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1、细胞内化学组分测定分析技术流式细胞技术（FlowCytometry,FCM）放射自显影技术（radioautography）免疫组织化学技术流式细胞技术（FCM）流式细胞技术流式细胞技术（FlowCytometry,FCMFlowCytometry,FCM）是）是利利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同单细胞生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。 流式细胞仪流式细胞仪（FlowCytometerFlowCytometer）集激光
2、技术、集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技技术。种新型高科技技术。流式细胞计基本结构流式细胞计的基本结构流式细胞计主要由四部分组成。它们是：n n流动室和液流系统；n n激光源和光学系统；n n光电管和检测系统；n n计算机和分析系统。原理待测样品待测样品( (如细胞、染色体、精子或细菌等如细胞、染色体、精子或细菌等) )经荧光染料染色后制成样品悬液，在一定压力下经荧光染料染色后制成样品悬液，在一定压力下通过壳液包围的进样管而进入流动室
3、，排成单列通过壳液包围的进样管而进入流动室，排成单列的细胞，由流动室的喷嘴喷出而成为细胞液流，的细胞，由流动室的喷嘴喷出而成为细胞液流，并与入射激光束相交。细胞被激发而产生荧光，并与入射激光束相交。细胞被激发而产生荧光，由放在与入射的激光束和细胞液流成由放在与入射的激光束和细胞液流成9090处的光处的光学系统收集之。光学系统中的阻断滤片用于阻挡学系统收集之。光学系统中的阻断滤片用于阻挡激发光；二色分光镜及另一些阻断滤片则用于选激发光；二色分光镜及另一些阻断滤片则用于选择荧光波长。荧光检测器为光电倍增管。散射光择荧光波长。荧光检测器为光电倍增管。散射光检测器是光电二极管，用以收集前向散射光。小检
4、测器是光电二极管，用以收集前向散射光。小角度前向散射与细胞大小有关。角度前向散射与细胞大小有关。激光光源光收集系统：滤光片光收集系统：光电倍增管液流系统：流动室、液流驱动系统细胞分选系统FACS Vantage Diva 科研型（大型机）应用举例流式细胞术在细胞生物学、分子遗传学、微生物学、免疫学、分子生物学以及临床肿瘤学、临床血液学等诸多领域都有广泛应用：1.在细胞生物学方面的应用细胞生物学是FCM应用最广泛也是最基本的领域，细胞周期分析是其基本分析内容之一，而实施的技术途径是通过测定细胞周期各时相的DNA含量来达到的。22在免疫学方面的应用：在免疫学方面的应用：FCMFCM以它的快速、灵活
5、及定量的特点被广泛地应以它的快速、灵活及定量的特点被广泛地应用于免疫学的基础研究和临床应用的各个方面，用于免疫学的基础研究和临床应用的各个方面，尤其是结合单克隆抗体技术，在免疫分型、分选、尤其是结合单克隆抗体技术，在免疫分型、分选、肿瘤细胞的免疫监测、机体免疫状态的监测、免肿瘤细胞的免疫监测、机体免疫状态的监测、免疫细胞的系统发生及特性研究等方面更能起到重疫细胞的系统发生及特性研究等方面更能起到重要作用，成为现代免疫技术的重要组成部分。基要作用，成为现代免疫技术的重要组成部分。基于免疫技术是免疫细胞化学分析技术的基础，我于免疫技术是免疫细胞化学分析技术的基础，我们着重介绍们着重介绍FCMFCM
6、在免疫应用中的技术问题。在免疫应用中的技术问题。 3.3.在遗传学研究的应用：在遗传学研究的应用： 用流式细胞术测定染色体用流式细胞术测定染色体DNADNA含量含量, ,可得到染色体可得到染色体频率分布图，称为流式染色体核型分析。同类型频率分布图，称为流式染色体核型分析。同类型染色体出现一个峰，峰的面积代表这种类型染色染色体出现一个峰，峰的面积代表这种类型染色体的丰度。流式染色体核型分析技术不仅能快速体的丰度。流式染色体核型分析技术不仅能快速分析核型，而且能分选出不同类型的染色体分析核型，而且能分选出不同类型的染色体, ,做成做成人类每条染色体的人类每条染色体的DNADNA文库，可用于人类基因
7、组文库，可用于人类基因组研究、遗传病和癌症的诊断的研究。研究、遗传病和癌症的诊断的研究。4 4在肿瘤学研究的应用：在肿瘤学研究的应用：肿瘤细胞一般都含有异常数量的肿瘤细胞一般都含有异常数量的DNADNA。在大多数。在大多数实体瘤和急性白血病中都发现有非整倍体的细胞，实体瘤和急性白血病中都发现有非整倍体的细胞，由于流式细胞术样品制备方法简单，测定结果精由于流式细胞术样品制备方法简单，测定结果精确，能快速得到有关确，能快速得到有关DNADNA倍性的信息倍性的信息, ,因而能提供因而能提供有价值的诊断数据。如果在测量有价值的诊断数据。如果在测量DNADNA含量的同时，含量的同时，再测定其他参数（如不
8、同类型的中等纤维蛋白，再测定其他参数（如不同类型的中等纤维蛋白，蛋白质含量、细胞大小、核质比等）则可进一步蛋白质含量、细胞大小、核质比等）则可进一步提高诊断的可靠性。提高诊断的可靠性。 。 此外，流式细胞术在血液学、微生物学、分子生物学等领域中也得到广泛的应用。流式细胞术正在向高灵敏、高速度、多参数测量、获取形态学信息等方面发展。放射自显影技术放射自显影技术是利用感光材料的感光特性，使之感受放射性核素的涉嫌后，通过显影和定影而得到和标本中偶那个放射性示踪剂所在部位、强度完全一致的银粒影像的技术，所得到的图像称之为放射自显影影像。原理将放射性同位素（如将放射性同位素（如14C14C和和3H3H）
9、标记的化合物）标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，将标本制成切导入生物体内，经过一段时间后，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光。然后性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光。然后经过显影、定影处理显示还原的黑色银颗粒，即经过显影、定影处理显示还原的黑色银颗粒，即可得知标本中标记物的准确位置和数量，放射自可得知标本中标记物的准确位置和数量，放射自显影的切片还可再用染料染色，这样便可在显微显影的切片还可再用染料染色，这样便可在显微镜下对标记上放射性的化合物进行定位或相对定镜下对标记上放射性的化合物进
10、行定位或相对定量测定。量测定。 n n1.发射电子：核乳胶被发射源带电粒子作用负电的卤素离子中释放电子AgBr+Ag+Br-+e-n n离子对形成：当电离离子通过溴化银晶体时形成许多离子对n n3.银原子形成：溴离子所发出的电子被带正电的银离子所俘获。e-+Ag+Agn n4.潜影形成：俘获电子的过程，是还原过程，很多带正电的银原子被还原，在溴化银分子中形成潜影。n n5.显影、定影形成：显影：是形成潜影的卤化银晶体在显影过程中被还原成银盐颗粒，显出影像定影：未形成潜影的晶体通过定影而溶解 放射自显影成像图片用途放射自显影术（radioautography）用于研究标记化合物在机体、组织和细胞
11、中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。应用举例研究药物、营养物质、毒物在器官、组织、细胞中的分布、运转，以及分析其合成、更新、蓄积作用机理等。研究特异性标记前体（如胸腺嘧啶核苷酸DNA前体）的渗入部位、特点、影响因素等，探讨生物活性分子代谢部位机理。标记抗体或药物在离体那个同位素标记。标本上显示抗原或抗体位置，祚定位示踪。用于核算中碱基程序的检测原位杂交时其探针用同位素标记。特点定位精确，灵敏度高，分辨率好，能保存相当长时间；操作简便，无需复杂设备；可供定量研究和双同位素示踪；将形态、机能和代谢地研究统一起来；研究某些大分子在体内地动态变化过程。免疫组织化学技术免疫组织化
12、学技术是用显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项技术。原理先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由
13、于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂体反应部位显示出来（常用显色剂DABDAB显示为棕黄色显示为棕黄色颗粒）。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或颗粒）。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。确定某些化学成分的分布、
14、含量。常用免疫组织化学方法的原理常用免疫组织化学方法的原理n n1 1、免疫荧光方法、免疫荧光方法是最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原是最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进从而可确定组织中某种抗原的定位，进而
15、还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。应用比较广。常用免疫组织化学方法的原理常用免疫组织化学方法的原理n n2 2、免疫酶标方法、免疫酶标方法免疫酶标方法是继免疫荧光后，于免疫酶标方法是继免疫荧光后，于6060年代发展年代发展起来的技术。基本原理是先以酶标记的抗体与组起来的技术。基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光不溶性产物或具有
16、一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是目前最常用的技进行定位研究。免疫酶标技术是目前最常用的技术。术。本方法与免疫荧光技术相比的主要优点是：定本方法与免疫荧光技术相比的主要优点是：定位准确，对比度好，染色标本可长期保存，适合位准确，对比度好，染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。于光、电镜研究等。常用免疫组织化学方法的原理常用免疫组织化学方法的原理n n3 3、免疫胶体金技术、免疫胶体金技术免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物
17、。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。因此，吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子的分子( (如葡萄球菌如葡萄球菌A A蛋白蛋白) )等作为探针，就能对组织或细等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免疫胶有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免
18、疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观察。如应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观察。 免疫组织化学技术照片用途组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。应用举例11确定细胞类型确定细胞类型通过特定抗体标记出细胞内相应抗原成分，以确定通过特定抗体标记出细胞内相应抗原成分，以确定细胞类型。如角蛋
19、白是上皮性标记，前列腺特异性细胞类型。如角蛋白是上皮性标记，前列腺特异性抗原仅见于前列腺上皮，甲状腺球蛋白抗体是甲状抗原仅见于前列腺上皮，甲状腺球蛋白抗体是甲状腺滤泡型癌的敏感标记，而降钙素抗体是甲状腺髓腺滤泡型癌的敏感标记，而降钙素抗体是甲状腺髓样癌的特有标记。有些细胞（如表皮内朗格汉斯细样癌的特有标记。有些细胞（如表皮内朗格汉斯细胞、黑色素细胞、淋巴结内指突状和树突状网织细胞、黑色素细胞、淋巴结内指突状和树突状网织细胞）光镜下不易辨认，但免疫组化标记（胞）光镜下不易辨认，但免疫组化标记（S-100S-100蛋蛋白等）能清楚显示其形态。白等）能清楚显示其形态。22辨认细胞产物辨认细胞产物利用
20、某些细胞产物为抗原制备的抗体，可作为相应利用某些细胞产物为抗原制备的抗体，可作为相应产物的特殊标记，如内分泌细胞产生的各种激素，产物的特殊标记，如内分泌细胞产生的各种激素，大多数可用免疫组化技术标记出来，据此可对内分大多数可用免疫组化技术标记出来，据此可对内分泌肿瘤作功能分类，检测分泌异位激素的肿瘤等。泌肿瘤作功能分类，检测分泌异位激素的肿瘤等。33了解分化程度了解分化程度大多数标记物都有其特定的分布部位，如上皮细胞膜抗大多数标记物都有其特定的分布部位，如上皮细胞膜抗原（原（EMAEMA）着色部位在细胞膜上，但差分化乳癌胞浆内）着色部位在细胞膜上，但差分化乳癌胞浆内也可出现阳性颗粒；角蛋白的含
21、量也与分化程度有关，也可出现阳性颗粒；角蛋白的含量也与分化程度有关，低分化或未分化癌含量较低、染色较弱。低分化或未分化癌含量较低、染色较弱。44鉴定病变性质鉴定病变性质通过标记通过标记IgIg轻链（轻链（ 、 ）可区分部分）可区分部分B B细胞性淋巴瘤与细胞性淋巴瘤与B B细胞反应性增生，前者常表达单一的细胞反应性增生，前者常表达单一的IgIg轻链（轻链（+/+/+），），后者常为多后者常为多克隆克隆克隆克隆IgIg轻链（轻链（+、+）。而标记）。而标记bcl-2bcl-2蛋白蛋白在区别滤泡型淋巴瘤和反应性滤泡增生上有相当的意义。在区别滤泡型淋巴瘤和反应性滤泡增生上有相当的意义。在滤泡型淋巴瘤
22、，在滤泡型淋巴瘤，90%90%以上肿瘤性滤泡细胞有以上肿瘤性滤泡细胞有bcl-2bcl-2的高的高表达；而在滤泡反应性增生时，滤泡反应中心的细胞不表达；而在滤泡反应性增生时，滤泡反应中心的细胞不表达表达bcl-2bcl-2蛋白，而套细胞则表达。蛋白，而套细胞则表达。n n55发现微小转移灶发现微小转移灶某些癌的早期转移有时与淋巴结内窦性组织细胞某些癌的早期转移有时与淋巴结内窦性组织细胞增生不易区别。用常规病理组织学方法要在一个增生不易区别。用常规病理组织学方法要在一个组织中认出单个转移性肿瘤细胞或几个细胞是不组织中认出单个转移性肿瘤细胞或几个细胞是不可能的，而采用免疫组化方法（如用上皮性标志）
23、可能的，而采用免疫组化方法（如用上皮性标志）则十分有助于微小（癌）转移灶的发现。对转移则十分有助于微小（癌）转移灶的发现。对转移性肿瘤也可借助免疫组化标志寻找原发瘤，如骨性肿瘤也可借助免疫组化标志寻找原发瘤，如骨组织内有前列腺特异性抗原阳性细胞，提示前列组织内有前列腺特异性抗原阳性细胞，提示前列腺癌转移。腺癌转移。n n66探讨肿瘤起源或分化表型探讨肿瘤起源或分化表型一些来源不明的肿瘤长期争论不休，最后通过免一些来源不明的肿瘤长期争论不休，最后通过免疫组化标记取得共识。如颗粒性肌母细胞瘤，曾疫组化标记取得共识。如颗粒性肌母细胞瘤，曾被认为是肌源性的，但该肿瘤肌源性标记阴性，被认为是肌源性的，但
24、该肿瘤肌源性标记阴性，而神经性标记阳性，证明为神经来源（可能来自而神经性标记阳性，证明为神经来源（可能来自神经鞘细胞）。分化很差的肿瘤病理上常按细胞神经鞘细胞）。分化很差的肿瘤病理上常按细胞形态分为梭形细胞肿瘤、小圆细胞肿瘤等，通过形态分为梭形细胞肿瘤、小圆细胞肿瘤等，通过多种标记的联合应用，也可能确定其来源。多种标记的联合应用，也可能确定其来源。n n77确定肿瘤分期确定肿瘤分期判断肿瘤是原位还是浸润及有无血管、淋巴管侵袭与肿瘤判断肿瘤是原位还是浸润及有无血管、淋巴管侵袭与肿瘤分期密切相关。用常规病理方法判断有时是十分困难的，分期密切相关。用常规病理方法判断有时是十分困难的，但用免疫组化法可
25、获得明确结果。如采用层粘连蛋白和但用免疫组化法可获得明确结果。如采用层粘连蛋白和型胶原的单克隆抗体可清楚显示基底膜的主要成分，一旦型胶原的单克隆抗体可清楚显示基底膜的主要成分，一旦证实上皮性癌突破了基底膜，就不是原位癌，而是浸润癌证实上皮性癌突破了基底膜，就不是原位癌，而是浸润癌了，其预后是不同的。用第八因子相关蛋白、荆豆凝集素了，其预后是不同的。用第八因子相关蛋白、荆豆凝集素等显示血管和淋巴管内皮细胞的标记物则可清楚显示肿瘤等显示血管和淋巴管内皮细胞的标记物则可清楚显示肿瘤对血管或淋巴管的浸润。对许多肿瘤的良恶性鉴别及有无对血管或淋巴管的浸润。对许多肿瘤的良恶性鉴别及有无血管或淋巴管浸润，这
26、是主要的鉴别依据，同时也有治疗血管或淋巴管浸润，这是主要的鉴别依据，同时也有治疗及预后意义。及预后意义。 特点n n1、特异性强免疫学的基本原理决定了抗原与抗体之间的结合具有高度特异性，因此，免疫组化从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（keratin）显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分。只有当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。n n2、敏感性高在应用免疫组化的起始阶段，由于技术上的限制，只有直接法、间接法等敏感性不高的技术，那时的抗体只能稀释几倍、几十倍；现在由于ABC法或SP法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反应，使免疫组化方法越来越方便地应用于常规病理诊断工作。n n3、定位准确、形态与功能相结合该技术通过抗原抗体反应及呈色反应，可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合的研究，对病理学研究的深入是十分有意义的。
