小鼠小鼠脑组织病理病理实验总结1整理课件 内容内容•石蜡切片的制作石蜡切片的制作•冰冰冻切片的制作切片的制作•免疫免疫组化化•免疫免疫荧光光•HEHE•病理相关病理相关试剂配制配制•注意事注意事项2整理课件 石蜡切片的制作石蜡切片的制作•取材和固定：取材和固定： 处死死动物后或者灌注后立即物后或者灌注后立即切取切取组织块，并快速投入固定液中并快速投入固定液中•脱水和透明：梯度酒精和二甲苯脱水和透明：梯度酒精和二甲苯•浸蜡和包埋：石蜡浸蜡和包埋：石蜡•切片制作：切片切片制作：切片•贴片：片：捞片，展片片，展片•保存：烤片保存：烤片3整理课件 冰冰冻切片的制作切片的制作•取材和固定：取材和固定： 灌注后立即切取灌注后立即切取组织块，并，并快速投入固定液中，或者快速投入固定液中，或者处死后直接冷死后直接冷冻•脱水和透明：梯度蔗糖脱水和透明：梯度蔗糖•包埋：包埋：OCTOCT，，3%3%聚乙聚乙烯醇•切片制作：切片切片制作：切片•贴片：直接片：直接贴•固定：冰固定：冰冻丙丙酮3-53-5分分•保存：保存：-20°C-20°C4整理课件 灌注灌注 0.5%0.5%戊巴比妥戊巴比妥钠100mg/Kg100mg/Kg麻醉小鼠，麻醉小鼠，5 5分分钟左右小鼠麻醉好，仰卧位固定四肢，用左右小鼠麻醉好，仰卧位固定四肢，用酒精棉球擦胸腹部毛，前开皮肤暴露胸部酒精棉球擦胸腹部毛，前开皮肤暴露胸部肌肉肌肉层，，剑突上成突上成V V型剪开胸廓，暴露心型剪开胸廓，暴露心脏，，剪掉右心耳（即剪掉右心耳（即视野下心野下心脏上色暗上色暗红组织）），与心尖，与心尖处30°30°角刺入左心室，角刺入左心室，37°37°左右左右生理生理盐水水约10ml10ml缓慢注入，冲慢注入，冲净血液止，血液止，换4%4%多聚甲多聚甲醛溶液（溶液（4°4°预冷），冷），10-2010-20分分钟，，鼠僵硬鼠僵硬为好。
好5整理课件 固定固定•4%4%多聚甲多聚甲醛根据不同根据不同实验需求要求石蜡切需求要求石蜡切片的固定片的固定时间不同，几小不同，几小时到一周•我曾用我曾用过2 2天，可以天，可以•冲水，固定的冲水，固定的时间越越长冲水冲水时间越越长，，预防甲防甲醛沉沉积6整理课件 取取脑 断断头，剪开皮肤，剪开皮肤拨向两向两侧暴露暴露颅骨，从骨，从枕骨大孔枕骨大孔处沿正中沿正中线剪开露骨，用剪开露骨，用镊子子掰开露骨，暴露开露骨，暴露脑组织，用弯，用弯头镊将将脑组织勾出，在坐勾出，在坐标纸上根据小鼠上根据小鼠脑图谱取相取相应脑区区组织，厚，厚3mm3mm左右7整理课件 脱水和透明，浸蜡脱水和透明，浸蜡•石蜡切片：石蜡切片：75%75%，，80%80%，，85%85%，，90%90%，，95%95%（（2 2个）个），无水乙醇（，无水乙醇（2 2）中每个）中每个4 4小小时- -过夜，正丁夜，正丁醇醇1-21-2天二甲苯（天二甲苯（2 2个）个）20-3020-30分分钟三个蜡，每个大于蜡，每个大于2 2小小时•冰冰冻切片：固定后脱水用切片：固定后脱水用10%20%30%10%20%30%蔗糖蔗糖（（0.1MPBS0.1MPBS溶）每个室温下溶）每个室温下4 4小小时————过夜，夜，OCTOCT包埋，先在包埋，先在锡纸盒盒冻一一层，在中，在中间放放组织，切面朝下，再用，切面朝下，再用OCTOCT将将组织没没过，尽量，尽量减少气泡，在液氮表面，保持小盒水平，减少气泡，在液氮表面，保持小盒水平，待中心尚透明待中心尚透明时取出，放于取出，放于-80°C-80°C保存。
保存8整理课件 切片切片•石蜡：冷水石蜡：冷水————温水（温水（54°-56°54°-56°））———— 烤片（烤片（80°80°）） 切好烤片后可以室温保存切好烤片后可以室温保存•冰冰冻：切片温度：切片温度-18°—-20°-18°—-20° 直接直接贴 切好于冰切好于冰冻丙丙酮中固定中固定5 5分后分后-20°-20° 保存9整理课件 固定方法注意事固定方法注意事项1.1.组织块组织块大小大小2cmx2cmx0.5cm2cmx2cmx0.5cm2.2.组织标组织标本本应应及及时时放入固定液中放入固定液中, ,切忌干涸切忌干涸3.3.组织组织固定后必固定后必须须冲洗冲洗, ,除去多余的固定液除去多余的固定液4.4.一般固定一般固定剂剂温度以室温温度以室温, ,某些病毒某些病毒则须则须低温低温 下下处处理理, ,用丙用丙酮酮-20-20度至度至-40-40度固定度固定3030分分钟钟5.5.浓浓度采用度采用10%10%中性甲中性甲醛醛或或4%4%多聚甲多聚甲醛醛6.6. 固定液量是固定液量是标本体本体积2020倍倍7.7.固定固定时间时间不超不超过过2424小小时时10整理课件 组化化实验设计1.1.对对常常规组织规组织切片切片进进行仔行仔细观细观察察, ,根据可提供根据可提供形形态态学特点学特点, ,选择选择最佳并能反映病最佳并能反映病变变的的组织组织标标本本2.2.列出免疫列出免疫组组化的指化的指标标3.3.进进行行预实验预实验( (设设立阳性、阴性立阳性、阴性对对照照) )4.4.找出抗体的最佳修复方法、稀找出抗体的最佳修复方法、稀释释度、孵育度、孵育温度及孵育温度及孵育时间时间5.5.每每张张切片切片应应表明抗体名称表明抗体名称, ,防止相互混淆防止相互混淆11整理课件 12整理课件 实验过程程—70°—70°考片一夜考片一夜——二甲苯二甲苯3 3个每个个每个1010分分钟无水乙醇，无水乙醇，95%95%，，90%90%，，85%85%，，80%80%每个每个1010分分钟—3%—3%双氧水阻断室温双氧水阻断室温1010分分钟（（现配配现用）用）——抗体修复液（抗体修复液（现配，配，400ml400ml一次一个抗体盒）一次一个抗体盒） 微波炉高火微波炉高火6-76-7分分——冷却至室温冷却至室温——再修复一次冷却再修复一次冷却—PBS5—PBS5分分×3×3——擦片加一抗，擦片加一抗，4°4°过夜夜13整理课件 ——第二日第二日PBS5PBS5分分×3×3——加二抗加二抗 室温室温2020分分—PBS5—PBS5分分×3×3—DAB—DAB显色色——水冲水冲5-105-10分分——苏木素木素1-31-3分分——水冲水冲10-1510-15分分—80%85%90%—80%85%90%每个每个3 3分分—95%—95%（（2 2个）无水乙醇（个）无水乙醇（2 2个）二甲苯（个）二甲苯（2 2个）个）每个每个5 5分分——中性中性树胶封片。
胶封片14整理课件 免疫免疫荧光光—PBS5—PBS5分分×3×3—5%BSA—5%BSA室温封室温封闭1 1小小时——加一抗，加一抗，4°4°过夜或根据夜或根据说明明书时间——第二日第二日PBS5PBS5分分×3×3——加二抗加二抗37°37°孵育孵育1 1小小时—PBS5—PBS5分分×3×3—DAPI—DAPI染色染色—PBS2—PBS2分分——丙三醇封片丙三醇封片荧光光显微微镜下下观察照相15整理课件 HE—70°—70°烤片一夜烤片一夜——二甲苯二甲苯3 3个每个个每个1010分分钟无水乙醇，无水乙醇，95%95%，，90%90%，，85%85%，，80%80%每个每个5 5分分钟——苏木素木素1-51-5分分——水水——盐酸酒精酸酒精——水水—0.5%—0.5%氨水氨水16整理课件 ——水水—95%—95%酒精酒精2 2分分—0.5%—0.5%醇溶伊醇溶伊红1 1秒秒—95%—95%酒精酒精3030秒秒—95%—95%酒精，无水乙醇（酒精，无水乙醇（3 3个）每个个）每个2 2分分——二甲苯（二甲苯（2 2个）每个个）每个2 2分分钟——中性中性树胶封片，吹干胶封片，吹干17整理课件 病理相关病理相关试剂配制配制•4%4%多聚甲多聚甲醛：：40g40g多聚甲多聚甲醛粉末溶于粉末溶于500ml500ml水（水（50°50°左右）黄左右）黄枪头加一滴加一滴1M1M氢氧化氧化钠至至澄清，冷却至室温，与澄清，冷却至室温，与500ml0.2MPBS500ml0.2MPBS混合，混合，滤纸过滤。
•0.2MPB:1000ml0.2MPB:1000ml 0.2M 0.2M磷酸磷酸氢二二钠810ml810ml称称57.996g57.996g 0.2M 0.2M磷酸二磷酸二氢钠190ml190ml称称5.928g5.928g•蔗糖：用蔗糖：用0.1MPBS0.1MPBS配制配制•生理生理盐水：水：0.85%0.85%氯化化钠溶液溶液18整理课件 •阻断液：阻断液：0.3% H2O2 甲醇溶液30%双氧水2ml加入甲醇定容至200ml现用现配）•修复液：（修复液：（400ml400ml）） 柠檬酸檬酸0.16g 0.16g 柠檬酸檬酸钠1.18g1.18g•苏木素：木素：•100g100g硫酸硫酸铝钾加加热溶于溶于1250ml1250ml水中水中•5g5g苏木素精粉末溶于木素精粉末溶于100ml100ml无水乙醇中无水乙醇中•溶解后硫酸溶解后硫酸铝钾稍凉，加入醇溶稍凉，加入醇溶苏木素煮沸木素煮沸20-3020-30分，加入分，加入g g氧化汞煮沸氧化汞煮沸2 2分分钟，，19整理课件 注意事注意事项•安全安全•解剖位置解剖位置•液体配制液体配制•染色染色时间•原因原因查找找20整理课件 Thankyou!21整理课件 此课件下载可自行编辑修改，供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！22整理课件 。