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1、上海市第一人民医院 Shanghai First Peoples Hospital上海市第一人民医院Shanghai First Peoples Hospital上海市第一人民医院 血液科Shanghai First Peoples Hospital 荧光荧光原位杂交原位杂交（FISH）在血液肿瘤中的应用在血液肿瘤中的应用FISH的定义 荧光原位杂交（FISH）是20世纪八十年代在细胞遗传学、分子遗传学和免疫学相结合的基础上发展起来的新技术。它利用已知核酸序列作为探针，以荧光素直接标记或先以生物素或地高辛等半抗原标记后与靶DNA进行杂交，再通过免疫细胞化学过程连接上荧光素标记物，最后在荧光显微
2、镜下观察杂交信号，从而对标本中待测核酸进行定性、定位和定量分析。FISH技术原理FISH技术原理FISH技术原理FISH技术原理FISH技术原理FISH技术原理FISH技术原理FISH的种类v间期FISH（Interphase FISH）v染色体涂染分析（Chromosome painting）v多色FISH（Multicolor-FISH）v反向涂染（Reverse painting）v比较基因组杂交（Comparative genomic hybridization）FISH探针的种类和用途v着丝粒探针用于检测染色体数目异常如三体、单体等。v亚端粒探针靠近端粒的200-300Kb为染色体特
3、异性DNA，用于检测涉及端粒的隐匿性易位。v染色体臂或整条染色体涂染探针（WCP）用于检测染色体易位和标记染色体。v序列特异性探针 包括臂、带和基因探针等多种，用于检测基因缺失和重排。血液肿瘤FISH检测常见探针类型双色双融合探针（双色双融合探针（DCDC，DFDF）额外信号探针（额外信号探针（ESES）分离探针（分离探针（BRKBRK）FISH在血液肿瘤中的应用检测样本可以是血液、骨髓、石蜡切片v诊断和鉴别诊断v治疗和预后分层v监测疗效（微小残留病灶检测） v识别移植后骨髓细胞来源一、诊断和鉴别诊断v核型分析缺点：有丝分裂象少或缺如染色体质量低劣，显带不佳染色体异常复杂v分子生物学检测不足：
4、常见的转录序列来设计引物，扩增的片段长度一般在100 700bp之间mRNA剪切方式比较特殊，假阴性结果，易造成漏诊或误诊一、诊断和鉴别诊断vFISH技术能弥补以上2种技术的不足之处间期细胞上分析（无需中期分裂象），极大地提高了敏感性、准确性和可靠性。对核型提示的染色体异常做进一步鉴定，从“正常核型” 中筛查隐匿的染色体畸变，成为精确的染色体分析不可缺少的手段。FISH探针的片段相对较长，常可达数百kb，甚至大于1Mb，跨越融合基因每一侧多个外显子区域，只要发生在这些区域的缺失或易位都能被检测到，极少发生漏检，假阴性率很低。v举例举例v男性46岁患者，2003.2.24内科急诊发现白细胞增高（
5、25109/L） 。v骨髓显示粒系极度增生，红系、巨核系以及血小板增生尚可，NAP积分49分，核型分析结果为46,XY20。v随访3年，其白细胞始终维持在20-30109水平。一、诊断v2006.5.4发现白细胞增高至170109，血小板511109，血红蛋白118g/dL。v骨髓象显示早幼粒细胞占6%，中幼粒细胞占13%，核型分析未见分裂象。vBCR-ABL 210基因阴性，经单融合FISH探针证实骨髓59%细胞BCR-ABL融合基因阳性。v接受格列卫治疗，2006.9.7复查，FISH阳性细胞比例降低至7.4%，2006.10.23以后的复查结果FISH都为阴性。一、诊断v其他常用于诊断的
6、探针还有：PML/RARA，AML1/ETO，CBF，TEL/AML1等。v以CBF探针为例：发生16号染色体倒位的细胞其荧光信号由2F变成1F/1R/1G。有 研 究 表 明 CBF探 针 对 inv(16)导 致 的CBF-MYH11融合基因的检出率与分子生物学的方法相当。一、诊断一、诊断急性淋巴细胞白血病v急性淋巴细胞白血病检测探针探针定位异常染色体GLP 4/GLP 10GLP 4: 4p11.1-q11.1GLP 10: 10p11.1-q11.1+4，+10GLP 17GLP 17: 17q11 +17GLP TEL/GLP AML1GLP AML1：21q22GLP TEL：12
7、p13 t(12;21)GLP MLLGLP MLL：11q23t(11;v)GLP BCR/GLP ABL(DF)GLP BCR: 22q11.2GLP ABL: 9q34t(9;22)一、诊断淋巴瘤B细胞淋巴瘤IGH基因断裂重组滤泡性淋巴瘤IGH/BCL2融合基因套细胞淋巴瘤IGH/CCND1融合基因弥漫大B细胞淋巴瘤BCL6 基因Burkitt淋巴瘤C-MYC基因粘膜相关淋巴组织淋巴瘤MALT基因断裂重组v鉴别诊断，以BCR/ABL探针为例：额外信号的BCR/ABL探针（ES）根据荧光信号的模式不同，可以鉴别MBCR断裂点（P210）和mBCR断裂点(P190)。MBCR断裂点的细胞呈现
8、1Y/2R/1G的信号模式，而mBCR断裂点的细胞则是2Y/1R/1G的信号模式。一、鉴别诊断一、鉴别诊断v双色双融合信号探针（DF）虽不能区分MBCR和mBCR，但能检测der（9）的部分序列缺失。ABL和BCR基因同时缺失：1R/1G/1YABL基因单独缺失： 1R/2G/1Y 。ES探针却无法检测der（9）的部分序列缺失，其信号均显示1R/1G/1Y 。一、鉴别诊断vIgH-CCND1男性，54岁患者，左颌下肿块2月余白细胞增高（21.3109/L）骨髓涂片见到增生活跃，以成熟淋巴细胞增生为主，考虑慢性淋巴细胞白血病。流式分析显示CD5+CD19+细胞占86.5%，以CD19+的细胞群
9、设门，CD23+细胞约占16.3%。FISH检测患者外周血，约50%的圆形细胞显示融合信号，提示套细胞淋巴瘤可能性大。病理证实了左颌下淋巴结非霍奇金套细胞淋巴瘤。vCLL中的应用CLL的细胞大多处于间期，有丝分裂活性较低，细胞往往不分裂，即使分裂的细胞绝大多也是正常核型，核型分析的异常检出率很低。CLL的遗传学异常被认为与存活期有关：正常核型和13q-预后相近+12、11q-和17p-的预后均较差二、治疗和预后分层FISH共检出了23例异常（76.7%）。完成核型分析的18例中仅2例检出异常。正常核型的9例中，FISH检出7例异常。未见分裂象的7例中，FISH检出5例异常。而且这些由FISH检
10、出的异常克隆比例基本都在20%以上。CEP12P53D13S25RB1ATM核核 型型阳性例数11213121异常2 正常9未见7 未做12二、治疗和预后分层vMM中的应用MM的骨髓瘤细胞有丝分裂指数低，且由于骨髓浸润程度不同，常规核型分析异常检出率相对较低，检出的异常往往是超二倍体和/或复杂核型。MM的遗传学异常同样被认为与预后相关，13q14的缺失被认为是复发和预后不良的独立危险因素，1q21扩增、p53缺失也都提示预后不良。二、治疗和预后分层二、治疗和预后分层vFISH共检出了17例异常（56.7%）。v完成核型分析的27例中6例检出异常（22.2%）。v正常核型的15例中，FISH检出
11、9例异常。v未见分裂象的7例中，FISH检出3例异常。vFISH检出的异常克隆比例大多都低于30%。v浆细胞比例低于20%，异常检出率会大大降低。1q21P53D13S319RB1IgH核核 型型阳性例数628710异常6 正常15未见6 未做3vMDS中的应用FISH在MDS中的应用价值相对较低。MDS的患者大多能成功完成核型分析，且被分析的分裂象数目和质量尚可。FISH检测普遍采用组合探针（-5/5q-、-7/7q-、+8、20q-和-Y）对五大类常见异常进行分析。二、治疗和预后分层v在我院新近完成的70例MDS患者的研究中：核型和FISH分别检出21例和22例异常，异常检出率相当。核型异
12、常但FISH正常的6例，这6例异常均发生于探针覆盖范围以外区域。核型正常而FISH异常7例，这7例的异常克隆细胞比例大多较低（10%）。对于未见分裂像和正常核型的患者有一定的应用价值，能提高小克隆异常的检出率。二、治疗和预后分层三、监测疗效 对于某些不具有特定分子水平改变，或者是基因重排方式比较特殊，常规的分子生物学方法不能检测，但其在疾病初发时有较大片段的易位、缺失、扩增或重排并能被现有的FISH探针检出的患者，可在治疗后进行FISH监测。vFISH在异性别异基因造血干细胞移植后供受者嵌合比例的监测中也有非常重要的价值。v比较未分选细胞的STR和FISH两种技术，FISH的敏感性和准确度更高
13、，对于早期提示复发或排斥反应的临床应用价值更大。四、识别移植后骨髓细胞来源小 结vFISH的优点：简便迅速。杂交和检测效率高。敏感性和特异性高，能对间期细胞进行分析。v缺点包括：价格相对较高。受探针来源的限制。检测三体敏感性高于单体或缺失。石蜡包埋或冰冻切片较难处理。需荧光显微镜和分析系统。一次杂交只能检测1至数个异常。小 结血液肿瘤妇科肿瘤产前诊断泌尿生殖肿瘤上海市第一人民医院 Shanghai First Peoples HospitalWelcometoShanghaiWelcometoourhospital上海市第一人民医院 Shanghai First Peoples Hospita
14、l11醉翁亭记1反复朗读并背诵课文，培养文言语感。2结合注释疏通文义，了解文本内容，掌握文本写作思路。3把握文章的艺术特色，理解虚词在文中的作用。4体会作者的思想感情，理解作者的政治理想。一、导入新课范仲淹因参与改革被贬，于庆历六年写下岳阳楼记，寄托自己“先天下之忧而忧，后天下之乐而乐”的政治理想。实际上，这次改革，受到贬谪的除了范仲淹和滕子京之外，还有范仲淹改革的另一位支持者北宋大文学家、史学家欧阳修。他于庆历五年被贬谪到滁州，也就是今天的安徽省滁州市。也是在此期间，欧阳修在滁州留下了不逊于岳阳楼记的千古名篇醉翁亭记。接下来就让我们一起来学习这篇课文吧！【教学提示】结合前文教学，有利于学生把
15、握本文写作背景，进而加深学生对作品含义的理解。二、教学新课目标导学一：认识作者，了解作品背景作者简介：欧阳修(10071072)，字永叔，自号醉翁，晚年又号“六一居士”。吉州永丰(今属江西)人，因吉州原属庐陵郡，因此他又以“庐陵欧阳修”自居。谥号文忠，世称欧阳文忠公。北宋政治家、文学家、史学家，与韩愈、柳宗元、王安石、苏洵、苏轼、苏辙、曾巩合称“唐宋八大家”。后人又将其与韩愈、柳宗元和苏轼合称“千古文章四大家”。关于“醉翁”与“六一居士”：初谪滁山，自号醉翁。既老而衰且病，将退休于颍水之上，则又更号六一居士。客有问曰：“六一何谓也？”居士曰：“吾家藏书一万卷，集录三代以来金石遗文一千卷，有琴一
16、张，有棋一局，而常置酒一壶。”客曰：“是为五一尔，奈何？”居士曰：“以吾一翁，老于此五物之间，岂不为六一乎？”写作背景：宋仁宗庆历五年(1045年)，参知政事范仲淹等人遭谗离职，欧阳修上书替他们分辩，被贬到滁州做了两年知州。到任以后，他内心抑郁，但还能发挥“宽简而不扰”的作风，取得了某些政绩。醉翁亭记就是在这个时期写就的。目标导学二：朗读文章，通文顺字1初读文章，结合工具书梳理文章字词。2朗读文章，划分文章节奏，标出节奏划分有疑难的语句。节奏划分示例环滁/皆山也。其/西南诸峰，林壑/尤美，望之/蔚然而深秀者，琅琊也。山行/六七里，渐闻/水声潺潺，而泻出于/两峰之间者，酿泉也。峰回/路转，有亭/
17、翼然临于泉上者，醉翁亭也。作亭者/谁？山之僧/曰/智仙也。名之者/谁？太守/自谓也。太守与客来饮/于此，饮少/辄醉，而/年又最高，故/自号曰/醉翁也。醉翁之意/不在酒，在乎/山水之间也。山水之乐，得之心/而寓之酒也。节奏划分思考“山行/六七里”为什么不能划分为“山/行六七里”？明确：“山行”意指“沿着山路走”，“山行”是个状中短语，不能将其割裂。“望之/蔚然而深秀者”为什么不能划分为“望之蔚然/而深秀者”？明确：“蔚然而深秀”是两个并列的词，不宜割裂，“望之”是总起词语，故应从其后断句。【教学提示】引导学生在反复朗读的过程中划分朗读节奏，在划分节奏的过程中感知文意。对于部分结构复杂的句子，教师
18、可做适当的讲解引导。目标导学三：结合注释，翻译训练1学生结合课下注释和工具书自行疏通文义，并画出不解之处。【教学提示】节奏划分与明确文意相辅相成，若能以节奏划分引导学生明确文意最好；若学生理解有限，亦可在解读文意后把握节奏划分。2以四人小组为单位，组内互助解疑，并尝试用“直译”与“意译”两种方法译读文章。3教师选择疑难句或值得翻译的句子，请学生用两种翻译方法进行翻译。翻译示例：若夫日出而林霏开，云归而岩穴暝，晦明变化者，山间之朝暮也。野芳发而幽香，佳木秀而繁阴，风霜高洁，水落而石出者，山间之四时也。直译法：那太阳一出来，树林里的雾气散开，云雾聚拢，山谷就显得昏暗了，朝则自暗而明，暮则自明而暗，
19、或暗或明，变化不一，这是山间早晚的景色。野花开放，有一股清幽的香味，好的树木枝叶繁茂，形成浓郁的绿荫。天高气爽，霜色洁白，泉水浅了，石底露出水面，这是山中四季的景色。意译法：太阳升起，山林里雾气开始消散，烟云聚拢，山谷又开始显得昏暗，清晨自暗而明，薄暮又自明而暗，如此暗明变化的，就是山中的朝暮。春天野花绽开并散发出阵阵幽香，夏日佳树繁茂并形成一片浓荫，秋天风高气爽，霜色洁白，冬日水枯而石底上露，如此，就是山中的四季。【教学提示】翻译有直译与意译两种方式，直译锻炼学生用语的准确性，但可能会降低译文的美感；意译可加强译文的美感，培养学生的翻译兴趣，但可能会降低译文的准确性。因此，需两种翻译方式都做
20、必要引导。全文直译内容见我的积累本。目标导学四：解读文段，把握文本内容1赏析第一段，说说本文是如何引出“醉翁亭”的位置的，作者在此运用了怎样的艺术手法。明确：首先以“环滁皆山也”五字领起，将滁州的地理环境一笔勾出，点出醉翁亭坐落在群山之中，并纵观滁州全貌，鸟瞰群山环抱之景。接着作者将“镜头”全景移向局部，先写“西南诸峰，林壑尤美”，醉翁亭坐落在有最美的林壑的西南诸峰之中，视野集中到最佳处。再写琅琊山“蔚然而深秀”，点山“秀”，照应上文的“美”。又写酿泉，其名字透出了泉与酒的关系，好泉酿好酒，好酒叫人醉。“醉翁亭”的名字便暗中透出，然后引出“醉翁亭”来。作者利用空间变幻的手法，移步换景，由远及近
21、，为我们描绘了一幅幅山水特写。2第二段主要写了什么？它和第一段有什么联系？明确：第二段利用时间推移，抓住朝暮及四季特点，描绘了对比鲜明的晦明变化图及四季风光图，写出了其中的“乐亦无穷”。第二段是第一段“山水之乐”的具体化。3第三段同样是写“乐”，但却是写的游人之乐，作者是如何写游人之乐的？明确：“滁人游”，前呼后应，扶老携幼，自由自在，热闹非凡；“太守宴”，溪深鱼肥，泉香酒洌，美味佳肴，应有尽有；“众宾欢”，投壶下棋，觥筹交错，说说笑笑，无拘无束。如此勾画了游人之乐。4作者为什么要在第三段写游人之乐？明确：写滁人之游，描绘出一幅太平祥和的百姓游乐图。游乐场景映在太守的眼里，便多了一层政治清明的
22、意味。太守在游人之乐中酒酣而醉，此醉是为山水之乐而醉，更是为能与百姓同乐而醉。体现太守与百姓关系融洽，“政通人和”才能有这样的乐。5第四段主要写了什么？明确：写宴会散、众人归的情景。目标导学五：深入解读，把握作者思想感情思考探究：作者以一个“乐”字贯穿全篇，却有两个句子别出深意，不单单是在写乐，而是另有所指，表达出另外一种情绪，请你找出这两个句子，说说这种情绪是什么。明确：醉翁之意不在酒，在乎山水之间也。醉能同其乐，醒能述以文者，太守也。这种情绪是作者遭贬谪后的抑郁，作者并未在文中袒露胸怀，只含蓄地说：“醉能同其乐，醒能述以文者，太守也。”此句与醉翁亭的名称、“醉翁之意不在酒，在乎山水之间也”
23、前后呼应，并与“滁人游”“太守宴”“众宾欢”“太守醉”连成一条抒情的线索，曲折地表达了作者内心复杂的思想感情。目标导学六：赏析文本，感受文本艺术特色1在把握作者复杂感情的基础上朗读文本。2反复朗读，请同学说说本文读来有哪些特点，为什么会有这些特点。(1)句法上大量运用骈偶句，并夹有散句，既整齐又富有变化，使文章越发显得音调铿锵，形成一种骈散结合的独特风格。如“野芳发而幽香，佳木秀而繁阴”“朝而往，暮而归，四时之景不同，而乐亦无穷也”。(2)文章多用判断句，层次极其分明，抒情淋漓尽致，“也”“而”的反复运用，形成回环往复的韵律，使读者在诵读中获得美的享受。(3)文章写景优美，又多韵律，使人读来不
24、仅能感受到绘画美，也能感受到韵律美。目标导学七：探索文本虚词，把握文言现象虚词“而”的用法用法文本举例表并列1.蔚然而深秀者；2.溪深而鱼肥；3.泉香而酒洌；4.起坐而喧哗者表递进1.而年又最高；2.得之心而寓之酒也表承接1.渐闻水声潺潺，而泻出于两峰之间者；2.若夫日出而林霏开，云归而岩穴暝；3.野芳发而幽香，佳木秀而繁阴；4.水落而石出者；5.临溪而渔；6.太守归而宾客从也；7.人知从太守游而乐表修饰1.朝而往，暮而归；2.杂然而前陈者表转折1.而不知人之乐；2.而不知太守之乐其乐也虚词“之”的用法用法文本举例表助词“的”1.泻出于两峰之间者；2.醉翁之意不在酒；3.山水之乐；4.山间之朝
25、暮也；5.宴酣之乐位于主谓之间，取消句子独立性而不知太守之乐其乐也表代词1.望之蔚然而深秀者；2.名之者谁(指醉翁亭)；3.得之心而寓之酒也(指山水之乐)【教学提示】更多文言现象请参见我的积累本。三、板书设计路线：环滁琅琊山酿泉醉翁亭风景：朝暮之景四时之景山水之乐(醉景)风俗：滁人游太守宴众宾欢太守醉宴游之乐(醉人)心情：禽鸟乐人之乐乐其乐与民同乐(醉情)可取之处重视朗读，有利于培养学生的文言语感，并通过节奏划分引导学生理解文意，突破了仅按注释疏通文义的桎梏，有利于引导学生自主思考；不单纯关注“直译”原则，同时培养学生的“意译”能力，引导学生关注文言文的美感，在一定程度上有助于培养学生的核心素养。不足之处文章难度相对较高，基础能力低的学生难以适应该教学。会员免费下载
