶剂和某些金属离子加入的有机溶剂和某些金属离子（二）核酸的分离与纯化（二）核酸的分离与纯化二、技术路线的设计二、技术路线的设计核酸的分离纯化（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤沉淀沉淀是是浓缩浓缩核酸

6、最常用的方法核酸最常用的方法常用的常用的盐类盐类: :醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁钠、氯化钾及氯化镁常用的常用的有机溶剂有机溶剂: :乙醇、异丙醇和聚乙二醇乙醇、异丙醇和聚乙二醇核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐，需用核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐，需用70%70%75%75%的乙醇的乙醇洗涤洗涤去除去除二、技术路线的设计二、技术路线的设计核酸的分离纯化三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存（一）核酸的鉴定（一）核酸的鉴定（二）核酸的保存（二）核酸的保存核酸的分离纯化（一）核酸的鉴定（一）核酸的鉴定1.1.浓度鉴定浓度鉴定2.2.纯度鉴定纯度鉴定3.

7、3.完整性鉴定完整性鉴定三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存核酸的分离纯化 紫外分光光度法：紫外分光光度法： 核核酸酸分分子子中中的的碱碱基基具具有有共共轭轭双双键键结结构构，可以吸收紫外线，其最大吸收波长为可以吸收紫外线，其最大吸收波长为260nm260nm。 1. 1.浓度鉴定浓度鉴定三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存核酸的分离纯化 各种碱基的紫外吸收光谱各种碱基的紫外吸收光谱三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存核酸的分离纯化 荧光光度法：荧光光度法： 核核酸酸的的荧荧光光染染料料溴溴化化乙乙锭锭嵌嵌入入碱碱基基平平面面后后，本本身身无无荧荧光光的的核核酸酸在在 UV UV

8、激激发发下下发发出出红红色色荧荧光光。荧光强度的积分与溶液中核酸的含量呈正比。荧光强度的积分与溶液中核酸的含量呈正比。三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存核酸的分离纯化EBEB与与DNADNA的结合的结合三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存核酸的分离纯化 紫外分光光度法：紫外分光光度法： 主主要要通通过过A A260260与与A A280280的的比比值值来来判判定定有有无无蛋蛋白白质质的的污污染染。比比值值升升高高或或降降低低均均提提示示制制备备的的核核酸酸纯纯度度不佳。不佳。 2. 2.纯度鉴定纯度鉴定三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存核酸的分离纯化1.DNA1.DNA或或R

9、NARNA的定量的定量ODOD260260=1.0=1.0相当于相当于 50 50g/mlg/ml双链双链DNADNA 40 40g/mlg/ml单链单链DNADNA（或（或RNARNA） 20g/ml 20g/ml寡核苷酸寡核苷酸2.2.判断核酸样品的纯度判断核酸样品的纯度 DNA DNA纯品纯品: : ODOD260260/OD/OD280 280 = 1.8= 1.8 RNA RNA纯品纯品: : ODOD260260/OD/OD280 280 = 2.0= 2.0三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存核酸的分离纯化荧光光度法：荧光光度法： EB EB等荧光染料示踪的核酸电泳可判定核等

10、荧光染料示踪的核酸电泳可判定核酸制品的纯度。酸制品的纯度。三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存核酸的分离纯化琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳：以以EBEB为为示示踪踪剂剂的的核核酸酸凝凝胶胶电电泳泳可可判判定定核核酸酸制制品的完整性品的完整性基因组基因组DNADNA如果发生降解，电泳图呈拖尾状如果发生降解，电泳图呈拖尾状 3. 3.完整性鉴定完整性鉴定三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存核酸的分离纯化DNADNA的降解的降解三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存核酸的分离纯化 完整的或降解很少的完整的或降解很少的总总RNARNA电泳图谱中，三条电泳图谱中，三条带荧光强度应呈特定的比值。

11、带荧光强度应呈特定的比值。沉降系数大，电泳迁移率低，荧光强度高沉降系数大，电泳迁移率低，荧光强度高沉降系数小，电泳迁移率高，荧光强度低沉降系数小，电泳迁移率高，荧光强度低 三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存核酸的分离纯化28S28S（或或23S23S）RNARNA的的荧荧光光强强度度一一般般约约为为18S18S（或或16S16S）RNARNA的的2 2倍，否则提示有倍，否则提示有RNARNA的降解的降解若若在在点点样样孔孔附附近近有有着着色色条条带带，提提示示可可能能存存在在DNADNA的污染的污染三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存核酸的分离纯化三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与

12、保存核酸的分离纯化（二）核酸的保存（二）核酸的保存1.DNA1.DNA的储存的储存2.RNA2.RNA的储存的储存三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存核酸的分离纯化 溶于溶于TETE缓冲液中的缓冲液中的DNADNA在在-70-70冰箱可保存数年。冰箱可保存数年。 TE TE的的pHpH为为8.08.0时，时，DNADNA的脱氨反应减少，的脱氨反应减少，pHpH低低7.07.0时时DNADNA易变性。易变性。 1.DNA 1.DNA的保存的保存（二）核酸的保存（二）核酸的保存三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存核酸的分离纯化 2.RNA 2.RNA的保存的保存三、核酸的鉴定与保存三、核酸

13、的鉴定与保存 RNARNA溶于溶于H2OH2O或或0.3mol/L0.3mol/L的的NaAcNaAc溶液中，溶液中，-70 -70 保存保存 RNARNA溶液中加入溶液中加入RNasinRNasin或或VRCVRC，可延长保存时间，可延长保存时间 用于配置试剂及溶解用于配置试剂及溶解RNARNA的的H2OH2O均应经均应经DEPCDEPC处理处理核酸的分离纯化第二节第二节 真核基因组真核基因组DNADNA的分离纯化的分离纯化核酸的分离纯化生物体组织细胞生物体组织细胞玻棒缠绕法玻棒缠绕法酚抽提法酚抽提法基因组基因组 DNA粗品粗品PFGE分离分离特定的特定的DNA片段片段AGE分离分离PAGE

14、分离分离乙醇沉淀洗涤乙醇沉淀洗涤基因组基因组DNA纯品纯品精分离精分离粗分离粗分离前处理前处理离子交换层析纯化离子交换层析纯化有机溶剂抽提有机溶剂抽提细胞裂解蛋白质变性细胞裂解蛋白质变性沉淀降解沉淀降解DNA释放释放甲酰胺解聚法甲酰胺解聚法 哺乳动物基因组哺乳动物基因组DNADNA分离纯化的一般技术路线分离纯化的一般技术路线第二节第二节 真核基因组真核基因组DNADNA的分离纯化的分离纯化核酸的分离纯化第二节第二节 真核基因组真核基因组DNADNA的分离纯化的分离纯化一、酚抽提法一、酚抽提法二、甲酰胺解聚法二、甲酰胺解聚法三、玻棒缠绕法三、玻棒缠绕法四、其它方法四、其它方法五、五、DNADNA

15、片段的纯化片段的纯化六、六、DNADNA片段的回收片段的回收核酸的分离纯化 一、酚抽提法一、酚抽提法19761976年年由由StaffordStafford及及其其同同事事创创立立，现现在在使使用用的的是是改进的方法改进的方法以含以含EDTAEDTA、SDSSDS及及RNaseRNase的的裂解缓冲液裂解细胞裂解缓冲液裂解细胞经经蛋蛋白白酶酶K K处处理理后后，用用pH8.0pH8.0的的TrisTris饱饱和和酚酚抽抽提提，获得获得DNADNA粗制品粗制品核酸的分离纯化 一、酚抽提法一、酚抽提法核酸的分离纯化二、甲酰胺解聚法二、甲酰胺解聚法 19871987年年KupiecKupiec等等报

16、报道道了了甲甲酰酰胺胺解解聚聚法法，其其中中细细胞胞裂裂解解和和蛋蛋白白质质水水解解步步骤骤同同酚酚抽抽提提法法，但但不不进进行酚的抽提。行酚的抽提。核酸的分离纯化 三、玻棒缠绕法三、玻棒缠绕法玻棒玻棒缠绕法是在缠绕法是在Bowtell(1987)Bowtell(1987)方法的基础上经改进而来方法的基础上经改进而来核酸的分离纯化四、其它方法四、其它方法 有有些些分分子子诊诊断断技技术术并并不不需需要要高高分分子子量量的的DNADNA样样品品，因因此此步步骤骤简简化化、操操作作简简便便的的DNADNA快快速速提取法广泛使用。提取法广泛使用。 1.1.异丙醇沉淀法异丙醇沉淀法 2. 2.玻璃珠吸

17、附法玻璃珠吸附法核酸的分离纯化五、五、 DNA DNA片段的纯化片段的纯化 常用的纯化方法：常用的纯化方法： 有机溶剂抽提法有机溶剂抽提法 柱层析法（柱层析法（column chromatographycolumn chromatography）核酸的分离纯化五、五、 DNADNA片段的纯化片段的纯化核酸的分离纯化六、六、 DNA DNA片段的回收片段的回收原则与要求原则与要求: : 1. 1.提高片段的回收率提高片段的回收率 2. 2.清除回收的清除回收的DNADNA样品中的杂质样品中的杂质核酸的分离纯化六、六、 DNA DNA片段的回收片段的回收（二）（二） 从聚丙烯酰胺凝胶中回收从聚丙烯

18、酰胺凝胶中回收DNADNA片段片段（一）（一） 从琼脂糖凝胶中回收从琼脂糖凝胶中回收DNADNA片段片段核酸的分离纯化1.1.二乙基氨基乙基二乙基氨基乙基- -纤维素膜插片电泳法纤维素膜插片电泳法2.2.电泳洗脱法电泳洗脱法3.3.冷冻挤压法冷冻挤压法4.4.低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法 （一）（一） 从琼脂糖凝胶中回收从琼脂糖凝胶中回收DNADNA片段片段六、六、 DNA DNA片段的回收片段的回收核酸的分离纯化（二）从聚丙烯酰胺凝胶中回收（二）从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNADNA片段片段 标标准准方方法法是是压压碎碎与与浸浸泡泡法法。费费时时但但操操作作简简单单，是小

19、片段是小片段DNADNA回收的较好方法。回收的较好方法。六、六、 DNA DNA片段的回收片段的回收核酸的分离纯化第三节第三节 质粒质粒DNADNA的提取与纯化的提取与纯化 核酸的分离纯化第三节第三节 质粒质粒DNADNA的提取与纯化的提取与纯化二、煮沸裂解法二、煮沸裂解法三、三、SDS裂解法裂解法四、其他方法四、其他方法一、碱裂解法一、碱裂解法五、质粒五、质粒DNADNA的纯化的纯化核酸的分离纯化一、碱裂解法一、碱裂解法 在在强强碱碱（pH12.0pH12.012.612.6）条条件件下下，用用SDSSDS破破坏坏细细胞胞壁壁和和裂裂解解细细胞胞，并并使使细细胞胞的的蛋蛋白白质质与与DNAD

20、NA发生变性，释放出质粒发生变性，释放出质粒DNADNA。核酸的分离纯化一、碱裂解法一、碱裂解法细细胞胞裂裂解解后后，细细胞胞壁壁、细细胞胞膜膜的的碎碎片片、变变性性的的蛋白质和蛋白质和染色体染色体DNADNA形成大的复合物形成大的复合物当当pHpH调调至至中中性性，质质粒粒DNADNA重重新新恢恢复复天天然然的的超超螺螺旋结构旋结构在在高高盐盐条条件件下下沉沉淀淀，经经离离心心分分离离，质质粒粒DNADNA保保留在上清液中留在上清液中核酸的分离纯化一、碱裂解法一、碱裂解法核酸的分离纯化二、煮沸裂解法二、煮沸裂解法 将将细细菌菌悬悬浮浮于于含含TritonX-100TritonX-100和和溶

21、溶菌菌酶酶的的缓缓冲冲液液中中，TritonX-100TritonX-100和和溶溶菌菌酶酶能能破破坏坏细细胞胞壁壁，再再用用沸沸水水浴浴裂裂解解细细胞胞，并并使使宿宿主主细细胞胞的的蛋蛋白白质质与与DNADNA变变性。性。核酸的分离纯化二、煮沸裂解法二、煮沸裂解法质质粒粒DNADNA因因结结构构紧紧密密不不会会解解链链，当当温温度度下下降降后后，可重新恢复其天然超螺旋结构可重新恢复其天然超螺旋结构通通过过离离心心去去除除变变性性的的蛋蛋白白质质和和染染色色体体DNA, DNA, 然然后回收上清液中的质粒后回收上清液中的质粒DNADNA核酸的分离纯化三、三、SDSSDS裂解法裂解法将将细细菌菌

22、悬悬浮浮于于等等渗渗的的蔗蔗糖糖溶溶液液中中，用用溶溶菌菌酶酶和和EDTAEDTA处理以破坏细胞壁处理以破坏细胞壁用用SDSSDS裂解去壁细胞，温和释放质粒到等渗液中裂解去壁细胞，温和释放质粒到等渗液中用酚用酚/ /氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤质粒氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤质粒DNADNA核酸的分离纯化三、三、SDSSDS裂解法裂解法 由由于于条条件件温温和和， SDSSDS裂裂解解法法特特别别适适用用于于大大质质粒粒DNADNA（15kb15kb）的的提提取取。但但由由于于部部分分质质粒粒DNADNA会与细胞碎片缠绕在一起而丢失，故产率不高。会与细胞碎片缠绕在一起而丢失，故产率不高。核酸的分离纯化

23、四、其他方法四、其他方法（二）牙签少量制备法（二）牙签少量制备法( (一一) ) 小量一步提取法小量一步提取法核酸的分离纯化四、其它方法四、其它方法( (一一) ) 小量一步提取法小量一步提取法直接将酚直接将酚/ /氯仿与细菌培养物混合，然后离心去除氯仿与细菌培养物混合，然后离心去除大部分蛋白质和染色体大部分蛋白质和染色体DNADNA，最后从上清液中回收，最后从上清液中回收质粒质粒DNADNA简单快捷、成本低，提取的质粒可用于限制性内简单快捷、成本低，提取的质粒可用于限制性内切酶图谱分析切酶图谱分析核酸的分离纯化四、其它方法四、其它方法（二）牙签少量制备法（二）牙签少量制备法用牙签直接挑取生长

24、在琼脂用牙签直接挑取生长在琼脂平板上的细菌菌落平板上的细菌菌落制备质粒制备质粒DNADNA由于制备的质粒由于制备的质粒DNADNA有较多污染，不能用于分子有较多污染，不能用于分子克隆中的酶学反应，但可用于质粒的鉴定克隆中的酶学反应，但可用于质粒的鉴定核酸的分离纯化五、质粒五、质粒DNADNA的纯化的纯化.CsCl-EB.CsCl-EB法法. .聚乙二醇沉淀法聚乙二醇沉淀法. .柱层析法柱层析法核酸的分离纯化 在过量在过量EBEB存在的条件下，各种不同密度的物质存在的条件下，各种不同密度的物质经离心平衡后得以分开。经离心平衡后得以分开。蛋白质由于密度小而浮于液面蛋白质由于密度小而浮于液面RNAR

25、NA密度大而沉于管底密度大而沉于管底各种各种DNADNA密度介于蛋白质与密度介于蛋白质与RNARNA之间，处于中部之间，处于中部 五、质粒五、质粒DNA的纯化的纯化EB-CsClEB-CsCl密度梯度离心法密度梯度离心法核酸的分离纯化五、质粒五、质粒DNADNA的纯化的纯化核酸的分离纯化 不同分子构型的不同分子构型的DNADNA与与EBEB的结合能力不同，密的结合能力不同，密度下降也不同，因而可将它们有效分离开。度下降也不同，因而可将它们有效分离开。 染色体染色体DNADNA、开环质粒、开环质粒DNADNA等可嵌入更多的等可嵌入更多的EBEB，因，因而密度下降较多而密度下降较多 闭环质粒闭环质

26、粒DNADNA为超螺旋三级结构，为超螺旋三级结构，EBEB不易插入而不易插入而结合量少，密度下降较少结合量少，密度下降较少 五、质粒五、质粒DNADNA的纯化的纯化核酸的分离纯化五、质粒五、质粒DNADNA的纯化的纯化核酸的分离纯化第四节第四节 真核细胞真核细胞RNARNA的分离纯化的分离纯化核酸的分离纯化第四节第四节 真核细胞真核细胞RNARNA的分离纯化的分离纯化二、酸性异硫氰酸胍二、酸性异硫氰酸胍- -酚酚- -氯仿一步法氯仿一步法三、商品化试剂单相裂解法三、商品化试剂单相裂解法四、四、mRNAmRNA的分离纯化的分离纯化一、一、RNARNA制备的条件与环境制备的条件与环境核酸的分离纯化

27、一、一、RNARNA制备的条件与环境制备的条件与环境RNARNA易易被被RNaseRNase水水解解，RNaseRNase除除细细胞胞内内还还广广泛泛存存在在于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中RNaseRNase分分子子结结构构中中的的二二硫硫键键使使其其生生物物学学活活性性非非常常稳定，去除变性剂后，稳定，去除变性剂后，RNaseRNase的活性又可恢复的活性又可恢复核酸的分离纯化一、一、RNARNA制备的条件与环境制备的条件与环境去去除除RNaseRNase的的污污染染和和抑抑制制其其活活性性是是RNARNA制制备备成成功与否的关键功与否的关键在在总总

28、RNARNA提提取取分分离离的的最最初初阶阶段段，尽尽可可能能地地灭灭活细胞内活细胞内RNaseRNase的活性的活性核酸的分离纯化 选选择择性性地地使使用用RNaseRNase的的变变性性剂剂（如如酚酚、氯氯仿仿及强烈的胍类变性剂）及强烈的胍类变性剂）使用使用蛋白酶蛋白酶K K 使使用用阴阴离离子子去去污污剂剂如如SDSSDS、十十二二烷烷基基肌肌氨氨酸酸钠钠或脱氧胆酸钠或脱氧胆酸钠一、一、RNARNA制备的条件与环境制备的条件与环境核酸的分离纯化联联合合使使用用RNaseRNase的的特特异异抑抑制制剂剂（如如RNasinRNasin与与DEPCDEPC等）能极大地防止内源性等）能极大地防

29、止内源性RNaseRNase对对RNARNA的降解的降解加加入入-巯巯基基乙乙醇醇、二二硫硫苏苏糖糖醇醇（DTTDTT）等等还还原原剂剂可可以以还还原原RNaseRNase中中的的二二硫硫键键，有有利利于于RNaseRNase的的变变性性、水解与灭活水解与灭活一、一、RNARNA制备的条件与环境制备的条件与环境核酸的分离纯化二、酸性异硫氰酸胍二、酸性异硫氰酸胍- -酚酚- -氯仿一步法氯仿一步法以以含含异异硫硫氰氰酸酸胍胍、-疏疏基基乙乙醇醇和和十十二二烷烷基基肌肌氨酸钠的氨酸钠的变性溶液变性溶液裂解细胞裂解细胞在在pH4.0pH4.0的条件下，酚的条件下，酚/ /氯仿抽提细胞氯仿抽提细胞裂解

30、溶液裂解溶液通过异丙醇沉淀与通过异丙醇沉淀与75%75%的乙醇洗涤而获得总的乙醇洗涤而获得总RNARNA核酸的分离纯化二、酸性异硫氰酸胍二、酸性异硫氰酸胍- -酚酚- -氯仿一步法氯仿一步法 总总RNARNA产产量量取取决决于于标标本本的的起起始始量量，每每mgmg组组织织大大约约能能制制备备4 47g7g总总RNARNA，每每10106 6个个细细胞胞大大约约能能制备制备4 410g10g总总RNARNA。 核酸的分离纯化三、商品化试剂单相裂解法三、商品化试剂单相裂解法是异硫氰酸胍是异硫氰酸胍- -酚酚- -氯仿一步法的改进方案氯仿一步法的改进方案以以异异硫硫氰氰酸酸胍胍- -酚酚的的单单相

31、相裂裂解解液液裂裂解解细细胞胞，再再加入加入氯仿氯仿后形成两相后形成两相核酸的分离纯化三、商品化试剂单相裂解法三、商品化试剂单相裂解法变变性性的的DNADNA与与蛋蛋白白质质介介于于两两相相的的交交界界面面，可可使使用乙醇和异丙醇分级沉淀出来用乙醇和异丙醇分级沉淀出来保保留留于于上上层层水水相相的的RNARNA，通通过过异异丙丙醇醇沉沉淀淀与与75%75%乙醇洗涤而制备乙醇洗涤而制备核酸的分离纯化三、商品化试剂单相裂解法三、商品化试剂单相裂解法 目目前前，该该法法已已成成为为实实验验室室最最常常用用的的总总RNARNA提提取取法法，其其产产量量及及质质量量与与酸酸性性异异硫硫氰氰酸酸胍胍- -

32、酚酚- -氯氯仿一步法仿一步法相当。相当。核酸的分离纯化四、四、mRNAmRNA的分离纯化的分离纯化除除血血红红蛋蛋白白及及组组蛋蛋白白的的mRNAmRNA外外，绝绝大大多多数数mRNAmRNA在其在其33末端带有长短不同的末端带有长短不同的polypoly（A A）尾巴）尾巴利利用用碱碱基基配配对对原原则则，通通过过oligooligo（dTdT）- -纤纤维维素素或或polypoly（U U）- -琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶的的亲亲和和层层析析，可可以以很很容易地从总容易地从总RNARNA制品中分离纯化制品中分离纯化mRNAmRNA核酸的分离纯化1.oligo1.oligo（dTdT）- -纤维

33、素柱层析法纤维素柱层析法2.oligo2.oligo（dTdT）- -纤维素柱离心法纤维素柱离心法3.oligo3.oligo（dTdT）- -纤维素液相结合离心法纤维素液相结合离心法4.4.磁珠分离法磁珠分离法四、四、mRNAmRNA的分离纯化的分离纯化核酸的分离纯化5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5+总RNA中的poly(A) +RNA分子退火形成杂交体 5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5链亲和素标记的磁珠+Streptavidin- 磁5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5Streptavidin- 磁生物素与链亲和素的特异性结合 磁性分离5m7G AAAAAAAAAAAA3 磁铁3TTTTTTTTTTTT-Biotin5Streptavidin- 磁洗涤与洗脱水相(含纯化的mRNA)固相生物素标记的oligo(dT)磁铁5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5Streptavidin- 磁四、四、mRNAmRNA的分离纯化的分离纯化核酸的分离纯化