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1、第15课时聚合酶链式反应技术第4章现代生物技术学习导航1.阅读教材P7778内容，掌握PCR技术原理。2.结合教材P7980内容，了解PCR技术的基本操作过程，讨论PCR技术的影响因素。重难点击1.简述PCR的原理。2.了解PCR技术的基本操作过程并讨论PCR技术的影响因素。一、PCR的原理二、DNA片段的PCR扩增和产物检测内容索引当堂检测一、PCR的原理基础梳理聚合酶链式反应简称PCR，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，这项技术中DNA复制的过程和细胞内DNA复制的过程是类似的，请结合已学习的DNA分子结构和复制的相关知识，分析PCR的原理。1.DNA的平面结构示意图的平面结构示意图(1
2、)写出各个标号的名称 ； ； ； ； ； ； ； ； ； 。胞嘧啶腺嘌呤鸟嘌呤核糖胸腺嘧啶脱氧核糖磷酸基团胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸氢键碱基对一条脱氧核糖核苷酸链(2)DNA的两条链是反向平行的，为了明确表示DNA链的方向，通常将羟基末端称为3端；将磷酸基团的末端称为5端，按此原则在图上方框内标出两条链的方向。答案答案左链上5端，下3端；右链上3端，下5端。2.细胞内细胞内DNA复制条件分析复制条件分析条件组分作用模板DNA的 条单链提供复制的模板原料四种_合成DNA子链的原料酶解旋酶打开_DNA聚合酶催化_能量_为解螺旋和合成子链供能引物RNA为DNA聚合酶提供合成的 起点脱氧核糖核苷酸两DNA
3、双螺旋合成DNA子链ATP3端3.PCR原理与反应过程原理与反应过程(1)PCR概念：是一种 的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。体外酶促合成特定DNA片段(2)条件及作用条件作用待扩增的目的DNA片段作为复制的模板两种人工合成的单链DNA片段_四种三磷酸脱氧核苷酸_酶促作用_反应介质合成DNA时所需要的特异引物原料耐热TaqDNA聚合酶缓冲溶液(3)反应过程变性温度上升到 时，目的DNA双链 为单链模板。复性温度下降到 左右，两种引物通过 与两条单链DNA结合。9498变性解旋4060碱基互补配对延伸温度上升到 左右，溶液中的 在耐热的_ 的作用下。根据
4、碱基互补配对原则合成新的DNA链。循环：继续上述的3个过程，DNA片段被不断的扩增。若开始加入了N个DNA模板片段，理论上，循环n次后能获得 个DNA片段。72四种脱氧核糖核苷酸TaqDNAN2n聚合酶1.PCR原理PCR反应与体内DNA复制的引物在化学本质上是否相同？请分析原因。答答案案不相同。体内DNA复制所需引物为RNA聚合酶合成的一小段RNA，但PCR反应时所用引物一般是人工合成的单链DNA片段。问题探究答案答案2.PCR反应过程(1)PCR反应中需要解旋酶和DNA聚合酶吗？若需要，则与细胞内DNA复制有何区别？答答案案PCR反应不需要解旋酶，但需要DNA聚合酶。由于PCR反应中需要高
5、温使DNA解旋，因此PCR所需的DNA聚合酶需耐高温。(2)PCR的每次循环中应如何控制温度？请分析原因。答答案案每次循环中先高温解旋，再低温使引物与模板结合，最后适当升温有利于Taq DNA聚合酶发挥作用。(3)结合下图分析PCR过程中DNA复制的方向是怎样的？答答案案DNA的羟基(OH)末端为3端，磷酸基团的末端为5端。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。答案PCR扩增与DNA复制的异同项目DNA复制PCR扩增不同点时期有丝分裂间期或减数分裂前的间期任何时期场所活细胞内细胞外酶解旋酶、DNA聚合
6、酶耐高温的Taq DNA聚合酶引物有转录，产生RNA作引物，无需人工加入无转录，无引物产生，需人工加入两种DNA引物特点边解旋边复制先全部解旋后开始复制归纳归纳总结总结不同点缓冲液不需缓冲液配制缓冲液代替细胞核液设备无控制温度变化的温控设备相同点原理严格遵循碱基互补配对原则引物都需要分别与两条模板链相结合的两种引物模板DNA的两条链为模板特点半保留复制原料游离的四种脱氧核苷酸拓展应用1.下列关于DNA复制和PCR技术的描述中，正确的是A.DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从5端延伸DNA链B.DNA复制不需要引物C.引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合D.PCR扩增的对象是氨基酸序列
7、解析解析DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，故DNA复制需要引物；DNA聚合酶只能从3端延伸DNA链，而不能从5端延伸DNA链；引物通过碱基互补配对原则与DNA母链相结合；PCR扩增的对象是DNA，不是氨基酸序列。答案解析2.PCR技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低难以对样品进行研究的问题，而被广泛应用，与细胞内的DNA复制相比，PCR可以快速扩增所需的DNA片段，请分析回答下列有关问题：(1)体内DNA复制过程中用解旋酶打开双链DNA，而PCR技术中的解旋原理是 。解解析析PCR技术中用高温使DNA分子中的氢键打开，从而解旋，其原理是DNA的热变性原理。答案解析DNA的热变性原理(2)
8、此过程需要一种Taq DNA聚合酶，该酶是从 中分离的。解析解析Taq DNA聚合酶是从水生耐热细菌Taq中提取的。(3)与普通DNA聚合酶相比，Taq DNA聚合酶具有的特性是 。解解析析与普通DNA聚合酶相比，Taq DNA聚合酶在90 以上的环境中不变性，具有耐高温的特性。(4)与体内DNA复制相比较，PCR反应要在 中才能进行，并且要严格控制 条件。解解析析PCR反应需要适宜的温度和pH，因此PCR反应要在一定的缓冲溶液中进行，并需严格控制好温度条件。答案解析水生耐热细菌Taq耐高温一定的缓冲溶液温度(5)PCR中加入的引物有 种，加入引物的作用是 。解解析析PCR需要两种引物，引物的
9、识别位点决定了PCR扩增的DNA片段。PCR中加入的引物一般是一小段单链DNA，作用是引导DNA复制，可以使游离的脱氧核苷酸与之结合形成磷酸二酯键，成为DNA复制的起点。答案解析2作为DNA复制的起点一题多变一题多变细胞内的DNA复制需要适宜的温度和pH吗？若需要，是如何实现的？答答案案需要。细胞内的适宜温度和pH与内环境的稳态有关，低等生物与环境因素有关。答案与与PCR原理有关的三个易错点原理有关的三个易错点(1)酶的作用位点：解旋酶的作用是使DNA两条链之间的氢键断开；DNA聚合酶与DNA连接酶的作用都是催化形成磷酸二酯键。不要误认为解旋酶也作用于磷酸二酯键。(2)DNA聚合酶和DNA连接
10、酶：DNA聚合酶是将单个核苷酸连接到已有的单链片段的3端上，需要模板；而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。(3)PCR中的解旋过程：PCR过程中不需要解旋酶，需要升高温度才能打开氢键，但此时的温度不会破坏磷酸二酯键，因此，DNA加热变性后变为单链，并未分解成单体。易错提醒易错提醒二、DNA片段的PCR扩增和产物检测基础梳理DNA片段的PCR扩增可以利用PCR热循环仪完成，而产物的检测则利用琼脂糖凝胶电泳进行。阅读教材，完善下列内容：1.DNA片段的片段的PCR扩增扩增 ：按照PCR反应体系的配方将所需试剂摆放于实验桌上 ：用微量移液器按照配方在微量离心管中依次加入各组成成分
11、 ：盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁准备移液混合 ：将微量离心管放在离心机上，离心约10 s，目的是使反应液集中在 离心管底部 ：将离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应(1)加入离心管中的物质应包括： 、 酶、4种_ 、2种 、缓冲液。(2)离心管中要加入少量石蜡油，目的是 。离心反应模板DNATaqDNA聚合三磷酸脱氧核苷酸引物防止反应溶液的挥发(3)热循环仪的反应程序应设定为：94944072(4)影响因素：在PCR实验中，需要扩增的DNA片段的大小决定延伸的时间，片段越大，中温延伸的时间 ；引物的碱基数量和组成则决定着复性温度的选择，如果引物越短，A、T含量越多，复性温度就 ，反
12、之引物越长，G、C含量越多，复性温度就 ，这是因为G、C之间是由_个氢键连接，A、T之间是由 个氢键连接。(5)PCR过程中，循环次数是不是越多越好？答答案案不是。TaqDNA聚合酶在PCR扩增过程中存在1105的出错几率，而且随着循环次数的增加，其活性也会逐渐降低。因此，PCR过程中，循环次数并非越多越好，一般控制在2535个循环。越长越低越高322.扩增产物的检测扩增产物的检测(1)原理：琼脂糖凝胶具有大小一致的刚性滤孔，带有大量负电荷的DNA分子在外加电场的作用下可以通过这些滤孔向正极泳动。DNA片段在凝胶中的泳动速率主要取决于其分子的大小，因此大小一致的DNA分子会在凝胶的一定位置形成
13、DNA条带。(2)过程配制质量分数为1%的琼脂糖凝胶，制作成电泳胶板 在DNA样品中加入0.2倍体积的 混匀 载样缓冲液取20 L加入 内 V稳压电泳2040 min当 指示剂电泳到凝胶底部时，切断电源将胶板浸入 溶液染色510 min在 上观察电泳条带样品孔80溴酚蓝溴化乙锭紫外透射仪问题探究答案1.实验过程分析(1)离心的目的是什么？在离心的过程中，微量离心管的盖子为什么一定要盖严？答答案案离心的目的是使反应液集中在离心管底部，提高反应效率。微量离心管的盖子一定要盖严，防止实验中脱落或液体外溢。(2)在离心前要用手轻轻弹击管的侧壁，目的是什么？答案答案离心前用手轻轻弹击管的侧壁目的是使反应
14、液混合均匀。(3)PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌，为什么这样操作？还有哪些操作与此目的相同？答答案案为避免外源DNA等的污染。在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。2.结果检测(1)实验中为什么要测定DNA的含量？答答案案实际操作过程中会有许多因素影响DNA含量，所以需要对DNA含量进行测定。答案(2)如何判断DNA扩增成功？答案答案可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果。电泳检测的方法，可以通过在紫外线下直接观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。(3)PCR扩增过程可能会出现哪些异常结果？答案答案
15、样品产物少，或产生新的DNA。答案归纳归纳总结总结PCR扩增DNA片段的操作要点(1)避免外源DNA的干扰，所用仪器、缓冲液、蒸馏水等都需要在使用前高压灭菌。(2)缓冲液、酶、DNA引物和DNA模板等如果长期保存，需要在20 冰箱内保存。其中，DNA引物和DNA模板要避免反复冻融，否则容易造成DNA的降解。(3)在用微量移液管混合PCR反应体系的各种成分时，一定注意避免各种溶液之间的相互污染，需遵循每吸取一种溶液就要更换一个枪头的原则。(4)为防止DNA引物与模板DNA在室温非特异性结合进行PCR反应，需在冰盒上混合PCR扩增体系的各种组分。(5)为避免反应过程中高温使EP管中的水蒸气溢出管外
16、而导致PCR过程中各种成分的浓度发生变化，须在PCR反应过程中加入无菌的石蜡油防止溶液的挥发。拓展应用3.使用PCR仪具体实验操作顺序应为设计好PCR仪的循环程序按配方准备好各组分用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分进行PCR反应离心使反应液集中在离心管底部A. B.C. D.解解析析PCR反应的操作步骤一般分为准备(包括配制配方及将各配方放于实验台上)移液混合离心反应。PCR仪是一种自动控制温度的仪器，设计好循环程序就可以进行反应了。答案解析4.近20年来，PCR技术(聚合酶链式反应)成为分子生物学实验室的一种常规实验手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制(如图
17、)，在短时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，从而使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。(1)加热使DNA双链间的 键完全打开，称为 ；而在细胞中是在 酶的作用下进行的。(2)如果只需要大量克隆模板DNA中间的某个特定区段，应该加入 种特定的引物。当温度降低至40 时，引物与两条“舒展”的模板链的特定位置结合，在DNA聚合酶的作用下，只能在引物的 端连接脱氧核苷酸，两条子链的延伸方向都是 。(3)PCR技术的必需条件，除了模板、原料、酶之外，至少还有三个条件，即液体环境、适宜的 和 ，前者由 自动调控，后者则靠 来维持。(4)通过PCR技术使DNA分子大量复制，如果将一个用15N标
18、记的DNA分子放入试管中，以14N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制四次之后，则15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例是 。答案解析问题导析氢解旋解旋两3从子链的5端向3端延伸温度酸碱度PCR仪缓冲液1/8课堂小结引物复性延伸PCR仪琼脂糖凝胶电泳当堂检测1.用于PCR的引物长度通常为2030个核苷酸，是一小段A.DNAB.RNAC.单链DNA或RNAD.双链DNA23451答案2.符合PCR反应条件的一项是稳定的缓冲液环境DNA模板合成引物四种脱氧核苷酸DNA聚合酶DNA解旋酶限制性内切酶温控设备A.B.C.D.解析解析PCR反应模拟的是生物细胞内DNA复制的条件，只是无需解旋酶(可
19、热变性)，也不需要基因工程的工具酶(限制性内切酶)。答案解析234513.下列关于PCR的描述中，正确的是PCR是一种酶促反应 引物决定了扩增的特异性扩增DNA利用了热变性的原理扩增的对象是氨基酸序列A. B.C. D.解解析析PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，在高温条件下，把DNA的双链打开，缓慢冷却后，又重新结合，需要耐高温的DNA聚合酶，同时，还需要引物，从引物的3端连接脱氧核苷酸。答案解析234514.下图所示为PCR扩增的产物，请分析此产物是哪次循环的产物答案23451解析A.第一次循环 B.第二次循环C.第三次循环 D.第四次循环5.聚合酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩
20、增DNA片段的技术。请回答下列问题：(1)DNA的两条链是反向平行的，通常将 的末端称为5端，当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的 开始延伸DNA链。解解析析一条脱氧核苷酸链一端是游离的羟基，另一端是游离的磷酸基团，含羟基的一端是3端，含磷酸基团的是5端。引物的5端与模板链的3端结合，然后沿着引物的3端延伸。耐高温的Taq DNA聚合酶的发现是实现PCR的关键，该酶可以利用选择培养基从一些微生物中分离出来。PCR一次循环要经历变性、复性和延伸三个阶段。23451磷酸基团3端答案解析(2)PCR利用了DNA的热变性原理解决了打开DNA双链的问题，但又导致了DNA聚合酶失活的新问题。到20世纪80年代，科学家从一种Taq细菌中分离到 ，它的发现和应用解决了上述问题。要将Taq细菌从其他普通的微生物中分离出来，所用的培养基叫 。(3)PCR的每次循环可以分为 三步。假设在PCR反应中，只有一个DNA片段作为模板，请计算在5次循环后，反应物中大约有_个这样的DNA片段。(4)简述PCR技术的主要应用：_ (要求至少答两项)。23451答案耐高温的Taq DNA聚合酶选择培养基变性、复性和延伸32遗传疾病的临床诊断、法医鉴定、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等
