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1、第第14章章 原核生物基因的表达及其调控原核生物基因的表达及其调控概 述Thus the differential transcription of different genes largely determines the actions and properties of cells.生命的一个基本现象哪些基因被转录，哪些基因被转录，转录的效率如何。转录的效率如何。mRNA类型，类型，mRNA数量。数量。蛋白质的类型，蛋白质的类型，蛋白质的数量。蛋白质的数量。特定细胞的功特定细胞的功能和属性。能和属性。第一节第一节 原核生物基因的转录和翻译原核生物基因的转录和翻译原核生物的原核生物的DN
2、A： 单个裸露的单个裸露的DNA 不编码占不编码占5% 转录和翻译同一时间、地点进行转录和翻译同一时间、地点进行 转录水平调控为主转录水平调控为主 ，兼有翻译水平调控，兼有翻译水平调控n根据基因表达产物可划分：根据基因表达产物可划分：组成型蛋白：基因表达不受时期、部位、环境组成型蛋白：基因表达不受时期、部位、环境 影响影响组成型表达。组成型表达。调节型蛋白调节型蛋白/适应型蛋白：基因表达受时期、部适应型蛋白：基因表达受时期、部位、环境影响位、环境影响非组成型表达。非组成型表达。n一一种种生生物物的的整整套套遗遗传传密密码码可可以以比比作作一一本本密密码码字字典典,该该种种生生物物的的每每个个细
3、细胞胞中中都都有有这这本本字字典典。为为什什么么基基因因只只有有在在它它应应该该发发挥挥作作用用的的细细胞胞内内和和应应该该发发挥挥作用的时间才能呈现活化状态作用的时间才能呈现活化状态?n结结论论：必必然然有有一一个个基基因因调调控控系系统统在在发发挥挥作作用用。基因调控主要在三个水平上进行基因调控主要在三个水平上进行:. DNA水平水平. 转录水平转录水平. 翻译水平翻译水平一、转录的起始一、转录的起始 转录是原核生物基因表达的主要调控点，主要转录是原核生物基因表达的主要调控点，主要涉及两个方面：涉及两个方面： 1、RNA合成的酶系；合成的酶系； 2、RNA合成起始和终止信号，即合成起始和终
4、止信号，即DNA分子上分子上的特定序列。的特定序列。 通过通过RNA聚合酶、转录因子和启动子的相互作聚合酶、转录因子和启动子的相互作用实现转录调控，改变细胞的表型，从而实现用实现转录调控，改变细胞的表型，从而实现细胞生理状态和环境的变化。细胞生理状态和环境的变化。（一）（一）RNA聚合酶聚合酶(RNA polymerase)： 大肠杆的的大肠杆的的RNA聚合酶：由聚合酶：由5个亚基组成，即个亚基组成，即2，有时还有，有时还有2个个 亚基。以亚基。以2组成的酶称组成的酶称全酶。全酶。 亚基与其他亚基结合较松弛，易从全酶上亚基与其他亚基结合较松弛，易从全酶上解离；其余部分解离；其余部分2称为核心酶
5、称为核心酶(core enzyme)。在大肠杆菌中还发现一种新的在大肠杆菌中还发现一种新的因子，因子，称为称为因子因子，因此将含有因此将含有亚基的全酶称为全酶亚基的全酶称为全酶I，含有，含有亚基的称亚基的称为全酶为全酶。二者的不同在于：全酶。二者的不同在于：全酶可以利用双链可以利用双链DNA为模板合成为模板合成po1yA)。 亚基作用：亚基作用：参与启动子的识别和结合以及转录起始参与启动子的识别和结合以及转录起始复合物的异构化。细胞内哪条复合物的异构化。细胞内哪条DNA链被转录、转录方链被转录、转录方向与转录起点的选择都与向与转录起点的选择都与亚基有关。亚基有关。离体实验表明：离体实验表明：全
6、酶所转录的全酶所转录的RNA和细胞内所转录和细胞内所转录出的出的RNA，其起始点相同，序列相同，若仅用核心酶，其起始点相同，序列相同，若仅用核心酶进行转录，则模扳链和起始点的选择都有很大的随意进行转录，则模扳链和起始点的选择都有很大的随意性，而且往往同一段性，而且往往同一段DNA的两条链都被转录。的两条链都被转录。由此可见：由此可见：亚基对识别亚基对识别DNA链上的转录信号是不链上的转录信号是不可缺少的，它是核心酶和启动子之间的桥梁。可缺少的，它是核心酶和启动子之间的桥梁。 因子因子的取代在细胞发育和对环境应答的反应中起主导作用。的取代在细胞发育和对环境应答的反应中起主导作用。如在枯草杆菌中就
7、有不同相对分子质量的如在枯草杆菌中就有不同相对分子质量的因子因子(P227表表91) 核心酶的核心酶的亚基作用：亚基作用：对对RNA聚合酶的功能至关重聚合酶的功能至关重要，参与要，参与RNA合成、终止信号的识别。由于合成、终止信号的识别。由于亚基与亚基与RNA的前体核昔三磷酸具有很高亲和力，推测它可能的前体核昔三磷酸具有很高亲和力，推测它可能参与底物的结合，以及催化磷酸二酯键的形成。参与底物的结合，以及催化磷酸二酯键的形成。亚基作用：亚基作用：可使聚合酶结合到模板可使聚合酶结合到模板DNA上。上。亚基作用：亚基作用：游离状态，常以二聚体的形式存在，游离状态，常以二聚体的形式存在，参与全酶同启动
8、子的牢固结合。参与全酶同启动子的牢固结合。 RNA聚合酶体积很大，横跨近聚合酶体积很大，横跨近60个碱基，个碱基，而解旋的而解旋的DNA区域可能不到区域可能不到17个碱基。当聚个碱基。当聚合酶按合酶按53方向延伸方向延伸RNA链时，解旋的链时，解旋的DNA区域也随之移动。靠近区域也随之移动。靠近3端的端的DNA不断不断解旋。同时在解旋。同时在5端重新形成端重新形成DNA双链，不断双链，不断将将RNA-DNA杂合链中的杂合链中的RNA链挤出。链挤出。 （二）启动子（二）启动子 (promoter)： 转录的起始是基因表达的关键阶段，启动子就是转录的起始是基因表达的关键阶段，启动子就是连接在基因连
9、接在基因3端上游的端上游的DNA序列，其长度从序列，其长度从100 bp到到200 bp不等，是转录起始时不等，是转录起始时RNA聚合酶识别、聚合酶识别、结合的特定部位，但其本身并不被转录。结合的特定部位，但其本身并不被转录。在启动子与终止子之间是一个转录单位，通常将在启动子与终止子之间是一个转录单位，通常将mRNA开始的一个核苷酸定为开始的一个核苷酸定为o点点(即即+1)。由此向右常。由此向右常称为下游称为下游(downstream)，其核苷酸依次编为正序号；，其核苷酸依次编为正序号；起始点左例称为上游起始点左例称为上游(upstream)，其核苷酸则依次以，其核苷酸则依次以负号表示，紧接起
10、始点左侧的核苷酸为负号表示，紧接起始点左侧的核苷酸为-1。原核生物启动子结构含有同源序列。整个原核生物启动子结构含有同源序列。整个启动子包括两个部分：其上游部分是启动子包括两个部分：其上游部分是CAP-cAMP结合位点，下游部分是结合位点，下游部分是RNA聚合酶聚合酶的进入位点。（的进入位点。（P228-229） Catabolite gene activation protein,CAP,代谢分解物基因激活蛋白二、转录的终止二、转录的终止（一）终止子及其结构：（一）终止子及其结构：1、概念：、概念： DNA上提供转录停止信号的一段序列称上提供转录停止信号的一段序列称为终止子为终止子(term
11、inator)，是一个基因的末端或是一个，是一个基因的末端或是一个操纵子的末端的一段特定序列。操纵子的末端的一段特定序列。2、类型：强终止子和弱终止子、类型：强终止子和弱终止子强终止子：强终止子：不依赖于不依赖于Rho蛋白质辅助因子而能实现终蛋白质辅助因子而能实现终止作用，这类终止子属于强终止子；止作用，这类终止子属于强终止子；弱终止子：弱终止子：依赖于依赖于Rho蛋白糖助因子才能实现终止作蛋白糖助因子才能实现终止作用，这类终止子属于弱终止子。蛋白质辅助因子称为用，这类终止子属于弱终止子。蛋白质辅助因子称为释放因子，通常称为释放因子，通常称为因子。因子。所有原核生物的终止子共同的序列特征：所有
12、原核生物的终止子共同的序列特征： 即在转录终止点之前有一段回文结构，因而所产生即在转录终止点之前有一段回文结构，因而所产生的的mRNA可形成茎环状的发夹结构，它可使可形成茎环状的发夹结构，它可使RNA聚合聚合酶的移动停止或减缓。回文结构中富含酶的移动停止或减缓。回文结构中富含GC对，在回对，在回文序列的下游常有文序列的下游常有68个个AU对，因此这段终止子转对，因此这段终止子转录后形成的录后形成的RNA具有与具有与A相对应的寡聚相对应的寡聚U，是使，是使RNA聚合酶脱离模板的信号。聚合酶脱离模板的信号。依赖子依赖子因子的终止子因子的终止子 其回文序列中其回文序列中GC对含量较少，回文序列下方没
13、有对含量较少，回文序列下方没有固定结构，其固定结构，其AU对含量也较低，因而是弱终止子，对含量也较低，因而是弱终止子，必需有必需有因子存在时才发生终止作用；这也就是说依因子存在时才发生终止作用；这也就是说依赖于赖于因子的终止子由于其茎环结构常较短，在没有因子的终止子由于其茎环结构常较短，在没有因子时这种茎环结构不稳定。即如果没有因子时这种茎环结构不稳定。即如果没有因子存在因子存在RNA聚合酶会继续转录下去，这就称为通读聚合酶会继续转录下去，这就称为通读(read through)，当，当因子存在时，转录才能终止。因子存在时，转录才能终止。 在强终止子中在强终止子中，由于其，由于其DNA模板上富
14、含模板上富含GC而使转录而使转录出的出的RNA上富含上富含C和和G，于是，于是RNA与模板之间可以形与模板之间可以形成较强的氢键，成为成较强的氢键，成为DNARNA杂合分子，从而阻杂合分子，从而阻碍碍DNA聚合酶的前进而有利于终止。聚合酶的前进而有利于终止。（二）（二） 因子辅助终止作用的机理因子辅助终止作用的机理(三)基因表达的极性现象 在正常情况下原核基因表达时，其转录出来的mRNA随即进行翻译，这时整个mRNA都覆盖着核糖体， 因子无法接近mRNA而RNA聚合酶早已越过前面的基因的依赖因子的终止子，所以转录实际上并不停止而是继续转录后续基因。如果在某一基因的依赖于的终止子之前发生无义突变
15、，核糖体便从无义密码子上解离下来，翻译停止，核糖体不再进入到mRNA上无义密码子以后的位置上。于是就可以自由进入RNA并移动，直到赶上停留在终止子上的RNA聚合酶。结果使RNA聚合酶释放，不能再转录下游基因。概念：基因表达的极性现象：概念：基因表达的极性现象：在某些情况下同一在某些情况下同一转录单位里，由于一个基因的无义突变，阻碍了其后转录单位里，由于一个基因的无义突变，阻碍了其后续基因表达的效应就称为基因表达的极性现象。续基因表达的效应就称为基因表达的极性现象。除了无义突变可以导致极性现象外，插入序列除了无义突变可以导致极性现象外，插入序列IS1、IS2等等DNA片段插入到操纵子的基因中也会
16、发生极性片段插入到操纵子的基因中也会发生极性现象。现象。因子也可发生突变，其效应的基本性质是使终止作因子也可发生突变，其效应的基本性质是使终止作用出现故障。突变常可抑制极性效应，这是因为其突用出现故障。突变常可抑制极性效应，这是因为其突变很可能减弱了变很可能减弱了对无义密码子后面的中间终止子的对无义密码子后面的中间终止子的作用，这样翻译的终止并不会使转录也停顿，且远离作用，这样翻译的终止并不会使转录也停顿，且远离无义突变的无义突变的DNA区段还可以被重新覆盖的核糖体继续区段还可以被重新覆盖的核糖体继续翻译翻译(四四)抗终止作用抗终止作用 因子的作用可以被抗终止因子所抵消，这样，因子的作用可以被
17、抗终止因子所抵消，这样，RNA聚合酶便可通过终止子聚合酶便可通过终止子(依赖于依赖于因子的因子的)继继续转录后面的基因。这种现象称为抗终止作用续转录后面的基因。这种现象称为抗终止作用(anti一一termination)。抗终止作用最有代表性的例子见于抗终止作用最有代表性的例子见于噬菌体的时序控噬菌体的时序控制。制。噬菌体基因在裂解过程中的表达分前早期、晚噬菌体基因在裂解过程中的表达分前早期、晚早期和晚期早期和晚期3个阶段进行，其早期基因与晚期基因以个阶段进行，其早期基因与晚期基因以终止子相隔。终止子相隔。噬菌体侵入敏感细胞，首先借助宿主噬菌体侵入敏感细胞，首先借助宿主的的RNA聚合酶转录前早
18、期基因，由此获得的表达产物聚合酶转录前早期基因，由此获得的表达产物N蛋白是一种抗终止因子，它与蛋白是一种抗终止因子，它与RNA聚合酶作用使后聚合酶作用使后者越过左右两个终止子继续转录，实现晚早期基因表者越过左右两个终止子继续转录，实现晚早期基因表达。达。 三、原核生物三、原核生物RNA的加工的加工(P233-235)四、四、SD序列与翻译效率序列与翻译效率核糖体结合保护降解法：测定核糖体结合保护降解法：测定mRNA 上核糖体起始蛋上核糖体起始蛋白质合成的部位。在抑制多肽链伸长的条件下，当翻白质合成的部位。在抑制多肽链伸长的条件下，当翻译起始时，核糖体与译起始时，核糖体与mRNA的结合位点已形成
19、稳定的的结合位点已形成稳定的复合体，于是加入核酸酶使未与核糖体结合的复合体，于是加入核酸酶使未与核糖体结合的 mRNA的区段降解，而有核糖体结合区域则受到保护。的区段降解，而有核糖体结合区域则受到保护。在细菌中受核糖体保护的起始序列约在细菌中受核糖体保护的起始序列约3540个碱基长，个碱基长，其中包含起始密码子其中包含起始密码子AUG。在起始密码子上游约。在起始密码子上游约47个核苷酸之前还有一段富含嘌吟的个核苷酸之前还有一段富含嘌吟的5AGGAGG3短小序列，它可以与短小序列，它可以与16S rRNA3端的端的 3UCCUCC5区段完全互补。区段完全互补。mRNA上的这段序上的这段序列称为列
20、称为 Shine Dalgarno 序列（简称序列（简称SD序列）。序列）。 SD序列与序列与16S rRNA序列互补的程度以及从序列互补的程度以及从起始密码子起始密码子AUG到嘌呤片段的距离也都强烈地到嘌呤片段的距离也都强烈地影响翻译起始的效率。不同基因的影响翻译起始的效率。不同基因的mRNA有不有不同的同的SD序列，它们与序列，它们与16S rRNA的结合能力也的结合能力也不同，从而控制着单位时间内翻译过程中起始不同，从而控制着单位时间内翻译过程中起始复合物形成的数目，最终控制着翻译的速度。复合物形成的数目，最终控制着翻译的速度。第二节第二节 大肠杆菌乳糖操纵子的正负调控大肠杆菌乳糖操纵子
21、的正负调控一、操纵子与操纵子模型一、操纵子与操纵子模型操纵子学说操纵子学说/操纵子模型：操纵子模型： F.Jacob、 J.Mond（1960）E.coli lac operon( 1965诺贝尔医学诺贝尔医学生理学奖生理学奖)操纵子：核酸分子上调控基因转录活性的基本单元，操纵子：核酸分子上调控基因转录活性的基本单元，由结构基因、操作子（由结构基因、操作子（O）和启动子（）和启动子（P）组成。）组成。 转录、翻译、合成蛋白转录、翻译、合成蛋白 结合调节蛋白结合调节蛋白 结合结合RNA聚合酶聚合酶 promoter structural genes operator启动基因启动基因 操纵基因操纵
22、基因 结构基因结构基因操纵子操纵子(operon)(operon)模型模型调控（节）蛋白调控（节）蛋白 操纵子操纵子RNARPO structural genesDNAProtein 正调控（正调控（正调控（正调控（positive positive regulation)regulation) 负调控负调控负调控负调控 (negative (negative regulation)regulation)调控蛋白的作用机制注：注：R R：Regulator PRegulator P：Promoter OPromoter O：OperatorOperator 正调控系统中的正调控蛋白又被称为无辅
23、基诱导蛋白（正调控系统中的正调控蛋白又被称为无辅基诱导蛋白（apoinducer)apoinducer) 负调控系统中的负调控蛋白又被称为阻遏蛋白（负调控系统中的负调控蛋白又被称为阻遏蛋白（repressor)repressor)二、正调控与负调控二、正调控与负调控调节基因调节基因 RNA 调节蛋白调节蛋白 正调节蛋白正调节蛋白+操作子操作子 结构基因转录、表达结构基因转录、表达 基因失活，结构基因不表达基因失活，结构基因不表达 （正控制（正控制/正调节正调节 ） 负调节蛋白负调节蛋白+操作子操作子 结构基因转录、表达结构基因转录、表达 基因失活，结构基因组成型表达基因失活，结构基因组成型表达
24、 （负控制（负控制/负调节负调节 ）根据调节蛋白基因突变失活所产生的后果，可分：根据调节蛋白基因突变失活所产生的后果，可分： 隐性的组成型表达隐性的组成型表达负控制系统负控制系统 结构基因处于不可诱导状态结构基因处于不可诱导状态正控制系统正控制系统 根据辅因子（小分子）结合后调控效果，可分：根据辅因子（小分子）结合后调控效果，可分： 开启调控系统中结构基因的转录活性开启调控系统中结构基因的转录活性 诱导诱导 关闭调控系统中结构基因的转录活性关闭调控系统中结构基因的转录活性 阻遏阻遏 操纵子调控系统的基本类型v可诱导负控制系统v可诱导正控制系统v可阻遏负控制系统v可阻遏正控制系统正调控与负调控并
25、非互相排斥的两种机制，而正调控与负调控并非互相排斥的两种机制，而是生物体适应环境的需要，有的系统既有正调是生物体适应环境的需要，有的系统既有正调控又有负调控；控又有负调控；原核生物以负调控为主，真核生物以正调原核生物以负调控为主，真核生物以正调控为主；控为主；降解代谢途径中既有正调控又有负调控；降解代谢途径中既有正调控又有负调控；合成代谢途径中一般以负调控来控制产物自身合成代谢途径中一般以负调控来控制产物自身的合成。的合成。如：大肠杆菌乳糖代谢的调控需要三种酶参加如：大肠杆菌乳糖代谢的调控需要三种酶参加:. -半乳糖酶：将乳糖分解成半乳糖和葡萄糖半乳糖酶：将乳糖分解成半乳糖和葡萄糖. 渗透酶：
26、增加糖的渗透，易于摄取乳糖和半乳糖渗透酶：增加糖的渗透，易于摄取乳糖和半乳糖. 转乙酰酶：转乙酰酶：-半乳糖转变成乙酰半乳糖半乳糖转变成乙酰半乳糖大大量量乳乳糖糖时时：大大肠肠杆杆菌菌三三种种酶酶的的数数量量急急剧剧增增加加，几几分分钟即可达到千倍以上，这三种酶能够成比例地增加钟即可达到千倍以上，这三种酶能够成比例地增加.乳糖消耗完：这三种酶的合成也即同时停止乳糖消耗完：这三种酶的合成也即同时停止.三、细菌的乳糖代谢三、细菌的乳糖代谢可诱导系统可诱导系统1. 乳糖操纵子的负调控（乳糖操纵子的负调控（negative control）从从1946年起及随后的年起及随后的10年，年，Jacques
27、 Monod、Joshua Lederberg、Francois Jacob以及以及Andre Lwoff 对乳糖代谢的遗传学和生物化对乳糖代谢的遗传学和生物化学进行了系统的研究。学进行了系统的研究。（1）乳糖代谢的可诱导性（）乳糖代谢的可诱导性（induciable）当培养基中有当培养基中有葡萄糖葡萄糖（glucose）时，细菌中）时，细菌中代谢代谢半乳糖半乳糖（galactose）的酶非常少。）的酶非常少。（2）乳糖代谢系统的基因组成乳糖（乳糖（lactose）既是底物（）既是底物（substrate）又起到了诱导物（又起到了诱导物（inducer）的作用。）的作用。 乳糖操纵子（乳糖操纵
28、子（lac operon）当培养基中有乳糖（当培养基中有乳糖（lactose），而无葡萄糖时，），而无葡萄糖时，细菌中专门代谢乳糖的酶类就迅速增加。细菌中专门代谢乳糖的酶类就迅速增加。Joshua Lederberg为了研究乳糖代谢的为了研究乳糖代谢的三个酶的基因，分离了大量的突变体三个酶的基因，分离了大量的突变体（lac -），并经过遗传作图发现它们是），并经过遗传作图发现它们是紧密连锁的：紧密连锁的：Z-Y-A同时发现它们是被同时诱导转录的。同时发现它们是被同时诱导转录的。操纵子（operon）：与乳糖代谢有关的几个酶的基因成簇与乳糖代谢有关的几个酶的基因成簇（cluster）排列，形成一
29、个共同的调节）排列，形成一个共同的调节单位单位操纵子。操纵子。由由结构基因结构基因（structural genes）和上游相）和上游相邻的邻的控制区控制区（regulatory region）组成。）组成。lacZ：编码编码 -半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（ -galactosidase）四聚体，分解乳糖。四聚体，分解乳糖。i）结构基因（structural genes）乳糖乳糖半乳糖半乳糖+葡萄糖葡萄糖 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶lacY：编码编码 -半乳糖苷透性酶（半乳糖苷透性酶（permeasae）。）。膜蛋白，将半乳糖转运到细胞中。膜蛋白，将半乳糖转运到细胞中。lacA：编码编码 -半乳糖苷乙
30、酰转移酶半乳糖苷乙酰转移酶（transacetylase）。）。把乙酰辅酶把乙酰辅酶A上的乙酰基转移到上的乙酰基转移到 -半乳半乳糖苷上。糖苷上。二聚体。二聚体。ii）控制区乳糖是如何诱导相关的酶合成的？乳糖是如何诱导相关的酶合成的？a. 安慰诱导物（安慰诱导物（gratuitous inducer）IPTG（isopropylthiogalactoside）是乳）是乳糖的类似物，能诱导乳糖代谢酶合成，糖的类似物，能诱导乳糖代谢酶合成，但不会被分解。但不会被分解。IPTG的发现说明：诱导并不一定需要乳糖。的发现说明：诱导并不一定需要乳糖。没有乳糖，代谢酶照样合成（不需要诱导）。没有乳糖，代谢酶
31、照样合成（不需要诱导）。遗传作图发现：遗传作图发现：这种突变（这种突变（lacOc）的基因紧密连锁在）的基因紧密连锁在结构基因的上游（结构基因的上游（operator region）。）。另一个组成型突变（另一个组成型突变（lacI-）作图的结果）作图的结果是在离结构基因不远处。是在离结构基因不远处。b. 组成型突变（constitutive mutants）（3）操纵子模型（Operon Model）1960年，年，Jacob和和Monod提出了操纵子模提出了操纵子模型，说明乳糖诱导代谢是一个负控制型，说明乳糖诱导代谢是一个负控制（negative control）。）。获获1965年年No
32、bel生理学和医学奖生理学和医学奖操纵子模型对乳糖诱导效应的解释i） 要点：要点：lacI 编码了一个编码了一个阻遏物阻遏物（repressor），与），与结构基因附近的一个结构基因附近的一个“假想假想”位置（命名为位置（命名为operator site）结合（）结合（binding），抑制了），抑制了结构基因的启动子（结构基因的启动子（promotor），从而抑），从而抑制结构基因的转录。制结构基因的转录。该阻遏物能变构（该阻遏物能变构（allosteric）。即它还能）。即它还能与乳糖结合，改变构像而丧失了与与乳糖结合，改变构像而丧失了与operator DNA结合的能力，结构基因才能结合
33、的能力，结构基因才能够转录表达。够转录表达。ii）操纵子的组分实际上，真正的诱导物是乳糖的异构体实际上，真正的诱导物是乳糖的异构体（isomer）异乳糖（异乳糖（allolactose）。）。iii）操纵子的工作过程iv）组成型突变lacOclacI-动画演示Lac操乳糖操纵子操乳糖操纵子.avi纵子纵子Lac操纵子操纵子O突变突变Lac操纵子操纵子I突变突变Lac操纵子操纵子I超突变超突变对模型的遗传学验证根据操纵子模型的原理，可以预测：根据操纵子模型的原理，可以预测：i）模型预测）模型预测a. lacI基因产物是个可扩散的基因产物是个可扩散的（diffusible）蛋白。）蛋白。b. O区
34、（区（operator region）在调节过程中）在调节过程中起作用，但不编码产物。起作用，但不编码产物。c. O区必须紧靠结构基因。区必须紧靠结构基因。ii）PaJaMo实验验证Pardee、Jacob、Monod设计了历史性的设计了历史性的实验来检验他们的模型的预测是否正确。实验来检验他们的模型的预测是否正确。a. 实验原理实验原理大肠杆菌的大肠杆菌的F因子（因子（F factor）转化。）转化。F 因子是因子是E.coli 的一种质粒（的一种质粒（plasmid）。）。F+菌株菌株能通过结合（能通过结合（conjugation）把它的）把它的F 因子传给因子传给F- 细胞。并且还能把染
35、色体的部分细胞。并且还能把染色体的部分DNA也带过去。也带过去。b. 实验过程通过通过F因子，给因子，给lacI-或或lacOc的突变菌输入野的突变菌输入野生型生型lacI或或lacO基因，观察其对基因，观察其对 -半乳糖苷半乳糖苷酶活性的影响。酶活性的影响。实验实验1：组成型突变组成型突变lacI- lacZ+F菌株菌株F lacI+ lacZ-乳糖诱导型菌乳糖诱导型菌说明说明F菌株的菌株的lacI+能弥补原菌株的能弥补原菌株的lacI-缺陷。缺陷。即：即：lacI对对lacZ是反式作用（是反式作用（trans-acting）。）。组成型突变组成型突变lacI+ lacOc lacZ+F菌株
36、菌株F lacI+lacO+ lacZ-组成型表达组成型表达实验2：说明说明F菌株的菌株的lacO+不能弥补原菌株的不能弥补原菌株的lacOc缺陷。缺陷。即：即：lacO对对lacZ是顺式作用（是顺式作用（cis-acting）。）。实验3lacI超突变（超突变（lacIs）编码的阻遏物不能与乳糖）编码的阻遏物不能与乳糖结合，所以总是结合在结合，所以总是结合在O区的区的DNA上，使上，使lacZ不能表达。不能表达。野生型野生型lacI+ lacZ+F菌株超突变菌株超突变F lacIs lacZ+组成型不表达组成型不表达说明超突变说明超突变lacIs 编码的阻遏物能作用于野编码的阻遏物能作用于野
37、生型菌操纵子的生型菌操纵子的O区。区。利用超突变：利用超突变：（4）操纵子模型的意义Jacob和和Monod1961年发表的操纵子理论年发表的操纵子理论是遗传学的的一个里程碑（是遗传学的的一个里程碑（landmark）。）。 他们所做的酶活性诱导测定对当他们所做的酶活性诱导测定对当时的生物化学同行来说都是个难题。时的生物化学同行来说都是个难题。用遗传分析结果推论出分子生物学模型。用遗传分析结果推论出分子生物学模型。提出了蛋白质与提出了蛋白质与DNADNA结合的概念。结合的概念。描述了描述了“阻遏物阻遏物”的调节因子概念（尽的调节因子概念（尽管并不知道它是蛋白质还是管并不知道它是蛋白质还是RNA
38、RNA）。）。当时人们刚知道当时人们刚知道mRNA，对转录的细节一，对转录的细节一无所知。无所知。（5）阻遏物的分离和鉴定阻遏物的含量极少，每细胞不超过阻遏物的含量极少，每细胞不超过10份。份。直到直到1966年，年，Walter Gilbert和和Benno Muller-Hill从从lacI的超量突变菌株中，利的超量突变菌株中，利用透析（用透析（dialysis）的方法，通过）的方法，通过IPTG与阻遏物的结合作用，分离到了这个蛋与阻遏物的结合作用，分离到了这个蛋白质。白质。Gilbert及其同事又用放射自显影证明它及其同事又用放射自显影证明它能与能与lacO DNA结合。结合。 分离分离
39、鉴定鉴定放射性标记的阻遏物能与野生型O区结合放射性标记的阻遏物不能与突变型O区结合Lac 阻遏物的空间结构两个两个binding domian:四聚体聚合区四聚体聚合区CN一个四聚一个四聚体聚合区体聚合区阻遏物与DNA的结合i）电镜观察）电镜观察Lac repressorii）X-ray分析两个单体结合在一个完整的两个单体结合在一个完整的lacO区；区；四聚体可以结合两个四聚体可以结合两个lacO。iii）DNA测序分析阻遏物所结合的阻遏物所结合的DNA有有26bp（-5 +21）。）。位于位于RNA多聚酶结合部位的下游内部。多聚酶结合部位的下游内部。GTGGAATTGTGAGCGGATAAC
40、AATTTATGmRNAproteinRNA pol binding siterepressor binding site对称轴对称轴2. 乳糖操纵子的正调控（positive control）Jacob-Monod 模型没能回答一个关键性模型没能回答一个关键性的问题：的问题：为什么为什么E.coli 在既含有葡萄糖（在既含有葡萄糖（glucose）又）又含有乳糖的（含有乳糖的（lactose）的培养基（）的培养基（medium）中中不不启动启动lac 操纵子的转录？操纵子的转录？Answers to this question emerged from molecular studies c
41、arried out long after publication of the operon theory.（1）正调控因子（positive regulator）在有些启动子上，在有些启动子上，RNA pol结合后并不能结合后并不能启动转录。必须一个激活因子（正调节因启动转录。必须一个激活因子（正调节因子）的帮助才能打开子）的帮助才能打开DNA双链。双链。CAP（cAMP activator protein）是）是lac operon的正调节因子。的正调节因子。（2）CAP的作用原理的作用原理 cAMP与与CAP结合，结合，激活激活CAP与与lacP DNA结合。结合。 CAP与与DNA结
42、合后增加了结合后增加了RNA pol与与DNA结合，增加转录结构基因的能力。结合，增加转录结构基因的能力。 cAMP是由是由ATP经过腺苷酸环化酶经过腺苷酸环化酶（Adenyl cyclase）的作用形成。）的作用形成。葡萄糖葡萄糖抑制抑制腺苷酸环化酶的活性。腺苷酸环化酶的活性。ATPcAMPAdenyl cyclaseCAP-cAMP系统在半乳糖和阿拉伯糖操纵系统在半乳糖和阿拉伯糖操纵子中也起作用。子中也起作用。从而间接地抑制了从而间接地抑制了Lac操纵子的转录。操纵子的转录。（3）CAP与DNA的结合lac操纵子中，操纵子中，CAP结合位点位于结合位点位于RNA pol结合位点的上游（结合
43、位点的上游（-22bp）。）。结合部位位置结合部位位置不同的操纵子中，不同的操纵子中，CAP的结合位置不同。的结合位置不同。operator CAP promotor 结构基因结构基因半乳糖半乳糖乳糖乳糖阿拉阿拉伯糖伯糖结构基因结构基因operatorpromotorCAP operator CAP promotor结构基因结构基因以二聚体形式与以二聚体形式与DNA结结合。使合。使DNA弯曲弯曲90度。度。结合形式TGTGAGTTAGCTCACACACTCAATCGAGTG结合处DNA的保守序列回文顺序每一部分结合一个每一部分结合一个CAP。第三节第三节 其他类型的操纵子其他类型的操纵子一、具
44、有双启动子的半乳糖操纵子半乳糖（gal)操纵子组成：2个互相重叠的启动子gal P1 和gal P2 、3个操作子（CAP位点、2个阻遏蛋白位点(galOe、galOi）、3个结构基因）gal P1 依赖cAMP-CAP 转录始于S1 gal P2 阻遏蛋白调节开启 转录始于S2 位于CAP位点内位于galE内乳糖代谢需要三种酶：半乳糖激酶（galactokinase,gal K）半乳糖转移酶（galactose transferase, Gal T）半乳糖差向异构酶（galactose epimerase, gal E）正控制可诱导系统（第一系统）： gal P1、cAMP-CAP复合物、c
45、AMP-CAP位点 S1无葡萄糖时：ATP cAMP cAMP -CAP复合物 结合CAP 有葡萄糖时：系统关闭 负控制可诱导系统（第二系统）： galP2、阻遏蛋白-半乳糖复合物、 galOe、 galOi S2 无半乳糖：阻遏蛋白结合操作子阻遏 有半乳糖：复合物构象改变开启（从S2开始转录）CAP位点激活gal 操纵子，转录从S1开始，结构基因表达galE galT galKP2S1P1S2a.半乳糖操纵子结构示意图galE galT galKP2S1P1S2b.只有GcAMP-CAP galactose repressor 双启动子的半乳糖操纵子乳糖操纵子galE galT galKP2
46、S1P1S2c.只有GalgalE galT galKP2S1P1S2c. 有Gal有GcAMP-CAPgalOegalOe、galOigalOi 有G，有gal：1.阻遏 2.诱导 无G，无gal： 1.诱导 2.阻遏：cAMP- CAP与阻遏蛋白竞争 无G，有gal：1.诱导 2.诱导：高水平表达 有G，无gal：1.阻遏 2.阻遏二、阿拉伯糖操纵子的双向控制Ara操纵子是控制分解代谢途径的另一调控系统。特点特点：调节蛋白既可起正调控作用，又可起负调 控作用。组成组成： araC基因编码调节蛋白基因编码调节蛋白AraC蛋白；蛋白； ：O1不参与调控；不参与调控；O2 ：AraC蛋白负调蛋白
47、负调 控结合位控结合位点；点； ：调节位点，：调节位点，CAP-cAmP复合物结合位点，复合物结合位点，AraC蛋白正调控结合位点。蛋白正调控结合位点。调控：调控：. 诱导物阿拉伯糖和诱导物阿拉伯糖和cAMP同时存在：同时存在： Ara与与AraC蛋白复合物结合在位点，蛋白复合物结合在位点， CAP-cAmp复合物结合复合物结合I位点，基因转录开启；位点，基因转录开启；. 在没有诱导物阿拉伯糖和在没有诱导物阿拉伯糖和cAMP时：时： AraC蛋白同时与蛋白同时与I和和 O2结合，结合，DNA构型发生改构型发生改变，形成一个紧密的环结构，抑制表达。变，形成一个紧密的环结构，抑制表达。三、色氨酸操
48、纵子的转录调控及衰减作用三、色氨酸操纵子的转录调控及衰减作用 1色氨酸操纵子模型：色氨酸操纵子模型：由雅各布（由雅各布（Jacob F.）和莫诺（）和莫诺（Monod J.）提）提出，具有合成代谢途径典型的操纵子模型。出，具有合成代谢途径典型的操纵子模型。操纵子：包括色氨酸合成有关的操纵子：包括色氨酸合成有关的5种酶的结构基种酶的结构基因；因；大量色氨酸时：大肠杆菌大量色氨酸时：大肠杆菌5种酶的转录同时受到种酶的转录同时受到抑制；抑制；色氨酸不足时：这种酶的基因开始转转录；色氨酸不足时：这种酶的基因开始转转录；色氨酸：作为阻遏物而不是诱导物参与调控结构色氨酸：作为阻遏物而不是诱导物参与调控结构
49、基因的转录。基因的转录。 trp操纵子是一个典型的可阻遏操纵元模型操纵子是一个典型的可阻遏操纵元模型(repressible operon)。三、细菌的色氨酸代谢的调控1953年，年，Monod和同事们发现了一个可和同事们发现了一个可抑制型操纵子（抑制型操纵子（repressible operon）。）。WT E.coli酶酶tryptophan合成合成tryptophan但当培养基中有足够量的色氨酸时，细菌但当培养基中有足够量的色氨酸时，细菌不再产生合成色氨酸所需要的酶类。不再产生合成色氨酸所需要的酶类。野生型细菌能表达合成氨基酸和其它野生型细菌能表达合成氨基酸和其它生物大分子的酶。生物大分
50、子的酶。1. 色氨酸合成代谢的基因和酶类与色氨酸合成相关的基因有与色氨酸合成相关的基因有5个，编码个，编码3个酶：个酶：trpA：色氨酸合成酶的：色氨酸合成酶的 亚基亚基trpB：色氨酸合成酶的：色氨酸合成酶的 亚基亚基trpC：吲哚甘油磷酸合成酶吲哚甘油磷酸合成酶trpD：邻氨基苯甲酸合成酶组分邻氨基苯甲酸合成酶组分trpE：邻氨基苯甲酸合成酶组分邻氨基苯甲酸合成酶组分2. 色氨酸合成的生化途径邻氨基苯甲邻氨基苯甲酸合成酶酸合成酶吲哚甘油吲哚甘油磷酸合成酶磷酸合成酶色氨酸色氨酸合成酶合成酶邻氨基邻氨基苯甲酸苯甲酸磷酸核糖基磷酸核糖基邻氨基苯甲酸邻氨基苯甲酸CDRP吲哚甘吲哚甘油油-磷酸磷酸色
51、氨酸色氨酸分支酸分支酸3. 色氨酸操纵子（trp operon）attenuator：衰减子：衰减子4. 色氨酸操纵子的调节模型Jacob和和Monod提出了一个与乳糖操纵提出了一个与乳糖操纵子相似的模型，解释色氨酸合成的抑制子相似的模型，解释色氨酸合成的抑制作用。作用。关键：关键：认为存在一个在正常情况下无活性的阻认为存在一个在正常情况下无活性的阻遏物（遏物（normally inactive repressor），单），单独状态下不能与独状态下不能与operator结合。结合。但它能与色氨酸结合后改变构像，才能但它能与色氨酸结合后改变构像，才能与与operator DNA结合，抑制转录。结
52、合，抑制转录。色氨酸操纵子模型结构：色氨酸操纵子模型结构：5种结构基因：种结构基因：trpE、D、C、B、A；调控结构：启动子、操纵子、前导序列、调控结构：启动子、操纵子、前导序列、弱化子；弱化子；阻遏物阻遏物trpR基因：与基因：与trp操纵子相距较远；操纵子相距较远；2.色氨酸操纵子的负调控：色氨酸操纵子的负调控： . 阻遏调控：阻遏调控：trpR基因编码无辅基阻遏物基因编码无辅基阻遏物 与色氨酸与色氨酸结合结合 形成有活性的色氨酸阻遏物形成有活性的色氨酸阻遏物 与操作与操作子结合子结合 阻止转录；阻止转录；色氨酸不足：阻遏物三维空间结构发生变色氨酸不足：阻遏物三维空间结构发生变化化 ，不
53、能与操作子结合，操纵元开始转录；，不能与操作子结合，操纵元开始转录；色氨酸浓度升高：色氨酸与阻遏物结合，色氨酸浓度升高：色氨酸与阻遏物结合，空间结构发生变化，可与操作子结合，阻止转空间结构发生变化，可与操作子结合，阻止转录。录。trp与与repressor结结合后，使合后，使repressor的结构稍稍张开，的结构稍稍张开，能够结合到能够结合到DNA的沟里。的沟里。动画演示Trp操纵色氨酸操纵子操纵色氨酸操纵子.avi子子5. 色氨酸操纵子的衰减（attenuation）调节(1)(1)Charles Yanofsky及其同事们的观察及其同事们的观察Yanofsky、Bertrand等在分析等
54、在分析trp 操纵子转操纵子转录的实验中发现：录的实验中发现：在有高浓度色氨酸的情况下，一般只转录在有高浓度色氨酸的情况下，一般只转录一段一段140bp短序列短序列mRNA（并非一点都不转（并非一点都不转录），在转录到结构基因前被中止了录），在转录到结构基因前被中止了衰减。衰减。在无色氨酸或低浓度色氨酸时，能一直转在无色氨酸或低浓度色氨酸时，能一直转录出完整的录出完整的mRNA。（2）衰减原理在第一个结构基因在第一个结构基因trpE与操纵区与操纵区trpO之间之间有一段有一段162bp的的DNA。Yanofsky等提出一个衰减模型：等提出一个衰减模型：关键：前导序列关键：前导序列mRNA的二级
55、结构。的二级结构。 前导序列（前导序列（leader sequence）trpL 茎环结构（hairpin structure）前导序列的转录物内部有前导序列的转录物内部有4个配对区，彼此个配对区，彼此都能配对都能配对:1区区2区配对、区配对、3区区4区配对，能形成两个茎环区配对，能形成两个茎环结构。结构。第二个茎环后紧接寡聚第二个茎环后紧接寡聚U，类似于转录终止，类似于转录终止信号。信号。3-4区配对形成类似与内终止子的结构。如果如果2区和区和3区配对，两个茎环变换成另外区配对，两个茎环变换成另外一个茎环结构。第二个茎环不能形成，不一个茎环结构。第二个茎环不能形成，不再成为转录终止信号。再成
56、为转录终止信号。 茎环变换前导顺序的前导顺序的+5060bp有有2个连续的色氨酸密个连续的色氨酸密码子（码子（UGGUGG）。）。 连续的色氨酸密码和终止密码下游下游+70处有一个终止密码处有一个终止密码UAG。GGU UGG UGG CGC ACU UCC UGA AA506070Trpstop1区区核糖体占据空间包含了核糖体占据空间包含了1区区当细胞中色氨酸水平很低时由于缺乏由于缺乏trp-tRNAtrp，核糖体会在色氨酸密，核糖体会在色氨酸密码处此延滞（码处此延滞（stalling）。）。核糖体占据了第一个茎环，在核糖体占据了第一个茎环，在4区转录前，区转录前，2区与区与3区就已经配对，
57、形成一个茎环。转区就已经配对，形成一个茎环。转录出的录出的4区呈单链状态，下游的结构基因区呈单链状态，下游的结构基因得以转录。得以转录。细菌核糖体能占据细菌核糖体能占据30-35nt mRNA。当色氨酸充足时：后一个茎环的结构起到转录终止信号作用，后一个茎环的结构起到转录终止信号作用，转录提前终止转录提前终止衰减。衰减。核糖体顺利通过色氨酸密码，但停在核糖体顺利通过色氨酸密码，但停在1区区和和2区之间的终止密码区之间的终止密码UAG上，占据了上，占据了1区和区和2区的部分区域，区的部分区域，3区与区与4区配对，能区配对，能形成后一个茎环。形成后一个茎环。色氨酸在色氨酸在E.coli的蛋白质中属
58、于稀有氨基酸。的蛋白质中属于稀有氨基酸。衰减只能允许衰减只能允许10%的的RNA pol继续前进。继续前进。动画演示色氨酸操纵子的衰减作用色氨酸操纵子的衰减作用三、其他操纵子的衰减现象性苏氨酸（苏氨酸（threonine）、组氨酸（）、组氨酸（histidine）、）、亮氨酸（亮氨酸（leucine）、苯丙氨酸）、苯丙氨酸（phenylalannine）操纵子都有类似的）操纵子都有类似的leader sequence作衰减控制区域。作衰减控制区域。由于需要核糖体同时配合，衰减调控只有在由于需要核糖体同时配合，衰减调控只有在原核细胞中才能发生。但也是个普遍现象。原核细胞中才能发生。但也是个普遍现
59、象。. 弱化子调控：弱化子调控：当有色氨酸存在而当有色氨酸存在而trp操纵子受抑制时，仍有一操纵子受抑制时，仍有一段前导序列发生转录，可能存在另一种的机制来抑制段前导序列发生转录，可能存在另一种的机制来抑制trp操纵元的转录。操纵元的转录。色氨酸高浓度存在时，转录的前导序列色氨酸高浓度存在时，转录的前导序列140bp长，长，其中有一其中有一28bp的弱化子区域；形成发夹结构，为内的弱化子区域；形成发夹结构，为内部终止子，部终止子，RNA酶从酶从DNA上脱落，不能转录；上脱落，不能转录；色氨酸低浓度或不存在时，色氨酸低浓度或不存在时，RNA聚合酶能通过弱聚合酶能通过弱化子区域，转录完整的多顺反子
60、化子区域，转录完整的多顺反子mRNA序列；序列；问题：弱化子如何进行调控？问题：弱化子如何进行调控？前前导导序序列列可可翻翻译译出出一一段段14个个氨氨基基酸酸的的短短肽肽，在在该该短短肽肽的的第第10、11位位置置上上是是两两个个色色氨氨酸酸密密码码子子；两两个个密密码码子子之之后后是是一一段段mRNA序序列列，该该序序列列可可分分为为四四个个区区段段，区区段间可互补配对，形成不同的二级结构。段间可互补配对，形成不同的二级结构。原核生物为边转录边翻译，前导序列中核糖体位置决原核生物为边转录边翻译，前导序列中核糖体位置决定形成哪种二级结构定形成哪种二级结构,从而决定弱化子是否可形成终止从而决定
61、弱化子是否可形成终止信号。信号。. 当有色氨酸时，完整翻译短肽当有色氨酸时，完整翻译短肽 核糖体停留核糖体停留在终止密码子处，邻近区段在终止密码子处，邻近区段2位置位置 阻碍了阻碍了2,3配配对对 使使3, 4区段配对区段配对 形成发夹结构终止子形成发夹结构终止子 RNA酶在弱化子处终止，不能向前移动。酶在弱化子处终止，不能向前移动。.如缺乏色氨酸，核糖体到达色氨酸密码子时如缺乏色氨酸，核糖体到达色氨酸密码子时 由于没由于没有色氨酰有色氨酰tRNA的供应的供应 停留在该密码子位置，位于区段停留在该密码子位置，位于区段1 使区段使区段2与区段与区段3配对配对 区段区段4无对应序列配对呈单无对应序
62、列配对呈单链状态链状态 RNA聚合酶通过弱化子，继续向前移动，转录聚合酶通过弱化子，继续向前移动，转录出完整的多顺反子序列。出完整的多顺反子序列。衰减作用的生物学意义衰减作用的生物学意义 从衰减机制的分析来看，它不仅能够把几种水平如从衰减机制的分析来看，它不仅能够把几种水平如DNA和和RNA的构象变化、的构象变化、mRNA上内部终止上内部终止(衰减衰减)子的重建以及核糖体上子的重建以及核糖体上tRNA对终止密码的识别等统对终止密码的识别等统一起来，严格控制表达，而且衰减子还可依细胞内一起来，严格控制表达，而且衰减子还可依细胞内某一氨基酸水平的高低而行止。所以它是一种应答某一氨基酸水平的高低而行
63、止。所以它是一种应答灵敏、调节灵活的多重调控方式。灵敏、调节灵活的多重调控方式。 就像在色氨酸操纵子中，阻遏作用与衰减机制一起协就像在色氨酸操纵子中，阻遏作用与衰减机制一起协同控制其基因表达，显然比单一的阻遏负调控系统更同控制其基因表达，显然比单一的阻遏负调控系统更为有效。为有效。 一方面一方面，当有活性的阻遏物向无活性阻遏物的转，当有活性的阻遏物向无活性阻遏物的转变速度极低时衰减系统能更迅速地作出反应，使色变速度极低时衰减系统能更迅速地作出反应，使色氨酸从较高浓度快速下降到中等浓度；氨酸从较高浓度快速下降到中等浓度； 另一方面另一方面，若外源色氨酸浓度实在太低，细菌本身，若外源色氨酸浓度实在
64、太低，细菌本身又没有其他的内源性色氨酸合成体系，又没有其他的内源性色氨酸合成体系， 以致细菌难以支持自身的生长时，就需要有衰减体系以致细菌难以支持自身的生长时，就需要有衰减体系加以调节加以调节通过不终止通过不终止mRNA的合成来增加的合成来增加Trp酶酶的合成从而提高内源色氨酸的浓度。的合成从而提高内源色氨酸的浓度。 可见：衰减机制在控制基因产物的量和产物种类的配比上起着快速灵敏的调节作用，使操纵基因表达更为精密、高效。 一、一、 噬菌体的基因组及早、晚期转录噬菌体的基因组及早、晚期转录 一）一） 裂解的级联调节裂解的级联调节 噬菌体长48502nt 共61个基因，其中32个较为重要 溶原化周
65、期 (LYSOGENIC ) 裂解周期(LYTIC) 第四节第四节 噬菌体基因组的表达调控噬菌体基因组的表达调控噬菌体的早，晚期转录二反终止作用二反终止作用 第二节第二节 溶原化途径的维持溶原化途径的维持一、CI蛋白功能蛋白功能 清晰的噬菌斑（Clear plaquea） RM：repressor maintenance 二二CI蛋白的结构蛋白的结构 分子量为27KDa，具有两个功能区 (1) N端功能区，192aa，操纵基因结合区; (2) C端功能区,132236aa，负责形成二聚体。 C蛋白 的结构UV可激活Rec蛋白，活化的Rec蛋白可剪切C蛋白C蛋白的N端含有5个螺旋,第2和第3个螺
66、旋形成HTH(螺旋转角螺旋)C蛋白二聚体N端的HTH和DNA结合，螺旋3位于DNA的大沟C蛋白与DNA结合的信号螺旋2上具有正调控区，此区靠近RNA聚合酶及DNA上的磷酸化位点C蛋白的合成是通过C蛋白激活和RNA聚合酶在PRE上的转录三.阻遏物与阻遏物与DNA的结合及调机制的结合及调机制 螺旋转角螺旋( (helix-turn-helix,HTH)HTH) 识别螺旋（recognition helix）四四. .反义反义RNARNA调控调控 1.PAQ 抑制 Q 基因 表达 2.P RE 抑制 cro 基因 表达五五. .反向调节反向调节游离噬菌体 P L启动子转录的RNA是否会产生 sib
67、位点？游离噬菌体 P I启动子转录的RNA是否会产生 sib 位点？原噬菌体的 P L启动子转录的RNA是否会产生 sib 位点？ 第四节第四节 Cro Cro蛋白的功能蛋白的功能小分子二聚体（每个亚基为9KDa）具有两种效能:(1) 阻止启动子PRM转录；(2)也可抑制从PL和PR起始的早期基因的表达。第五节第五节 溶原化和裂解周期平衡溶原化和裂解周期平衡进入溶原化1.营养耗尽 未发现cAMP-CAP对基因表达的调控 对宿主: 抗溶原基因hfl 水解C蛋白 cAMP-CAP himA 整合酶亚基2.感染复数(multiplicuty of infection,MOI)过高 C：a.启动PRE
68、 b.启动P i c.启动P AQ C单体无活性，形成寡聚体才有活性第五节第五节 DNA重组对基因表达的调控重组对基因表达的调控在某些细菌中，特定基因的表达与基因组内在某些细菌中，特定基因的表达与基因组内DNA重排有关。重排有关。如沙门氏菌具有运动鞭毛，它是由许多相同的鞭如沙门氏菌具有运动鞭毛，它是由许多相同的鞭毛蛋白亚基装配而成。毛蛋白亚基装配而成。沙门氏菌含有两个不同的结构基因沙门氏菌含有两个不同的结构基因H1和和H2，它们，它们编码不同的鞭毛蛋白。编码不同的鞭毛蛋白。 H1基因表达则产生基因表达则产生Hl型鞭毛蛋白，这时细菌就处于型鞭毛蛋白，这时细菌就处于I相相(Phase l)；若是；
69、若是H2基因表达就产生基因表达就产生H2鞭毛蛋白，细鞭毛蛋白，细菌处于菌处于相相(Phase )。处于处于I相的细菌生长时，其中少数细菌以相的细菌生长时，其中少数细菌以103每次细每次细胞分裂的频率而自发转变为胞分裂的频率而自发转变为相细菌；处于相细菌；处于相的细相的细菌也以同样的频率转变为菌也以同样的频率转变为I相细菌，这一过程称为相相细菌，这一过程称为相变变(phase wariation)H2基因与另一个基因基因与另一个基因rH1紧密连锁，同属于一紧密连锁，同属于一个操纵子。并协同表达。个操纵子。并协同表达。rHl编码编码Hl基因的阻基因的阻遏蛋白。当遏蛋白。当H2和和rH1表达时，由于
70、表达时，由于rHl阻遏物阻遏物阻止了阻止了H1基因的表达，就只合成基因的表达，就只合成H2鞭毛蛋白。鞭毛蛋白。如果如果H2基因和基因和rHl基因被关闭不表达，这时基因被关闭不表达，这时H1基因便表达，合成基因便表达，合成Hl鞭毛蛋白。鞭毛蛋白。 相变的控制取决于含相变的控制取决于含H2和和rHl基因操纵子的启动基因操纵子的启动基因所处的状态。含有启动基因在内的上游基因所处的状态。含有启动基因在内的上游DNA长长995核苷酸对，两边各有一段长核苷酸对，两边各有一段长14核苷酸对的重核苷酸对的重复，即复，即IRL和和IRR。H2基因的起始密码子开始于基因的起始密码子开始于IRR右边的第右边的第17
71、核苷酸对处，核苷酸对处，IRL和和IRR之间的序之间的序列含有基因列含有基因hin，它的产物是相变酶，可催化这段，它的产物是相变酶，可催化这段995核昔酸对序列发生包括核昔酸对序列发生包括hin基因在内的倒位。基因在内的倒位。另外，在倒位前这段序列的第另外，在倒位前这段序列的第950一一983核昔酸对区还核昔酸对区还含有一个促进下游基因转录的启动子含有一个促进下游基因转录的启动子(p)，它使，它使H2和和rH1基因表达，于是细胞处于基因表达，于是细胞处于相。当发生倒位以后，相。当发生倒位以后，这个启动子便被移到序列的另一方，且方向改为朝左，这个启动子便被移到序列的另一方，且方向改为朝左，H2和
72、和rH1失去启动子而失活，这时细胞内没有失去启动子而失活，这时细胞内没有rH1阻阻遏蛋白，因而遏蛋白，因而H1基因表达，细胞转变成基因表达，细胞转变成I相。一旦这相。一旦这段段DNA倒位依复原状，细胞又将转变为倒位依复原状，细胞又将转变为相。相。沙门氏菌沙门氏菌H1或或H2基因选择性表达及其调控基因选择性表达及其调控这种鞭毛相的变化为何不能用基因突变来解释这种鞭毛相的变化为何不能用基因突变来解释？因为因为第一第一这种变化只发生在两种鞭毛蛋白类型这种变化只发生在两种鞭毛蛋白类型的相互转变，而沙门氏菌的鞭毛蛋白类型有十的相互转变，而沙门氏菌的鞭毛蛋白类型有十几种之多，如果是基因突变，那么也应出现其
73、几种之多，如果是基因突变，那么也应出现其他类型的鞭毛蛋白。他类型的鞭毛蛋白。再者再者，这种变化发生的频，这种变化发生的频率很高，从每代每率很高，从每代每105个细胞中改变一个到每代个细胞中改变一个到每代每每103个细胞中改变一个；个细胞中改变一个；第三第三，实验证明：，实验证明：相相变的实质是变的实质是Hl 或或H2基因选择性表达的结果。基因选择性表达的结果。1 翻译过程中的自我调控自体调控：自体调控：一种蛋白质或者RNA调控自身的表达。通过阻抑蛋白结合到mRNA的靶区域上阻止核糖体识别区以达到阻遏的功能。特特点点：每个自自体体调调控控专专一一，调控蛋白只作用于负责指导自身合成的mRNA。阻抑
74、蛋白对翻译起始的调控阻抑蛋白对翻译起始的调控阻抑蛋白对翻译起始的调控阻抑蛋白对翻译起始的调控第六节第六节 蛋白质合成的自体调控蛋白质合成的自体调控一、一、RF2合成的自体调控合成的自体调控 CUU U GAC 25 26RF2充分时，核糖体翻译其充分时，核糖体翻译其mRNA到达此终止密码子，到达此终止密码子， 被被RF2识别，翻译终止（不完全肽链，无识别，翻译终止（不完全肽链，无RF2活性）活性）RF2不足时，核糖体翻译其不足时，核糖体翻译其mRNA到达此终止密码子，到达此终止密码子，发生移位作用，跳过发生移位作用，跳过U，不被，不被RF2识别，翻译继续，识别，翻译继续，直到此基因的最后的终止
75、密码子，在直到此基因的最后的终止密码子，在RF1的作用下，的作用下，形成完整肽链（具形成完整肽链（具RF2活性）活性）二、核糖体蛋白质合成的自体调控二、核糖体蛋白质合成的自体调控 实验分析：实验分析：核糖体蛋白质与核糖体蛋白质与rRNA的结合部位同编码的结合部位同编码核糖体蛋白的核糖体蛋白的mRNA的结合部位有同源性，而且某些的结合部位有同源性，而且某些核糖体蛋白的核糖体蛋白的mRNA其部分二级结构与其部分二级结构与rRNA的部分的部分二级结构相似，二者都能与起调控作用的核糖体蛋白二级结构相似，二者都能与起调控作用的核糖体蛋白质相结合，只是质相结合，只是rRNA的结合能力强于的结合能力强于mR
76、NA 。然而，。然而，一旦一旦rRNA的合成减少或停止，游离的核糖体蛋白开的合成减少或停止，游离的核糖体蛋白开始积累。这些多余的核糖体蛋白就会与本身的始积累。这些多余的核糖体蛋白就会与本身的mRNA结合，从而阻断自身的翻译，同时也阻断同一多顺反结合，从而阻断自身的翻译，同时也阻断同一多顺反子子mRNA下游其他核糖体蛋白质编码区的翻译，使核下游其他核糖体蛋白质编码区的翻译，使核糖体蛋白质的合成和糖体蛋白质的合成和rRNA的合成几乎同步地停止。的合成几乎同步地停止。但但rRNA的合成是在转录层次的调节，而核糖体蛋白的合成是在转录层次的调节，而核糖体蛋白质的合成则是在翻译层次的控制。质的合成则是在翻
77、译层次的控制。三、严谨反应与核糖体合成的调控三、严谨反应与核糖体合成的调控 概念：严谨反应（概念：严谨反应（stringent response)是指细菌是指细菌生长在不良营养条件下时，由于缺乏任何一种生长在不良营养条件下时，由于缺乏任何一种氨基酸等因素所导致的蛋白质合成突然下降氨基酸等因素所导致的蛋白质合成突然下降,tRNA合成突然停止等一系列反应。合成突然停止等一系列反应。表表 与与mRNA起始区结合抑制翻译的阻遏蛋白起始区结合抑制翻译的阻遏蛋白阻遏蛋白阻遏蛋白靶基因靶基因作用位点作用位点R17 R17 外壳蛋白外壳蛋白R17R17复制酶复制酶核糖体结合位点的发夹结合核糖体结合位点的发夹结
78、合T4 RegAT4 RegAT4T4早期早期mRNAmRNA含有起始密码子的各种序列含有起始密码子的各种序列T4 DNA T4 DNA 聚合酶聚合酶T4 DNA T4 DNA 聚合酶聚合酶S-DS-D序列序列T4 p32T4 p32基因基因3232单链单链55前导序列前导序列参与构成基因表达装置的蛋白质的合成的自体调控参与构成基因表达装置的蛋白质的合成的自体调控参与构成基因表达装置的蛋白质的合成的自体调控参与构成基因表达装置的蛋白质的合成的自体调控蛋白质富集会抑制其自身及一些相关基因产物的进一步合成。蛋白质富集会抑制其自身及一些相关基因产物的进一步合成。P32更容易与单链更容易与单链DNA结
79、合，结合，不影响其合成不影响其合成 。缺乏单链缺乏单链DNA或者有过剩或者有过剩P32存在时，此存在时，此蛋白就阻止其本身的蛋白就阻止其本身的mRNA的翻译。此的翻译。此作用是由作用是由P32直接地结合在直接地结合在mRNA上阻断上阻断了翻译的起始，有可能就结合在核糖体了翻译的起始，有可能就结合在核糖体结合位点周围的结合位点周围的A-T丰富区。丰富区。图图 过量的过量的基因基因32 的蛋白的蛋白P32与自身的与自身的mRNA结合抑制核糖体翻译起始结合抑制核糖体翻译起始T4噬菌体蛋白噬菌体蛋白p32合成的自体调控合成的自体调控自动调节r-蛋白在rRNA上的结合位点比在mRNA上的强。只要任何游离
80、的只要任何游离的rRNA是有效是有效的，新合成的的，新合成的r-蛋白将与之结蛋白将与之结合装配成核糖体。合装配成核糖体。若无游离的若无游离的r-蛋白结合于蛋白结合于mRNA上，翻译将持续。上，翻译将持续。当当rRNA合成降低或停止，游合成降低或停止，游离的离的r-蛋白就开始积聚。蛋白就开始积聚。然后然后r-蛋白有效地结合到它们蛋白有效地结合到它们自己的自己的mRMA上，阻遏进一步上，阻遏进一步的翻译。的翻译。通过通过rRNArRNA水平的控制，细胞控水平的控制，细胞控制了各种核糖体成份的生产。制了各种核糖体成份的生产。 图图 结合于结合于rRNArRNA的的r-r-蛋白的自我调控蛋白的自我调控
81、 初生蛋白初生蛋白（1）结构：）结构：vE.coli的RNA噬菌体MS2，R17，f2和Q最简单的病毒。v基因组长36004200nt，只含4个基因：CP(coat protein)含129aa,MW为13.7KDa。A（ atachment） 编 码 附 着 蛋 白 （ 含 393氨 aa， MW为44KDa）；Rep（ replicase） 编 码 复 制 酶 （ 含 544aa， MW为61KKDa）；Lys（lysis）基因编码裂解蛋白,和cp，Rep基因重叠，该蛋白含75aa。（2）调控：调控：2 mRNA二二级结构构对翻翻译的的调控控 CPCP是是阻遏物阻遏物，占据占据reprep
82、的核糖的核糖体结合位点，体结合位点，控制其合成控制其合成A A位位点点裸裸露露了了出出来来，在在尚尚未未形形成成二二级结构构之之前前核核糖糖体体结合合上上去去，进行行翻翻译。A A和和reprep被封被封闭在二在二级结构中构中3 小分子小分子RNA调节翻译调节翻译q 1884年Mizuno和Iwoue发现发现RNA可作为调节因子，可作为调节因子， 与调节与调节蛋白一样，蛋白一样，RNA合成后，可扩散到靶位点。合成后，可扩散到靶位点。q RNARNA也可作为调节物质也可作为调节物质也可作为调节物质也可作为调节物质 ？！？！？！？！qqRNARNA作为调节物质作为调节物质作为调节物质作为调节物质的
83、作用机制的作用机制：(1) 和靶核苷酸序列形成双链区，直接阻碍其翻译的起始。(2) 在靶分子的部分区域形成双链区，改变其构象，直接影响其功能。干扰干扰mRNA的互补的互补RNA（mic-RNA, mRNA-interfering complementary RNA）。 也称为反义反义RNA( antisense RNA )。反义反义RNA作为作为RNA调节物调节物的调节方式：可与可与mRNA结合，结合，结合位点是结合位点是S-D, AUG, 部分部分N端密码子；端密码子；与与RNA形成双螺旋结构，作为内切酶底物；形成双螺旋结构，作为内切酶底物；与转录产物结合，使转录提前终止。与转录产物结合，使
84、转录提前终止。123E coli 中 ompF 基因的翻译调节Env，编码渗透压感受器的受体蛋白，编码渗透压感受器的受体蛋白ompC低渗时，低渗时，ompC关闭，关闭，ompF增加增加高渗时，高渗时，ompC增加，增加，ompF下降下降ompC与与ompF是外膜蛋白，是外膜蛋白，受培养基渗透压的调节受培养基渗透压的调节反义反义RNA技术反反义义技技术术：将靶基因反向插入重组载体的启动子后面，再导入细胞。过量的反义RNA有效阻止靶顺序的翻译。反义RNA能阻止一些基因的转录，RNA的加工，或者mRNA的翻译。此技术常常是任意关闭某些基因的有效方法，例如导入反义RNA来研究基因的调控。 RNAi 技
85、术 1998年年2月，月，Andrew Fire等将单链等将单链RNA纯化后纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱，注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱，而经过纯化的双链而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。将这一现象称为特异性阻断相应基因的表达。将这一现象称为RNA干扰干扰1984年，抗病毒药物的开发年，抗病毒药物的开发1988年年, 转基因番茄（转基因番茄（PG 酶的反义酶的反义RNA）延缓成熟的转基因西红柿ACC， 1-氨基丙环烷羧酸氧化酶，氨基丙环烷羧酸氧化酶， 乙烯合成乙烯合成途径酶类途径酶类 PG，半乳糖醛酸酶，半乳糖醛
86、酸酶第一个上市的转基因植物第一个上市的转基因植物4 重叠核苷酸与翻译调控 色氨酸操纵子 TrpE-Thr-Phe-终止密码子 ACU UUC UGAUG GCU Met-Ala-TrpDTrpB -Glu- Ile-终止 GAA AUC UGAUG GAA Met-Glu-TrpA5 稀有密码子的调控表表 在不同产物中密码子使用频率不同在不同产物中密码子使用频率不同密码子密码子在在2525种非调控蛋白中种非调控蛋白中(%)(%)在引物酶中在引物酶中(%)(%)在在因子中因子中(%)(%)AUUAUU373736362626AUCAUC626232327474AUAAUA1 132320 0在2
87、5种非调控蛋白中： AUU 37% Ile AUC6 2% AUA 1%在dnaG中22个Ile codons AUU 36 Ile AUC 32 AUA 32% 6 魔斑核苷酸水平对翻译的影响-应急调控严严紧紧反反应应(strigent response)：细菌在饥饿条件下，缺乏足够的氨基酸使得蛋白质合成受阻时，将关闭大量的代谢过程。抵御不良条件，保存自己的一种机制。当氨基酸缺乏时，参与蛋白翻译的RNA停止合成。ATP和GDP合成一种新的化合物，称为鸟苷四磷酸ppGpp和pppGpp。在层析谱上检出这两种化合物的斑点，称为魔斑魔斑。GTP+ATPpppGpp+AMPppGpp 魔斑的主要作用
88、：的主要作用：(1) ppGpp四磷酸鸟苷(魔斑I magic spot I) 调控一些反应的效应物，主要功能是： 抑制rRNA基因的启动子与与RNARNA聚合酶与结合的专一性聚合酶与结合的专一性； 抑制多数或大多数基因转录的延伸。(2) pppGpp五磷酸鸟苷(魔斑II magic spot II)v当细胞缺乏氨基酸时产生ppGpp，可在很大范围内做出应急反应，如抑制核糖体和其他大分子的合成，活化某些氨基酸操纵子的转录表达，抑制与氨基酸运转无关的转运系统，活化蛋白水解酶等。 空转反应空转反应（idling reaction）空载tRNA 松驰型突变松驰型突变（relaxed(rel)mutants） 应急因子应急因子（stringent factor）：RelA 蛋白质的正常合成及饥饿时的严紧反应( spoT 编码一种酶，提供ppGpp主要降解途径)（应急因子RelA)
