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1、PCRPCR技术及其应用技术及其应用 聚合酶链反应( Polymerase Chain Reaction, PCR无细胞的分子克隆法)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出优点。 能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍. PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。 基因组基因组基因组基因组DNADNADNADNA获取特定获取特定获取特定获取特定DNADNADNADNA片段片段片段片段扩扩扩扩增增增增特特特特定定定定D D D DN N N NA A A A片片片片段段段段生
2、物样品生物样品生物样品生物样品DNADNA片段片段基基基基因因因因诊诊诊诊断断断断基基基基因因因因治治治治疗疗疗疗基基基基因因因因工工工工程程程程产产产产品品品品法法法法医医医医学学学学检检检检测测测测人人人人类类类类学学学学研研研研究究究究PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTAT
3、CGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引物RNA引物PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明 1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物
4、杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。 但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发展都使克隆基因没有成为现实，所以，Khorana的设想被人们遗忘了PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）。基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制。最初采用E-coli DNA聚合酶I I 的的KlenowKlenow片段进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错。PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1988年 Saiki
5、等 从 水 生 嗜 热 杆 菌(Thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶，命名为Taq DNA聚合酶Taq DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪，使PCR技术得到了广泛应用1993年，Mullis因此项技术获诺贝尔化学奖PCR的基本原理PCR过程PCR反应条件PCR的特点 模拟DNA的体内复制过程,即利用DNA聚合酶在体外条件下，催化一对引物间的特异DNA片段合成。 PCR技术基本原理 : 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构
6、成：模板DNA的变性：加热至93左右后，成为单链，与引物结合，作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物,在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环,变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 123452255729
7、4时间（min）温度（）PCR的基本原理PCR过程PCR反应条件PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复1-3步25-30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍 变性变性（denaturationdenaturation） 在在高高温温条条件件下下（90909595），双双链链模模板板DNADNA的的氢氢键键断断裂裂，解解链链成成两两条条单单链链DNADNA，提提供供复制的模板。复制的模板。变性温度与时间：变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因一般9394lmin足以使模板DNA变性若低于93
8、则需延长时间但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。模板DNA94 退火退火（annealingannealing） 在在低低温温条条件件下下（4040 6565），使使加加入入的的引引物物与与单单链链DNA模模板板上上待待扩扩增增DNADNA区区域域的的两两个个侧侧翼翼准准确确地地配配对对结结合合，并并提提供供DNADNA复复制制起起始的始的3-OH3-OH。 退火退火( (复性复性) )温度与时间：温度与时间：退火温度退火温度是影响PCR特异性的重要因素退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55作为选择最适
9、退火温度的起点较为理想PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50引物1引物2DNA引物 变性后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，而且引物的分子数远远多于模板DNA，故引物与模板DNA结合的机率远远高于DNA分子自身的复性。 延伸（延伸（extensionextension） DNADNA聚聚合合酶酶在在适适当当温温度度（70707575）下下，以以dNTPdNTP为为原原料料，从从特特异异结结合合到到DNADNA模模板板上上的的引引物物3 3-OH-OH端端开开始始，根根据据碱碱基基互互补补配配对对和和半半保保留留复复制制原原则则，进
10、进行行DNADNA链链的的延延伸伸，合合成成与与模板互补的新的模板互补的新的DNADNA分子。分子。大肠杆菌体内各聚合酶作用大肠杆菌体内各聚合酶作用DNA DNA 聚合酶聚合酶 无无5353外切酶活性切除引物外切酶活性切除引物, ,是复制是复制时的主要聚合酶；时的主要聚合酶； DNA DNA 聚合酶聚合酶 I: I:主要负责除去引物并利用脱氧核苷酸填满主要负责除去引物并利用脱氧核苷酸填满空隙；空隙； 1. 1.5353聚合酶活性。聚合酶活性。2. 532. 53外切酶活外切酶活性切除引物。性切除引物。3. 33. 355外切酶活性起校对作用外切酶活性起校对作用DNA DNA 聚合酶聚合酶 有有
11、1 1和和3 3的作用，其他作用尚不清楚。的作用，其他作用尚不清楚。DNA DNA 聚合酶聚合酶和和 涉及涉及DNADNA错误修复。错误修复。延伸温度与时间：延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：聚合酶的生物学活性： 7080 150核苷酸核苷酸/S/酶分子酶分子 70 60核苷酸核苷酸/S/酶分子酶分子 55 24核苷酸核苷酸/S/酶分子酶分子 延伸温度与时间：延伸温度与时间：延伸温度：一般选择在7075之间常用温度为72过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） 34kb的靶序列需34min扩增10
12、Kb需延伸至15min延伸时间过长会导致非特异性扩增对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点70引物1引物2DNA引物Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第1轮结束94第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点945072TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第2轮结束PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增PCR产物的积累规律产物的积累规律DNA扩增过程遵循酶促动力学
13、原理。反应初期，目的DNA片段呈指数形式（2n）增加，随着目的DNA片段的积累，在引物模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期平台期，这种效应称平台效应。（25-30个循环）PCR的基本原理PCR过程PCR反应条件PCR的特点标准的标准的PCRPCR反应体系反应体系10扩增缓冲液扩增缓冲液 10ulMg2+ 1. .5mmol/L4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0. .12ugTaq DNA聚合酶 2. .5u 加双或三蒸水至加双或三蒸水至 100ulPCRPCR操作程序操作
14、程序 向一微量离心管中依次加入缓冲液、 Mg2+ 、dNTP、引物、 DNA模板、Taq DNA聚合酶然后用双蒸水加到最佳体系 。混匀后，离心数秒，使反应成分集于管底。 加矿物油50100l于反应液表面（防蒸发）,置反应管于PCR仪上，设置程序，进行热循环。部分基因组DNAFig1.1 Genomic DNA extracted from blood of part sheep296bpMDRB1基因外显子PCR结果检测的电泳图 琼脂糖凝胶电泳（1-2%）检测扩增酶切产物。1.DNA片段长度(核苷酸数)琼脂糖凝胶电泳的核苷酸数与凝胶的范围。 DNA片段长度的检测（0.8%）PCR扩增产物检测（
15、1.5%）。酶切片段检测（2-3.5%）。2.DNA片段长度(核苷酸数) 丙烯酰胺 1Kb700bp 3.5 (%) 700b500b 5 (%) 500b200b 8 (%) 200b 12(%)PCRPCR反应五要素反应五要素引物（引物（primer） 酶酶 （Taq DNA polymerase） dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 模板模板 （template） Mg2+ （magnesium）1、引物、引物引物是引物是PCR特异性反应的关键特异性反应的关键PCR 产物的特异性取决于引物与模板产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度互补的程度理论上，只要知道任何一
16、段模板理论上，只要知道任何一段模板DNA序序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用物，用 PCR就可将模板就可将模板DNA在体外大量在体外大量扩增扩增 基本原则是最大限度地提高扩增效率和特异性，同时尽可能抑制非特异性扩增。引物设计的原则引物长度：引物长度： 15-30bp，常用，常用20bp左右左右 引物的有效长度不能大于引物的有效长度不能大于 38 bp，否则最适，否则最适 延伸温度会超过延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度聚合酶的最适温度 （74），不能保证），不能保证PCR扩增产物的特异性。扩增产物的特异性。引物扩增跨度：引物扩增跨度：以以5
17、00bp为宜为宜 特定条件下可扩增长至特定条件下可扩增长至10kb的片段的片段 引物碱基：引物碱基：G+C含量以含量以40-60%为宜为宜 G+C太少扩增效果不佳，太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非过多易出现非 特异条带特异条带 ATGC最好随机分布，避免最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或个以上的嘌呤或 嘧啶核苷酸的成串排列，尤其嘧啶核苷酸的成串排列，尤其3端不应超过端不应超过3 个连续的个连续的G或或C，因为这样会使引物在，因为这样会使引物在G+C富富 集区集区 引发错误延伸引发错误延伸避免引物内部出现二级结构和避免引物内部出现二级结构和引物间互补引物间互补 特别避免特别避免 3端的互补
18、，否则会形成引物二聚端的互补，否则会形成引物二聚 体，产生非特异性的扩增条带体，产生非特异性的扩增条带 引物引物 3端的碱基要求严格配对（不能做任何端的碱基要求严格配对（不能做任何修饰）修饰） 特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端 碱基不配对而导致碱基不配对而导致PCR失败失败引物引物5端可修饰端可修饰 引物引物5端限定着端限定着PCR产物的长度，但对扩增特产物的长度，但对扩增特 异性影响不大；引物异性影响不大；引物5端碱基可不与模板端碱基可不与模板DNA 互补而呈游离状态；引物互补而呈游离状态；引物5端最多可加端最多可加10个碱个碱 基而对基而对P
19、CR反应无影响反应无影响 引物的特异性：引物的特异性： 引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性源性引物量：引物量： 每条引物的浓度每条引物的浓度0.1 0.5umol或或10 100 pmol以最低引物量产生所需要的结果为好以最低引物量产生所需要的结果为好 引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会且可增加引物之间形成二聚体的机会2、酶及其浓度、酶及其浓度目前有两种目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应聚合酶供应天然酶：从水生嗜热杆菌中提纯天然酶：从水生嗜热杆菌中提纯基因工程酶：大肠
20、菌合成基因工程酶：大肠菌合成一个典型的一个典型的 PCR反应约需酶量反应约需酶量1- 2.5U/100 ul体系体系浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少物量减少 DNADNA聚合酶聚合酶l KlenowKlenow片段片段 l T4 DNAT4 DNA聚合酶聚合酶 l TaqTaq DNA DNA聚合酶（应用最广）聚合酶（应用最广）l 其他其他DNADNA聚合酶：聚合酶：TthTth DNA DNA聚合酶聚合酶 VentVent DNA DNA聚合酶聚合酶 PfuPfu DNA DNA聚合酶等聚合酶等Taq DNA聚合酶的特性聚合酶的
21、特性酶活性该酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，酶蛋白分子为 94KDa。其比活性为200000单位/mg。7580时每个酶分子每秒钟可延伸约150个核苷酸，70延伸率大于60个核苷酸/秒，55时为24个核苷酸/秒。温度过高(90以上) 或过低(22)都可影响Taq DNA聚合酶的活性。热稳定性有良好的热稳定性，在92.5、95 、97.5时，PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分别经130min，40min和56min后，仍可保持50%的活性。Taq DNA聚合酶的热稳定性是该酶用于PCR反应的前提条件，也是PCR反应能迅速发展和广泛应用的原因。离子依赖性 Taq DNA聚合酶是M
22、g2+依赖性酶，对Mg2+浓度非常敏感。以活性程度很低的鲑鱼精子DNA为模板，dNTP的浓度为0.70.8mmol/L时，用不同浓度Mg2+进行 PCR反应10min，测定结果为MgCl2浓度在2.0mmol/L时该酶催化活性最高，此浓度能最大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性。Mg2+过高就抑制酶活性，当MgCl2浓度在 10mmol/L时可抑制4050%的酶活性。 忠实性 1.TaqDNA聚合酶的功能？2.合成方向？3.为什么不是35？(再次磷酸化需能量)三种聚合酶只有2没有校正活性， TaqDNA聚合酶具有53聚合酶活性和53外切酶活性（切除引物），而无35外切活性(校正），因而，在PC
23、R反应中如发生某些碱基的错配，该酶是没有校正功能的。保真性不如Pfu DNA聚合酶等。Taq DNA聚合酶的碱基错配机率为2.110-4。而DNA复制时109-1010才错配。 3、dNTP 的质量与浓度的质量与浓度dNTP的质量与浓度和的质量与浓度和 PCR扩增效率有密扩增效率有密切关系切关系dNTP呈颗粒状， 保存不当易变性失活dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris-HCl的缓冲液将其pH调节到7.07.5，小量分装，-20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解1.在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，浓度过低会降低PCR产物的产量2.注意4种
24、dNTP的浓度要相等（等摩尔配制 ）,如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低）,就会引起错配3.dNTP3.dNTP可与可与MgMg2+2+结合，使游离的结合，使游离的MgMg2+2+浓度下降浓度下降，影响影响DNADNA聚合酶的活性聚合酶的活性 4 4、模板、模板DNADNA模板DNA的来源： 微生物中提取DNA 从细胞中提取DNA：血细胞、绒毛、尿样、毛 发、精斑、口腔上皮细胞 固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K消化 模板DNA的浓度： 0.12ug/100ul体系 PCR产量随模板DNA浓度的增加而显著升高 模板DNA浓度过高会导致非特异性产物增加。5 5、MgMg2+2+浓度
25、浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响在一般的 PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.52.0 mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。6 6、循环次数循环次数循环次数决定PCR扩增程度主要取决于模板DNA的浓度 选在3040次之间 循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多如何避免引物二聚体如何避免引物二聚体形成？ （1）两种引物如果3端互补的话，便容易出现引物二聚体。通过引物设计可避免。（2）几种聚合酶（包括Taq DNA聚合酶）已被证明具有较弱的非模板指导
26、的聚合作用，该作用可以将核苷酸添加到一条引物的3端，与另一条引物形成短的重叠。应用最低量的引物和酶来减少引物二聚体发生。如何提高如何提高PCRPCR过程中的过程中的DNADNA聚合酶的保真性？聚合酶的保真性？ 在PCR反应体系中，除使用Taq DNA聚合酶，掺入 少量的具有35外切酶活性的耐热DNA聚合 酶，如Pfu，Vent，Pwo等，错配率可降为原来的 1/10； 使四种dNTP浓度相等； Mg2+浓度尽可能低，但不影响DNA合成； 减少高温反应时间，这样DNA热损伤将减少； 减少循环数; 反应体系pH值在70时尽量低于6.0。 如何提高如何提高PCRPCR扩扩增的特异性增的特异性？ 升高
27、退火温度可增加引物与模板结合的特异性； 缩短退火和延伸时间，可减少错误引发及多余的DNA聚合酶分子参与酶促延伸的机会；降低引物和酶的浓度也可以减少错误引发，尤其是能减少引物二聚体的引发； 改变Mg2+的浓度可进一步提高扩增的特异性； 引物设计的特异性； 减少循环次数； 热启动（Hot Start）。即首先将模板变性， 然后在较高温度时加入Taq DNA聚合酶、引物及 MgCl2等一些重要成分，这样使得引物在较高温 度下与模板退火，提高了反应的严谨性，使扩 增更特异； 采用二对引物即外引物和内引物进行扩增来提高 扩增的特异性。PCR的类型和应用研究基因克隆，DNA测序，分析突变诊断细菌、病毒、寄
28、生虫检测人类基因组工程遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱法医犯罪现场标本分析肿瘤各种肿瘤检测其他PCR的类型和应用类型：类型：逆转录逆转录PCR 反向反向PCR巢式巢式PCR 标记标记PCR多重多重PCR 原位原位PCR不对称不对称PCR 定量定量PCR锚定锚定PCR 差异显示差异显示PCR长长PCR 免疫免疫PCRRACE RAPDPCR-FRLP PCR-SSCP1 1、RT-PCRRT-PCR及定量及定量RT-PCRRT-PCR（1 1）RT-PCRRT-PCR（reverse transcription-PCR） 原原理理：先先在在逆逆转转录录酶酶的的作作用用下下、以以mRNAmRN
29、A为为模模板板合合成成互互补补的的cDNAcDNA（complementary complementary DNADNA），再再以以cDNAcDNA为为模模板板进进行行PCRPCR反反应应，这这样样，低低丰丰度度的的mRNAmRNA得得以以扩扩增增放放大大。是是一一种种快快速速、简简便便、敏敏感感性性极极高高的的检检测测mRNAmRNA表达的方法。表达的方法。 oligo （dT）一一般般指指的的是是多多个个T碱碱基基连连接接而而成成的的寡寡聚聚引引物物，其其长长度度有有多多种种，至至少少包包括括oligo d(T)10、oligo d(T)12、oligo d(T)14和和oligo d(T
30、)16这这么么几几种种。最最好好15以以上上，否否则则效效率率有有所所降降低低，而而且且也也更更容容易易与与RNA中中的寡聚的寡聚A的位置结合而起始反转，使的位置结合而起始反转，使cDNA效率下降。效率下降。常用的两种逆常用的两种逆转录转录酶酶AMVAMV（avian myeloblastosis virus）：）：酶活性最适温度酶活性最适温度4242MMLVMMLV（Moloney murine leukemia virus）：酶酶活活性性最最适适温温度度3737（2 2）定量）定量RT-PCRRT-PCR（QRT-PCRQRT-PCR）： 通过过设立一定的RNA竞争性参考标准（RNA co
31、mpetitive reference standard,RNA-CRS)，利用RT-PCR对mRNA 水平进行半定量或绝对定量分析。 半定量半定量RT-PCRRT-PCR 选选用在用在组织组织中普遍表达、表达量比中普遍表达、表达量比较较恒恒定的定的“管家管家”基因基因mRNAmRNA作为作为内源性基因模板内源性基因模板标标准。准。“管家管家”基因基因mRNAmRNA和目的和目的mRNAmRNA混合物混合物共同共同进行进行逆逆转录转录，在各自的引物引，在各自的引物引导导下共同下共同扩扩增。增。计计算出算出扩扩增后目的增后目的cDNA/“cDNA/“管家管家”基基因因cDNAcDNA的比的比值值
32、，从而达到半定量的目的，从而达到半定量的目的。半定量半定量RT-PCRRT-PCR的不足的不足由由于于管管家家基基因因的的mRNAmRNA与与靶靶基基因因使使用用不不同同的的引引物物，两两种种mRNAmRNA在在序序列列、大大小小及及二二级级结结构构上上可可能能亦亦存存在在较较大大的的差差异异，使使两两者者的的扩扩增增效效率率差差异异极极大大，从从而而影响定量的准确性；影响定量的准确性；不不同同来来源源的的组组织织或或细细胞胞的的mRNAmRNA可可能能有有着着不不同同的的逆逆转转录录效效率率，这这种种逆逆转转录录效效率率的的差差异异在在随随后后进进行行的的PCRPCR中被成百万倍地放大中被成
33、百万倍地放大。2 2、实时荧光、实时荧光定量定量PCRPCR 荧光共振能量传递 (FRET) ：某荧光标记基团在激发光刺激下生成某波长的发射光，当另一屏蔽基团与其距离合适时，原发射光将会被屏蔽基团所吸收，并转化为其他波长的发射光或热能，称之为FRET。 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接
34、收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 荧光定量PCR仪比普通的PCR仪多了荧光信号采集系统和计算机分析处理系统，实时荧光定量PCR仪主要是用来定量分析和确定基因转录水平的，而普通的PCR仪是做定性分析和扩增基因片段，定量PCR仪可以做普通PCR仪的工作，而反之就不行了，况且这样代价太大了，一般的实验室都不允许这样做的。总之两者的功能不能互相取代。常规定量PCR技术： 对PCR扩增反应的终产物进行定量 重复性差 半定量实时定量PCR技术： 对PCR扩增反应中每一个循环的产物进行定量 实时荧光定量PCR原理在PCR反应体系中加入荧
35、光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。（1）Ct 值是荧光定量PCR技术的一个很重要的概念 C代表Cycle，t代表threshold。含义是：每个反应管内的荧光信号到达 设定的域值时所经历的循环数。 （2）荧光域值（threshold）的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号荧光域值是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 SDcycle 3-15Ct值的确定 相同模板在同一台PCR仪上进行96次扩增的扩增曲线图Ct值则极具重现性（3）Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模
36、板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。荧光定量标准曲线 特异性强：具有引物和探针的双重特异性重复性好：同一标本的Ct值相同敏感性高：可检测百万分之一个感染细胞或 病毒DNA分子线性范围广：定量的动态范围达5-6个数量 级，因而相差较大的DNA起始拷 贝数也不需稀释工作效率高：一次定量96个样品仅需1-2h 但仪器及配套试剂极其昂贵实时荧光定量PCR的特点用途 定量起始模板浓度 基因型分析 产物鉴定 单核苷酸多
37、态性（SNPSNP）检测3 3、反向、反向PCRPCR（inverse PCRinverse PCR，IPCRIPCR） IPCR是对已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增和研究的一种简捷方法。原原理理：用限制性内切酶消化DNA片段，然后用连接酶将酶切产物连接成环状，再用已知序列上两端相反方向的引物进行PCR。反反向向PCRPCR原原理理图图（A A和和B B分分别别为为限限制制性性内内切切酶酶位位点点；P1P1、P2P2分分 别为别为引物；引物； 黑色区域黑色区域为为已知序列；空白区域已知序列；空白区域为未知为未知序列）序列）反向反向PCRPCR成功要点成功要点 第第一一步步选选择择限限制制性
38、性内内切切酶酶消消化化基基因因组组DNADNA模模板板时时，必必须须选选择择已已知知DNADNA上上无无该该酶酶切切位位点点的的限限制制性性内内切切酶酶，若若产产生粘性末端生粘性末端DNADNA片段片段则则更易于更易于环环化。化。 限限制制性性内内切切酶酶消消化化后后产产生生的的DNADNA片片段段大大小小要要适适当当，太太短短（200200300bp300bp）则则不不能能环环化化，太太长长的的DNADNA片片段段则则受受PCRPCR本身本身扩扩增片段有效增片段有效长长度的限制。度的限制。4 4、原位、原位PCR(In-situ PCR)PCR(In-situ PCR) 原位PCR是在组织细
39、胞里进行PCR反应，它结 合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特 异敏感的PCR技术的优点。 原位PCR是Hasse等于1990年建立的，实验用 的标本是新鲜组织、石蜡包埋组织、脱落细 胞、血细胞等。基本方法：基本方法：固定组织或细胞：多聚甲醛处理固定组织或细胞：多聚甲醛处理蛋白酶蛋白酶K K消化处理消化处理PCRPCR扩增：加扩增：加PCRPCR反应液在组织细胞片上，覆反应液在组织细胞片上，覆 盖液体石蜡后，直接放在扩增仪的金属板上盖液体石蜡后，直接放在扩增仪的金属板上 进行进行PCRPCR循环扩增。有的基因扩增仪带有专循环扩增。有的基因扩增仪带有专 门用于原位门用于原位PCRPCR的装置。
40、的装置。杂交：杂交：PCRPCR扩增结束后，用标记的寡核苷酸探扩增结束后，用标记的寡核苷酸探 针进行原位杂交。针进行原位杂交。显微镜观察结果。显微镜观察结果。人类染色体端粒人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片的荧光原位杂交照片 原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转归有重大的实用价值;其特异性和敏感性高于一般的PCR。5 5、巢式、巢式PCRPCR（nested PCRnested PCR，N-PCRN-PCR） 由于扩增模板含量太低，为了提高检测灵敏度和特异性，采用改进过的PCR-RFLP方法即 N-P
41、CR。 N-PCR是设计两对引物，一对外引物（outer primer）对应的序列在模板的外侧，另一对内引物（inner primer ）在同一模板的外引物的内侧，即外引物扩增产物较长，含有内引物扩增的靶序列，这样经过二次PCR放大将单拷贝的目的DNA片段检出。296bpM第二轮PCR检测结果第一轮PCR检测结果：没有目的条带出现。N-PCR的优点是：第一，克服了单次扩增“平台效应”的限制，使扩增倍数提高，从而极大地提高了PCR扩增的敏感性。第二，由于模板和引物的改变，降低了非特异性反应连续放大进行的可能性，保证了反应的特异性。第三，内侧引物扩增的模板是外侧引物扩增的产物，第二阶段的反应能否进
42、行，也是对第一阶段反应正确性的鉴定，因此可以保证整个反应的准确性及可行性。 N-PCR的缺点是：进行二次PCR扩增引起交叉污染的几率大。我们为了克服此缺点，可采用同一反应管中巢式PCR（one-tube nested PCR）,主要利用内外引物Tm值不同。外引物Tm高，内引物Tm低，PCR反应开始的若干轮循环采用较高的退火温度，内引物由于Tm值低，高温下无法与模板结合不能延伸，而外引物可与模板退火延伸，再采用较低的退火温度进行后面的循环，内引物则可与模板退火延伸，这样实际上进行了二次扩增，但只进行一次操作，可减少交叉污染的机会。可采用同一反应管巢式PCR，主要利用内外引物的Tm值不同。外引物的
43、退火温度高于内引物退火温度。进行两次PCR扩增，一次操作，可减少交叉污染机会。PCR反应是一个复杂的生物化学反应体系，各成分之间存在着动态的相互作用，每一个条件的改变都会影响到整个PCR的效果，因此在实验过程中对反应条件应做综合的考虑。进行一系列的巢式PCR反应体系优化，通过Mg2+浓度、引物浓度、退火温度的梯度比较选择，来确定实验的最佳反应体系。6 6、不对称、不对称PCRPCR（asymmetric PCRasymmetric PCR） 不对称不对称PCRPCR的目的是扩增产生特异长度的目的是扩增产生特异长度的单链的单链DNADNA。此法产生的单链。此法产生的单链DNADNA可用作杂可用作
44、杂交探针或交探针或DNADNA测序的模板。测序的模板。 用一对不等量的引物，这对引物分别称为非限制引物(高浓度引物)与限制性引物(低浓度引物)，其比例一般为501001. 在PCR反应的最初1015个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物消耗完后，非限制性引物引导的PCR就会产生大量的单链DNA。 高浓度引物低浓度引物 不对称PCR的关键是控制限制性引物的绝对量，需多次摸索优化两条引物的比例。 还有一种方法是先用等浓度的引物PCR扩增，制备双链DNA，然后以此双链DNA为模板，再以其中的一条引物进行第二次PCR，制备单链DNA。7 7、多重、多重PCR(multiple PCR)P
45、CR(multiple PCR) 多重PCR又称多重引物PCR或复合PCR，是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增一份DNA样品中的不同序列。用于检测特定基因序列的存在或缺失。多重PCR电电电电泳泳泳泳引物引物8、标记PCR（Labelled primers，LP-PCR) 利用同位素、荧光素等对引物进行标记，用以直观地检测目的基因。 特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分病毒病毒1 1 病毒病毒2 2 病毒病毒 3 3 病毒病毒4 4标记引物标记引物标记引物标记引物观察观察PCRPCR产物产物9、锚定PCR已知靶基因片段两测的序列 VHVHCH1CH1CH1CH1
46、CH2CH2CH2CH2CH3CH3CH3CH3VHVHVLVLVLVLCLCLCLCLcDNAcDNA末端核酸转移酶末端核酸转移酶3GGGG3GGGG5 5 CCCC CCCC 锚定引物锚定引物3GGGG3GGGG5 5 CCCCCCCC3GGGG3GGGGCCCCCCCC1010、快速扩增快速扩增cDNAcDNA末端末端 （rapid amplification of cDNA ends，RACE） RACE是一种由已知的部分cDNA序列来快速获得完整cDNA 5或3末端的PCR技术。原理：原理： 首先从已知的部分cDNA序列选择3和5端方向的引物，两种引物分别与3或5端寡聚dT引物组合扩
47、增3或5端cDNA，最后从两个有相互重叠的3或5端RACE产物来获得全长cDNA序列。1111、mRNAmRNA差差异异显显示示逆逆转转录录PCRPCR（mRNA mRNA differential differential display display RT-PCRRT-PCR，DDRT-PCRDDRT-PCR）DDRT-PCRDDRT-PCR是是目目前前筛筛选选差差异异表表达达未未知知基基因因的的有效方法之一。有效方法之一。原理：原理： 利利用用真真核核细细胞胞mRNAmRNA均均含含polypoly（A A）末末端端的的特特点点，把把3 3端端引引物物设设计计成成T T1212MNMN
48、（M=AM=A，C C或或G G，N=AN=A，G G，C C或或T T），共共1212条条，与与mRNA mRNA 3 3端端poly poly A A结结合合，进进行行逆逆转转录录，形形成成mRNA:cDNAmRNA:cDNA杂杂交交分分子子，5 5端端采采用用2020条条随随机机引引物物，与与锚锚定定引引物物一一起起进进行行PCRPCR扩扩增增，通通过过比比较较实实验验与与对对照照样样本本mRNAmRNA表表达达谱谱，差差异异表表达达的的基基因因会会全全部部呈呈现现出出来来。回回收克隆收克隆鉴鉴定差异条定差异条带带。优优点点 此此法法是是一一种种简简便便、灵灵敏敏、高高效效、快快速速筛选
49、筛选差异表达未知基因差异表达未知基因方法。方法。缺点缺点 具有较高频率的假阳性和短小的差具有较高频率的假阳性和短小的差异片段等缺点异片段等缺点，从而限制了此方法的广泛，从而限制了此方法的广泛应用。应用。 1212、代代表表性性差差示示分分析析（representational representational difference analysis, RDAdifference analysis, RDA）RDARDA是是一一种种新新的的依依赖赖PCRPCR技技术术的的有有效效地地筛筛选选和和克克隆差异表达基因的方法。隆差异表达基因的方法。1313、PCR-SSCPPCR-SSCP（PCR-s
50、ingle strand conformation polymorphism）分析分析PCRPCR产产物物单单链链构构象象多多态态性性分分析析是是一一种种适适合合大大样样本本筛查筛查基因突基因突变变的分析方法。的分析方法。PCR-SSCPPCR-SSCP原理是：原理是： 在在不不含含变变性性剂剂的的中中性性聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶中中电电泳泳时时，单单链链DNADNA的的迁迁移移率率除除与与DNADNA链链的的长长短短有有关关外外，更更主主要要的的是取决于是取决于该该DNADNA单链单链所形成的构象所形成的构象。 相相同同长长度度的的单单链链DNADNA分分子子可可因因其其序序列列的的不不
51、同同，甚甚至至单单个个碱碱基基不不同同，而而形形成成不不同同的的构构象象，导导致致在在中中性性聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶中中电电泳泳迁迁移移率率发发生生改改变变。从从而而达达到到检检测测基基因因突突变变的的目目的的。该该方方法法对对小小于于200bp200bp的的DNADNA片片段段中中存存在在的突的突变变几乎可全部几乎可全部检测检测。检检出出PCR-SSCP分析的基本程序为：首先PCR扩增特定靶序列，然后将扩增产物变性为单链，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外，更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。在非变性条
52、件下，DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象。这种构象由DNA单链碱基决定，其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用（主要为氢键）来维持。相同长度的DNA单链其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率也不同。PCR产物变性后，单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳，靶DNA中含单碱基置换，或数个碱基插入或缺失等改变时，因迁移率变化会出现泳动变位，从而可将变异DNA与正常DNA区分开。 PCR产物产物SSCP多态性检测的具体操作过程多态性检测的具体操作过程A. 丙烯酰胺凝胶的制作：1）用温热含去污剂的水清洗玻璃板，充分漂洗(先用自来水，再用去离子水)，晾干。2）配对玻璃板用夹子固定在
53、板架上，底部用2%琼脂糖封底。3）根据目的片段的大小配胶(分子克隆419 P)，用磁力搅拌器充分混合各组份后，进行灌胶。倒胶时要避免小气泡的产生。4）插入梳子，室温下聚合30-60 min。5）回收封底琼脂糖胶，不要将凝胶板间的琼脂糖胶活动，将凝胶板夹在电泳槽上。6）拔梳子，加入1TBE缓冲液。B. 样品的电泳及固定、染色、显影和终止1） 取3 L 特异性好的PCR产物加7 L SSCP上样缓冲液混合，98变性10 min，立即冰浴10 min，用非变性聚丙烯酰胺凝胶(高板)进行电泳检测。电泳条件为300 V预电泳5 min，使样品快速入胶，然后室温恒压150 V电泳12-16 h。2）固定：
54、从玻璃板上小心取下凝胶，用蒸馏水洗3次，加入固定液固定15 min。3）染色：回收固定液，用蒸馏水冲洗3次，每次不超过1 min，然后放入染色液中染色20 min。4）显影：回收染色液，用蒸馏水冲洗3次，每次不超过30 s，放入显影液中显影，待凝胶上看到目的条带，停止显影。5）终止：将显影后的凝胶放入上述固定液中终止显色反应5-10 min。对胶进行拍照，统计各基因型的个体数。 该技术已被广泛用于癌基因和抗癌基因变异的检测、遗传病的致病基因分析以及基因诊断、基因制图等领域。 为了高灵敏特异性地显示SSCP分析结果，现已发展多种PCR-SSCP技术，各有其优势及适用领域。例如，可以在PCR扩增中
55、用同位素或荧光素等标记引物或核苷，也可以在电泳后用银染或溴化乙锭染色以显示结果。用于SSCP分析的核酸片段越小，检测的敏感性越高。对于200bp的片段，SSCP可发现其中70的变异；对于300bP左右的片段则只能发现其中50的变异；而500bp的片段，则仅能检出103O的变异，因此，300bP，尤其是150bP左右的核酸片段更适于SSCP分析。对于大于400bp的PCR产物就需要设法进一步处理，可以用限制性酶消化PCR产物，产生小于400bP的DNA片段，再进行SSCP分析。在小于1Kb长度的情况下，DNA片段长度与丙烯酰胺的浓度选择如下:DNA片段长度(核苷酸数) 丙烯酰胺 1Kb700bp
56、 3.5 (%) 700b500b 5 (%)500b200b 8 (%)200b 12(%)在进行SSCP前首先要通过PCR扩增出特异性好的产物(琼脂糖电泳不能有过强的拖尾).DRB1-SSCP结果： DD EE GG DD DD HH FG LL DD DD MM FF II 多浪羊DRB1基因外显子2的PCR-SSCP电泳图Electrophoretic patterns of PCR-SSCP of DRB1 exon 2 in Dolang sheep DQB1-SSCP结果： BD KK LL II II JJ NN MM CC BB DD CC NN HN AA AA FI BD
57、 AF EE KK II LL GG NN MM OO PP JJ LL NN OO KK JJ NN多浪羊DQB1基因外显子2的PCR-SSCP电泳图Electrophoretic patterns of PCR-SSCP of DQB1 exon 2 in Dolang sheep选取部分基因型个体进行克隆测序,将测序结果与GenBank(FN393736.1)中MHC-DRB1第2外显子的核苷酸序列进行比对。结果见下图：FN393736.1 CACATTTCTTGGAGTATACTAAGAAAGAGTGTCGTTTCTC 40FN393736.1 CACATTTCTTGGAGTATACT
58、AAGAAAGAGTGTCGTTTCTC 40带型带型CC -a-t 40CC -a-t 40带型带型KK -t-c-gc- 40KK -t-c-gc- 40带型带型FF -ca-gc- 40FF -ca-gc- 40带型带型LK -ta-ggc-a-t 40LK -ta-ggc-a-t 40FN393736.1 CAACGGGACGGAGCGGGTGCGGTTCCTGGACAGATACTTC 80FN393736.1 CAACGGGACGGAGCGGGTGCGGTTCCTGGACAGATACTTC 80带型带型CC -g-a- 80CC -g-a- 80带型带型KK -a- 80KK -a-
59、 80带型带型FF -a- 80FF -a- 80带型带型LK -c-g-c-t-a- 80LK -c-g-c-t-a- 80FN393736.1 TATAATGGAGAAGAGTACGCGCGCTTCGACAGCGACTGGG 120FN393736.1 TATAATGGAGAAGAGTACGCGCGCTTCGACAGCGACTGGG 120带型带型CC -t- 120CC -t- 120带型带型KK -t- 120KK -t- 120带型带型FF -ac-ct- 120FF -ac-ct- 120带型带型LK ac-ac-t- 120LK ac-ac-t- 120FN393736.1 GC
60、GAGTACCGAGCGGTGGCCGAGCTGGGGCGGCCGGACGC 160FN393736.1 GCGAGTACCGAGCGGTGGCCGAGCTGGGGCGGCCGGACGC 160带型带型CC -t-g- 160CC -t-g- 160带型带型KK - 160KK - 160带型带型FF -g-ag- 160FF -g-ag- 160带型带型LK -t-g-a-c-a-a-ga- 160LK -t-g-a-c-a-a-ga- 160FN393736.1 CAAGTACTGGAACAGCCAGAAGGAGCTCCTGGAGCGGAAG 200FN393736.1 CAAGTACTG
61、GAACAGCCAGAAGGAGCTCCTGGAGCGGAAG 200带型带型CC -tt-a-c-g- 200CC -tt-a-c-g- 200带型带型KK - 200KK - 200带型带型FF -g-ct-a-c- 200FF -g-ct-a-c- 200带型带型LK -g-c-a- 200LK -g-c-a- 200FN393736.1 CGGGCCAATGTGGACACGTACTGCAGACACAACTACGGGG 240FN393736.1 CGGGCCAATGTGGACACGTACTGCAGACACAACTACGGGG 240带型带型CC a-a-gcg- 240CC a-a-g
62、cg- 240带型带型KK - 240KK - 240带型带型FF -g-g- 240FF -g-g- 240带型带型LK -g-g-gtg-t- 240LK -g-g-gtg-t- 240FN393736.1 TCGGTGAGAGTTTCACTGTGCAGCG 265FN393736.1 TCGGTGAGAGTTTCACTGTGCAGCG 265带型带型CC - 265CC - 265带型带型KK -tt- 265KK -tt- 265带型带型FF -at- 265FF -at- 265带型带型LK -t- 265LK -t- 265为了检测碱基的突变是否引起了氨基酸的变异，将突变型的核苷酸
63、序列转变成氨基酸序列，然后与MHC-DRB1第2外显子（FN393736.1）所编码的氨基酸进行比对，结果见图2.5：上图基因型CC、KK、FF、LK个体氨基酸与MHC-DRB1基因外显子2氨基酸序列比对 我们对DRB1基因的部分带型进行了测序分析。发现DRB1基因是典型的多碱基突变，而且大部分的碱基突变引起了所编码的氨基酸的改变，只有个别突变是沉默突变。由于碱基突变而引起所编码氨基酸序列的改变，这可能是不同基因型个体表现出包虫病抗性或易感性的根本原因，因为氨基酸序列一旦改变，所表达的蛋白质亦随之改变。至于突变后，究竟是哪种功能性蛋白质在抗性或易感性中起关键作用，而它又是如何调控这种机能的，还
64、有待于深入研究。影响影响PCR-SSCPPCR-SSCP两方面因素两方面因素影影响响PCRPCR扩扩增增特特异异性性的的因因素素均均可可影影响响PCR-PCR-SSCPSSCP分析；分析；影影响响PCRPCR产产物物单单链链电电泳泳的的因因素素，它它们们包包括括聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶浓浓度度和和交交联联度度、电电泳泳温温度度、凝凝胶胶中中甘甘油油（弱弱变变性性剂剂）的的浓浓度度、电电泳泳缓缓冲冲液液离离子子强强度等。度等。SSCP的应用（1）用于检测和肿瘤发生有关的基因突变，例如检测星形细胞瘤、脑瘤、小细胞肺癌、胃癌、肠癌等肿瘤中的 p53基因的突变、肺癌的ras基因突变等. (2)用于
65、检测引起人类遗传性疾病的研究上，如在囊性纤维化中起作用的CFTR基因、神经纤维瘤 1型基因、家族性结肠息肉基因的研究中. (3)用于病毒的分型、监测PCR实验中的污染情况、以及病原体传播途径的研究中. (4)用于DNA定量分析上. 1414、 AluAlu-PCR-PCR原原理理: : 哺哺乳乳动动物物基基因因组组的的特特点点是是包包含含许许多多短短的的重重复复DNADNA序序列列，散散布布于于基基因因组组DNADNA中中的的AluAlu序序列列是是人人类类基基因因组组中中主主要要的的重重复复序序列列，其其拷拷贝贝数数约约为为900,000900,000。利利用用AluAlu高高度度保保守守区
66、区序序列列设设计计引引物物，扩扩增增未未知知DNADNA片片段的方法称段的方法称AluAlu-PCR-PCRAlu-PCR方法特点在于利用人DNA中普遍存在的Alu重复序列，这种300bp序列的拷贝约 900.000个，分布于整个人基因组。虽然Alu重复列各拷贝间有很大差别，但已确定 出了一个相序同序列，且重复子中一些区域是极为保守的。我们认为，可设计合适的能 识别这些保守区的PCR引物，进行有效的内-Alu扩增，从复杂源中分离人DNA。为了只 扩增体细胞杂合子中人DNA而不同时扩增啮齿类Alu等位子，我们需要鉴定人特异引 物。 AluAlu-PCR -PCR 注意要点注意要点靶靶DNADNA
67、中中AluAlu序列的数目及分布在序列的数目及分布在AluAlu-PCR-PCR中起决定作用。中起决定作用。AluAlu序列在基因序列在基因组组DNADNA中的排列方向决定着中的排列方向决定着AluAlu-PCR-PCR引物的引物的选择选择。1515、长长PCRPCR（long PCRlong PCR） 当当利利用用PCRPCR扩扩增增长长度度超超过过5kb5kb片片段段时时，其其扩扩增增效效率率显显著著下下降降（即即长长片片段段产产量量明明显显减减少）。少）。 耐耐热热DNADNA聚聚合合酶酶是是影影响响长长PCRPCR是是否否顺顺利利扩扩增的一个关增的一个关键键因素。因素。长长PCRPCR成功成功扩扩增策略增策略多多种种耐耐热热DNADNA聚聚合合酶酶如如TaqTaq DNA DNA 聚聚合合酶酶和和PfuPfu或或TliTli DNA DNA聚合聚合酶酶混合使用；混合使用；缩缩短短变变性性时间时间 20s 20s；增增加加延延伸伸时时间间，可可达达10102020分分钟钟，依依模模板板长长度而定。度而定。结束结束
