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1、什么是TLC？薄层色谱法（thin layer chromatography,TLC）是将适宜的固定相喷涂（或喷雾）于玻璃板，塑料或铝基片上，成一均匀薄层。干燥后进行点样，展开，斑点定位；或与适宜的对照物随行对照比较，或用薄层扫描仪扫描，用于药物或其他化合物的分离，鉴别，检查或含量测定等。TLC是一种简单、快速的色谱技术。是一种简单、快速的色谱技术。TLC法特法特别适用于挥发性较小或在较高温度易发生变别适用于挥发性较小或在较高温度易发生变化的物质的分离。化的物质的分离。薄层色谱不需要特殊设备，操作简单，试样薄层色谱不需要特殊设备，操作简单，试样和展开剂用量少，展开速度快。和展开剂用量少，展开速
2、度快。TLC经常被用于探索柱色谱分离条件和监测柱经常被用于探索柱色谱分离条件和监测柱色谱过程色谱过程 。在进行化学反应时，可利用薄层色谱观察原在进行化学反应时，可利用薄层色谱观察原料斑点的逐步消失来判断反应是否完成。料斑点的逐步消失来判断反应是否完成。 概概 述述一、发展历史一、发展历史19381938年俄国人首先实现了在氧化铝薄层上分离一种年俄国人首先实现了在氧化铝薄层上分离一种天然药物。天然药物。19651965年德国化学家出版了年德国化学家出版了“薄层色谱法薄层色谱法”一书，促一书，促进了这一技术的发展。进了这一技术的发展。因因TLCTLC法设备简单，分析速度快，分离效率高，法设备简单，
3、分析速度快，分离效率高，结果直观，很快被用作定性和半定量的方法。结果直观，很快被用作定性和半定量的方法。 7070年代中后期发展了高效薄层色谱。年代中后期发展了高效薄层色谱。8080年代以年代以后发展了薄层色谱光密度扫描仪，各步操作后发展了薄层色谱光密度扫描仪，各步操作实现了仪器化，并实现了计算机化。实现了仪器化，并实现了计算机化。二、特点二、特点: :（薄层色谱与高效液相色谱的差（薄层色谱与高效液相色谱的差别）别）1.1.固定相和流动相固定相和流动相TLC流动相流动靠毛细作用力，流动相流动相流动靠毛细作用力，流动相选择较少受限制，固定相不用再生。选择较少受限制，固定相不用再生。HPLC是在封
4、闭的系统内，流动相流量靠泵是在封闭的系统内，流动相流量靠泵控制，溶剂选择受检测器限制，固定相需再控制，溶剂选择受检测器限制，固定相需再生。生。2.样品处理样品处理TLC要求没有要求没有HPLC严格。严格。3.色谱分离色谱分离TLC可同时分离多个样品，并可采用相同或不可同时分离多个样品，并可采用相同或不同溶剂进行同向或双向多次展开，通常采用正同溶剂进行同向或双向多次展开，通常采用正相色谱，色谱后衍生化方便。相色谱，色谱后衍生化方便。HPLC一次只能分离一个样品，通常采用反相一次只能分离一个样品，通常采用反相色谱，色谱后衍生化受限制。色谱，色谱后衍生化受限制。4.对污染物抗受力对污染物抗受力TLC
5、颗粒物质、腐蚀性物质、不可逆吸附颗粒物质、腐蚀性物质、不可逆吸附物质均无影响。物质均无影响。HPLC颗粒物质、腐蚀性物质、不可逆吸颗粒物质、腐蚀性物质、不可逆吸附物质均有大的影响。附物质均有大的影响。 薄层色谱参数一、保留参数一、保留参数1.Rf值值用来表征斑点位置的基本参数是用来表征斑点位置的基本参数是比移值比移值，用，用Rf表示。表示。Rf=Ls/L0原点SRWLsL0Lr原点参比样品前沿注意：注意：同一物质在不同展开方式中得到的比移值是不相同的。同一物质在不同展开方式中得到的比移值是不相同的。在同样溶剂的重复在同样溶剂的重复n次的多次展开后的比移值次的多次展开后的比移值(Rf)n=1-(
6、1-Rf)n2.相对比移值（相对比移值（Rx）在难以确定溶剂前沿的位置时，需要引入在难以确定溶剂前沿的位置时，需要引入相对比相对比移值移值（Rx）Rx=Ls/Lr二、分离效能参数二、分离效能参数1.理论塔板数理论塔板数n=16Ls/W2，考虑静态扩散对起始斑点半峰，考虑静态扩散对起始斑点半峰宽的影响引入真实塔板数（宽的影响引入真实塔板数（n真实真实）n真实真实=5.54Ls/（b0.5-b0）2b0.5为样品斑点半峰宽，为样品斑点半峰宽，b0样品起始斑点半峰样品起始斑点半峰宽宽塔板高度塔板高度h真实真实=Ls/n真实真实2.容量因子（容量因子（k）k=ts/tm（物质在两相中滞留时间之比）（物
7、质在两相中滞留时间之比）又又k=K（Vs/Vm）Rf=Vm/（Vm+KVs）=1/（1+k）k94210.50Rf00.10.20.330.50.671 3.3.分离度分离度分离度分离度 R=R= 因因因因Ls=RLs=RffLL00，同时对相邻的两个斑点，假定，同时对相邻的两个斑点，假定，同时对相邻的两个斑点，假定，同时对相邻的两个斑点，假定WW11=W=W22=W=W 则则则则R=LR=L00= R Rff 与与与与n=16Ln=16Lss/W/W22式合并，得：式合并，得：式合并，得：式合并，得：2(Ls.2-Ls.1)W1+W2R Rf.2f.2- R- Rf.1f.1WWL L0 0
8、WWR Rf f与与R R之之间存在着如图所示关系：间存在着如图所示关系： 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 1 RfR1.000.750.50.250R R R Rf f f f=0.3,R=0.3,R=0.3,R=0.3,R最高最高最高最高R R R Rf f f f在在在在0.2-0.5,R0.2-0.5,R0.2-0.5,R0.2-0.5,R变化不大变化不大变化不大变化不大R R R Rf f f f0.10.10.10.1或或或或0.7,R0.7,R0.7,R0.7,R下降下降下降下降 流动相与固定相流动相与固定相液液-固吸附固吸附在该色谱中，溶质的保留在该色谱中，溶质的保留和
9、分离选择性决定于三个因素：和分离选择性决定于三个因素：溶溶解解能能力力流动相溶质吸附剂相互作用相互作用竞争竞争固定相固定相要求：纯度高，含杂质少；要求：纯度高，含杂质少；粒度，结构均匀一致，有一定的比表面粒度，结构均匀一致，有一定的比表面积；积；在展开剂中不溶；在展开剂中不溶；与展开剂和式样组分不发生化学反应；与展开剂和式样组分不发生化学反应；具有适当的吸附能力；具有适当的吸附能力；机械强度和稳定性。机械强度和稳定性。选择：分离亲脂性化合物，选择氧化铝，硅选择：分离亲脂性化合物，选择氧化铝，硅胶，乙酰化纤维素以及聚酰胺胶，乙酰化纤维素以及聚酰胺分离亲水性化合物，选择纤维素和离分离亲水性化合物，
10、选择纤维素和离子交换纤维素及硅藻土。子交换纤维素及硅藻土。一般，被分离组的极性强，选择吸附一般，被分离组的极性强，选择吸附能力弱的吸附剂；反之，选吸附能力较强能力弱的吸附剂；反之，选吸附能力较强者。者。种类：种类：硅胶硅胶为使用最广泛的薄层材料为使用最广泛的薄层材料氧化铝氧化铝有碱性、中性、酸性有碱性、中性、酸性硅藻土硅藻土为化学中性吸附剂为化学中性吸附剂纤维素纤维素天然多糖类天然多糖类聚酰胺聚酰胺为特殊类型有机薄层材料，对能形为特殊类型有机薄层材料，对能形成氢键的物质有特别的选择性成氢键的物质有特别的选择性硅胶硅胶：化学分子式为：化学分子式为mSiO2nH2O,多孔性多孔性微粒，表面带有硅醇
11、基，呈弱酸性。微粒，表面带有硅醇基，呈弱酸性。常用硅胶规格：常用硅胶规格：硅胶硅胶H H，不含黏合剂，不含黏合剂硅胶硅胶G G，含煅石膏（硫酸钙），含煅石膏（硫酸钙）硅胶硅胶S S，用，用5%5%淀粉作黏合剂淀粉作黏合剂硅胶，用羧甲基纤维素（硅胶，用羧甲基纤维素（CMCCMC）作黏合剂）作黏合剂硅胶硅胶GFGF254254，含煅石膏和一种无机荧光剂，含煅石膏和一种无机荧光剂，即锰激活的硅酸锌，在即锰激活的硅酸锌，在254nm254nm紫外光下呈强紫外光下呈强烈黄绿色荧光背景。烈黄绿色荧光背景。 氧化铝氧化铝碱性氧化铝碱性氧化铝(pH9.0)分离中性或碱性化合分离中性或碱性化合物，如生物碱、脂溶
12、性维生素等；物，如生物碱、脂溶性维生素等； 中性氧化铝中性氧化铝(pH7.5)分离酸性及对碱不稳分离酸性及对碱不稳定的化合物；定的化合物； 酸性氧化铝酸性氧化铝(pH4.0)酸性化合物的分离。酸性化合物的分离。活度也与含水量有关。活度也与含水量有关。流动相（展开剂）流动相（展开剂）要求：待测组分很好地溶解不与组分发生要求：待测组分很好地溶解不与组分发生化学反应；化学反应；组分斑点圆而集中，无拖尾现象；组分斑点圆而集中，无拖尾现象；注意注意Rf的选择。的选择。选择：选择：“相似相溶相似相溶”原则原则 同吸附柱色谱同吸附柱色谱极性强的溶剂洗脱能力强极性强的溶剂洗脱能力强常用溶剂的极性强弱顺序：常用
13、溶剂的极性强弱顺序：水酸吡啶甲醇乙醇正丙醇水酸吡啶甲醇乙醇正丙醇丙酮乙酸乙酯乙醚氯仿二氯甲丙酮乙酸乙酯乙醚氯仿二氯甲烷甲苯苯三氯乙烷四氯化碳烷甲苯苯三氯乙烷四氯化碳 环己环己烷烷 石油醚。石油醚。 展开剂展开剂选择原则：选择原则：根据被分根据被分离物质的极性离物质的极性StahlStahl简图：极性物简图：极性物质质活度低（活性活度低（活性级大）的吸附剂级大）的吸附剂-极性展开剂极性展开剂 展开剂展开剂先用单一溶剂展开，先用单一溶剂展开，若若R Rf f值太小，值太小，则加入一定量极性强的溶剂，如乙醇、丙酮等，则加入一定量极性强的溶剂，如乙醇、丙酮等，如果如果R Rf f值太大，值太大，则加入
14、适量极性弱的溶剂则加入适量极性弱的溶剂( (如环己烷、石油醚等如环己烷、石油醚等) )，以降低极性。，以降低极性。可加入一定比例的酸或碱可加入一定比例的酸或碱, ,使斑点集中。使斑点集中。流动相选择时需考虑溶剂的下列情况流动相选择时需考虑溶剂的下列情况一些溶剂如氯仿、乙醚一般含有微量乙醇作保护剂，一些溶剂如氯仿、乙醚一般含有微量乙醇作保护剂，有时需重蒸除去乙醇。有时需重蒸除去乙醇。许多溶剂有吸湿性，使溶剂含水量不一致，导致实许多溶剂有吸湿性，使溶剂含水量不一致，导致实验难以重现。验难以重现。溶剂储藏时间和条件对溶剂质量影响，应注意出厂溶剂储藏时间和条件对溶剂质量影响，应注意出厂日期。日期。混合
15、流动相组分之间（或杂质）可能发生相互作用。混合流动相组分之间（或杂质）可能发生相互作用。对于易挥发的溶剂，难于配制稳定组成的流动相。对于易挥发的溶剂，难于配制稳定组成的流动相。要求操作格外小心，同时混合流动相不应重复使用。要求操作格外小心，同时混合流动相不应重复使用。溶剂的选择性溶剂的选择性指溶剂引起两种溶质位移差别的能力，即分离指溶剂引起两种溶质位移差别的能力，即分离度。度。R=1/4（ -1） k/（ k+1）分离因子分离因子 =k1/k2，k为为k1和和k2的平均值的平均值由上式可见，由上式可见，R取决于三个因子：取决于三个因子：理论塔片理论塔片n主要是吸附剂性质的函数主要是吸附剂性质的
16、函数 k反映了两种溶质的平均迁移速度，其由流动相溶反映了两种溶质的平均迁移速度，其由流动相溶剂强度剂强度决定决定 取决于吸附剂和流动相的组成取决于吸附剂和流动相的组成溶剂优化规则：溶剂优化规则：增加溶剂强度增加溶剂强度，使，使Rf值增大，但也可能降低分值增大，但也可能降低分离能力。离能力。流动相中较强组分的流动相中较强组分的体积比体积比小于小于5%或大于或大于50%，选择性最大，此时最有利于溶质与流动相组，选择性最大，此时最有利于溶质与流动相组分的选择性相互作用。分的选择性相互作用。用乙醚或甲醇代替流动相中的一种较强组分，用乙醚或甲醇代替流动相中的一种较强组分，由于形成由于形成氢键氢键可改善选
17、择性。可改善选择性。若出现斑点拖尾，可向流动相中加少量水，或若出现斑点拖尾，可向流动相中加少量水，或降低薄层活性降低薄层活性，有利于改善分离。，有利于改善分离。也可采用两种强溶剂与一种弱溶剂组成的三元也可采用两种强溶剂与一种弱溶剂组成的三元混合流动相混合流动相，此时，溶剂强度由弱溶剂控制，此时，溶剂强度由弱溶剂控制，而溶剂选择性则由两强溶剂控制。而溶剂选择性则由两强溶剂控制。斑点的扩散与形状斑点的扩散与形状在在TLC中斑点的移动与扩散是二维的，因为中斑点的移动与扩散是二维的，因为斑点在展开方向和与之垂直方向上的扩散速斑点在展开方向和与之垂直方向上的扩散速度是不相等的，展开剂的移动速度也是不等度
18、是不相等的，展开剂的移动速度也是不等的，在单位体积或单位质量薄层内所含的溶的，在单位体积或单位质量薄层内所含的溶剂量越接近溶剂前沿减少得越明显，直至溶剂量越接近溶剂前沿减少得越明显，直至溶剂前沿时为零，这一现象称为剂前沿时为零，这一现象称为“溶剂的体积溶剂的体积梯度梯度”，在各种展开形式中均存在。当然，在各种展开形式中均存在。当然，对于这一问题实际上只是在定量斑点浓度时对于这一问题实际上只是在定量斑点浓度时才需要考虑。才需要考虑。同时同时一种成分的色谱行为会受到混合物中其他一种成分的色谱行为会受到混合物中其他成分的影响成分的影响，这种影响的大小取决于混合成分，这种影响的大小取决于混合成分的种类
19、、浓度、以及斑点间的距离等。这种影的种类、浓度、以及斑点间的距离等。这种影响一般使分配系数变小。如两个相邻斑点中后响一般使分配系数变小。如两个相邻斑点中后面的一个展开速度较其单独展开时为大。面的一个展开速度较其单独展开时为大。固定相的活度及其调节固定相的活度及其调节在其他因素一定时，活度增加，在其他因素一定时，活度增加，Rf值减少，值减少，反之亦然。可通过预吸附溶剂分子，调节其反之亦然。可通过预吸附溶剂分子，调节其表面活性。例如可将活化薄层板放在相对湿表面活性。例如可将活化薄层板放在相对湿度恒定的空间里来达到调节活度的目的。度恒定的空间里来达到调节活度的目的。实际工作中常常使固定相预吸附一定量
20、单一实际工作中常常使固定相预吸附一定量单一或混合溶剂蒸气，预吸附量越大，溶剂前沿或混合溶剂蒸气，预吸附量越大，溶剂前沿运动速度越快，物质斑点的运动速度越快，物质斑点的Rf值越小。值越小。预吸附还可能影响预吸附还可能影响Rf在在0.6-1.0之间的斑点的之间的斑点的分离。分离。在层析过程中发生的在层析过程中发生的边缘效应边缘效应就是由于这种就是由于这种因素引起的。尤其是使用混合溶剂时，极性因素引起的。尤其是使用混合溶剂时，极性较弱和沸点较低的溶剂，在薄层边缘容易挥较弱和沸点较低的溶剂，在薄层边缘容易挥发，使边缘部分的展开剂中极性溶剂的比例发，使边缘部分的展开剂中极性溶剂的比例增大，增大，Rf相对
21、增大。相对增大。同一物质在同一薄层板同一物质在同一薄层板上出现中间部分的上出现中间部分的Rf值比边缘的值比边缘的Rf值小值小，即，即边缘效应，若在展开前先将展开槽与薄层板边缘效应，若在展开前先将展开槽与薄层板用用展开剂蒸气饱和后再展开展开剂蒸气饱和后再展开，边缘效应可消，边缘效应可消失。采用双槽层析缸尤为有利。失。采用双槽层析缸尤为有利。预吸附中预吸附中展开中展开中展开过程中用不同于展开剂的溶剂调节槽内气氛薄层色谱操作薄层色谱操作薄层板制备薄层板制备载板 5cm20cm、10cm20cm、2020cm的2mm厚的玻璃板放在饱和碳酸钠溶液中浸泡数小时，除去玻璃表面的油污。然后充分漂洗干净，干燥，
22、置干燥器中备用。要求光滑、平整、洗净后不附水珠。薄层板涂铺薄层板涂铺要求要求：均匀、平整、无气泡引起：均匀、平整、无气泡引起的凹坑和裂纹。例：的凹坑和裂纹。例：硅胶板（粒度硅胶板（粒度1040um）硅胶硅胶G将硅胶置研钵中，加入少量水，研将硅胶置研钵中，加入少量水，研磨均匀，至无结块和气泡，再加入比例量的水磨均匀，至无结块和气泡，再加入比例量的水(一般为一般为1份固定相与份固定相与3份水份水)，迅速研磨均匀，迅速研磨均匀，立即涂铺。立即涂铺。硅胶或硅胶硅胶或硅胶G以以CMC为黏合剂。配制为黏合剂。配制0.3%0.8%CMC水溶液水溶液,放置过夜放置过夜,使悬浮的使悬浮的纤维沉降纤维沉降,取上层
23、用来配制吸附剂匀浆。取上层用来配制吸附剂匀浆。薄层板活化薄层板活化涂布后的薄层先在室温下阴干，在使用前涂布后的薄层先在室温下阴干，在使用前置适当温度烘烤一定时间进行活化，然后置适当温度烘烤一定时间进行活化，然后置干燥器中备用。不同薄层活化条件略有置干燥器中备用。不同薄层活化条件略有不同，如：不同，如：硅胶硅胶1100.5-1h氧化铝氧化铝11030min点样点样(关键点关键点)要求配制样品的溶剂高度挥发性和尽可能非要求配制样品的溶剂高度挥发性和尽可能非极性，否则易使斑点扩展。极性，否则易使斑点扩展。采用多次点加法，第二次点加时应待前一次采用多次点加法，第二次点加时应待前一次点加的溶剂挥发后再进
24、行。点加的溶剂挥发后再进行。点样量应适中，过载会引起斑点拖尾，分离点样量应适中，过载会引起斑点拖尾，分离度变差，以最小检测量的几倍度变差，以最小检测量的几倍几十倍为宜。几十倍为宜。手工点样工具：定容玻璃毛细管（手工点样工具：定容玻璃毛细管（15ul），），微量注射器。微量注射器。展开展开展开方式：上行展开展开方式：上行展开展开过程：展开过程：展开缸预先用展开剂饱和，平衡系统，展开缸预先用展开剂饱和，平衡系统，薄层板浸入展开剂展开（距边缘薄层板浸入展开剂展开（距边缘0.5-1cm），挥干展开剂），挥干展开剂检测检测物理方法物理方法紫外光下显示荧光或荧光淬灭紫外光下显示荧光或荧光淬灭化学方法化学方
25、法加化学试剂显色，要求显色稳定、加化学试剂显色，要求显色稳定、持久、专属、灵敏。持久、专属、灵敏。定性、定量方法定性、定量方法定性方法定性方法利用保留值利用保留值测定测定Rf值值测定相对测定相对Rf值，即值，即Rx值。值。利用二维色谱（改变色谱条件，比较利用二维色谱（改变色谱条件，比较Rf值是否一值是否一致）致）sb1b2b2sb1sb1b2点样第一次展开第二次展开通过板上化学反应通过板上化学反应反应后生成特征颜色的化合物反应后生成特征颜色的化合物反应后生成复杂的混合物，根据生成物的反应后生成复杂的混合物，根据生成物的“指纹指纹”特征加以鉴定。特征加以鉴定。可用于定性的板上反应有：乙酰化、浓硫
26、酸脱水、可用于定性的板上反应有：乙酰化、浓硫酸脱水、偶氮化、酯化、卤化、酸碱水解、硝化、氧化还偶氮化、酯化、卤化、酸碱水解、硝化、氧化还原、热解和光化学反应等。通过加热、喷雾等方原、热解和光化学反应等。通过加热、喷雾等方法施加反应试剂。法施加反应试剂。通过板上光谱图定性通过板上光谱图定性直接测定薄层板上斑点的紫外或可见吸收光直接测定薄层板上斑点的紫外或可见吸收光谱图，与平行点加的标准斑点的图谱对照。谱图，与平行点加的标准斑点的图谱对照。可建立标准条件下的化合物的光谱图库，用可建立标准条件下的化合物的光谱图库，用计算机检索定性。计算机检索定性。与其他技术连用与其他技术连用TLC-付里叶变换付里叶
27、变换IR联用联用TLC-MS联用联用定量方法定量方法间接定量间接定量将薄层分离后物质斑点定量地洗将薄层分离后物质斑点定量地洗脱下来，再对洗脱液定量。脱下来，再对洗脱液定量。分光光度法、分光光度法、HPLC法、法、GC法、质谱法法、质谱法直接定量直接定量斑点面积测量斑点面积测量用透明纸覆盖在薄层表面，用透明纸覆盖在薄层表面，描出斑点界限，然后测量其面积。描出斑点界限，然后测量其面积。目测法目测法比较系列标准与样品的斑点面积比较系列标准与样品的斑点面积大小、颜色深浅，得到样品的含量范围。大小、颜色深浅，得到样品的含量范围。薄层仪扫描定量薄层仪扫描定量定量计算定量计算归一化法、内标法、外标法归一化法
28、、内标法、外标法方法认证方法认证选择性选择性以分离度表示，当待测组分的以分离度表示，当待测组分的Rf值在值在0.30.7之间，扫描峰拖尾因子在之间，扫描峰拖尾因子在0.91.1之间时可以接受的分离度为之间时可以接受的分离度为R大于等于大于等于1.0稳定性稳定性考察在采样、样品预处理、贮存、考察在采样、样品预处理、贮存、展开，展开后处理等过程中的样品稳定性。展开，展开后处理等过程中的样品稳定性。线性与范围线性与范围相应于待测组分检出量的相应于待测组分检出量的20%-120%范围。范围。灵敏度灵敏度通常以标准曲线的斜率表示。通常以标准曲线的斜率表示。精密度精密度重复性重复性当待测组分的含量达当待测
29、组分的含量达0.5ug/斑点斑点时时,方法的重复性方法的重复性(RSD)应在应在3.0%以内。以内。中间精密度中间精密度多数情况下，多数情况下，RSD应在应在5.0%以内。以内。再现性再现性RSD一般应在一般应在10%以内。以内。检测限检测限定量限定量限准确度准确度高效薄层色谱法（高效薄层色谱法（HPTLC）HPTLC是应用高效薄层板与薄层扫描仪相结是应用高效薄层板与薄层扫描仪相结合的方法，它是在普通合的方法，它是在普通TLC基础上发展起来基础上发展起来的一种更为灵敏、高效、快速、精密、准的一种更为灵敏、高效、快速、精密、准确的色谱分析技术。确的色谱分析技术。高效薄层板高效薄层板一般是使用粒度
30、一般是使用粒度57m的吸附剂，多用高的吸附剂，多用高聚物如聚丙烯酸等为粘合剂，薄层厚度一聚物如聚丙烯酸等为粘合剂，薄层厚度一般为般为0.2，它比普通包层板分离度好、灵敏度高、速它比普通包层板分离度好、灵敏度高、速度快。度快。薄层性能薄层性能吸附颗粒小，流动相展开速率慢，容易达吸附颗粒小，流动相展开速率慢，容易达到平衡，分离效率和测定精度高。到平衡，分离效率和测定精度高。影响因素：吸附剂的粒度、分子扩散系数、影响因素：吸附剂的粒度、分子扩散系数、展开距离和分离组分的展开距离和分离组分的Rf等。等。点样与展开点样与展开展开后所形成的斑点越小而圆，分离效果展开后所形成的斑点越小而圆，分离效果越好。越
31、好。HPTLC是采用自动点样，可调节原是采用自动点样，可调节原点的大小、能控制点样次数、点样间距、点的大小、能控制点样次数、点样间距、点样容器与薄层接触的时间。点样容器与薄层接触的时间。展开方式与展开方式与TLC无甚区别。分为直线展开或无甚区别。分为直线展开或径向展开。径向展开。薄层扫描薄层扫描原理原理薄层定量方法可分为薄层定量方法可分为直接法直接法测定照射光照射色谱后，因被测物斑点测定照射光照射色谱后，因被测物斑点的存在引起的的存在引起的透射光透射光和和反射光反射光的变化。并通过随行的变化。并通过随行标准比较待测斑点的量。标准比较待测斑点的量。间接法间接法将部分照射光的能量转换成较长波长的将
32、部分照射光的能量转换成较长波长的荧光，即荧光，即荧光荧光测量。测量。薄层色谱定量测定的光学方法是基于测量斑点和薄薄层色谱定量测定的光学方法是基于测量斑点和薄层空白处光学响应信号的差值。层空白处光学响应信号的差值。一强度为I的光照射薄层时，被照射的一面为“近表面”，另一面为“远表面”。近表面远表面光（I）镜反射或表面反射Is(表面平滑)漫反射(表面粗糙)入射强度I0 出射强度(IT )IT / I0为薄层为薄层透射率透射率A AT返回光强(IR )IR / I0为介为介 质质的漫反射率的漫反射率A ARI0 -（ IR + IT ）=差为被介质吸收并转换为热的光强光学系统薄层色谱扫描仪光学系统有
33、三种单光束单波长受光源稳定性和薄层质量影响严重。单光束双波长对背景不均匀引起的干扰有补偿作用，选择的两个波长应接近些。双光束单波长可补偿光源不稳引起的误差，但对板层不均匀无作用。光单色器检测器光波长1波长2检测器斩波器光单色器分光镜检测器检测器透射光法透射光法测定组分对应的斑点对测定组分对应的斑点对特定波长光的吸收度来特定波长光的吸收度来确定含量。将薄层板从确定含量。将薄层板从左至右移动，对斑点扫左至右移动，对斑点扫描，单色光透过薄层板描，单色光透过薄层板后被记录下来，将测得后被记录下来，将测得的吸收度对的吸收度对Rf值绘制扫值绘制扫描曲线，得薄层色谱图描曲线，得薄层色谱图光源单色器反射光法反
34、射光法一定波长的光照射薄层，一定波长的光照射薄层，穿进薄层内的光部分被穿进薄层内的光部分被薄层吸收，部分经过漫薄层吸收，部分经过漫反射又折回表面成为反反射又折回表面成为反射光。当对薄层进行扫射光。当对薄层进行扫描时，测量其反射吸收描时，测量其反射吸收度，可得到反射光谱。度，可得到反射光谱。反射吸收度与物质含量反射吸收度与物质含量有确定关系，可进行定有确定关系，可进行定量。量。光源单色器扫描方式扫描方式直线式扫描直线式扫描照射在照射在薄层板上的光束与薄层薄层板上的光束与薄层板作直线相对运动。光板作直线相对运动。光束固定，扫描板台运动。束固定，扫描板台运动。光束落在薄层上的截面光束落在薄层上的截面
35、为一长方形带。为一长方形带。锯齿式扫描锯齿式扫描照射在照射在薄层板上的光束与薄层薄层板上的光束与薄层板的相对运动轨迹呈锯板的相对运动轨迹呈锯齿形或矩形。齿形或矩形。直线扫描锯齿扫描轮廓曲线积分曲线斑点斑点A B CABCCAB对于不规则斑点，两种扫描结果不一样。同一斑对于不规则斑点，两种扫描结果不一样。同一斑点从点从A、B、C三个不同方向扫描，锯齿扫描所得三个不同方向扫描，锯齿扫描所得积分值变动小，而直线扫描所得积分值变动大。积分值变动小，而直线扫描所得积分值变动大。测量方式测量方式吸光度测量吸光度测量测定的是测定的是漫反射光漫反射光。适合于本身有。适合于本身有颜色或有紫外吸收的物质。颜色或有
36、紫外吸收的物质。I0IR 检 测 器荧光测量荧光测量灵敏度较吸光度测量高，板层不吸收发灵敏度较吸光度测量高，板层不吸收发射光，测量噪音小，基线稳定。为消除激发光的影响，射光，测量噪音小，基线稳定。为消除激发光的影响，在板层和检测器之间必须加一块滤光片，以截去反射在板层和检测器之间必须加一块滤光片，以截去反射激发光，只让发射的荧光抵达检测器。激发光，只让发射的荧光抵达检测器。滤光片荧光 检 测 器荧光淬灭测量荧光淬灭测量吸附剂有荧光，样品斑点无荧吸附剂有荧光，样品斑点无荧光，在紫外光照射下，被测物在荧光背景上显示光，在紫外光照射下，被测物在荧光背景上显示出暗灰斑点。本法适合于本身无颜色，又无特征
37、出暗灰斑点。本法适合于本身无颜色，又无特征紫外吸收或荧光的物质。该测量技术有三种形式：紫外吸收或荧光的物质。该测量技术有三种形式：测荧光测紫外光测紫外和荧光扫描仪扫描仪机械扫描仪机械扫描仪可进行吸光度和荧光测量，以可进行吸光度和荧光测量，以反射测量方式为主，也有能提供透射测量方式反射测量方式为主，也有能提供透射测量方式的（主要用于电泳谱图扫描测量）。的（主要用于电泳谱图扫描测量）。高速扫描系统高速扫描系统可分为两类可分为两类光栅扫描系统光栅扫描系统位敏扫描系统位敏扫描系统这类扫描仪技术上一些问题还未解决。这类扫描仪技术上一些问题还未解决。扫描定量中的标准曲线校正扫描定量中的标准曲线校正薄层板上
38、由于光被吸附剂散射，不能得到象薄层板上由于光被吸附剂散射，不能得到象通常溶液测定时的吸光度和浓度之间的简单通常溶液测定时的吸光度和浓度之间的简单直线关系。即物质浓度越大，薄层试样板上直线关系。即物质浓度越大，薄层试样板上测定的反射吸光度比直线关系所示值越低。测定的反射吸光度比直线关系所示值越低。扫描仪系统设计时考虑到这一问题，采用微扫描仪系统设计时考虑到这一问题，采用微机处理使标准曲线直线化。在理论曲线上选机处理使标准曲线直线化。在理论曲线上选择吸光度择吸光度01之间的之间的7个点，将各吸光度值个点，将各吸光度值转换为直线上的值，得到一条通过原点的直转换为直线上的值，得到一条通过原点的直线。线
39、。吸光度1.00物质量经变换后的直线理论曲线直线化方法示意图校正过度校正过度校正适当校正适当校正不足校正不足未校正未校正试样量积分值校正情况判断使用直线化功能时的注意事项发色试样的测定对于没有吸收的试样进行发色测定时，一般不使用直线化功能就可以得到近似的直线关系。试样变质时试样展开后，应马上进行测定，如果放置一星期后再测定。即使近似地呈直线状也往往不能通过原点，认为是试样变质所引起的。展开距离同一试样等量点样，同样展开，展开距离不同将引起误差。展开方法使用直线化功能定量时，为避免展开距离不同产生的误差，实际定量时，将已知浓度的标准品在同一块板上展开是较理想的。应用 药药物物鉴别鉴别采用采用标标准准对对照法照法 杂质检查杂质检查 杂质对杂质对照品法照品法 高低高低浓浓度法度法 药药物物标标准品准品对对照法照法 不允不允许许有有杂质杂质斑点存在，即以方法灵敏度来控制斑点存在，即以方法灵敏度来控制杂杂质质量。量。 含量含量测测定定主要用于中主要用于中药药有效成分的分析有效成分的分析
