蛋白质分析课件

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1、第八章第八章 蛋白质分析蛋白质分析概论蛋白质和氨基酸蛋白质分析PPT课件是一类在所有细胞中含量丰富的成份，除了储备蛋白质外，几乎所有的蛋白质对生物功能和细胞结构都非常重要。蛋白质是生命的物质基础，人体内的酸碱平衡、水平衡的维持；遗传信息的传递；物质代谢及转运都与蛋白质有关人及动物只能从食品得到蛋白质及其分解产物，来构成自身的蛋白质，故蛋白质是人体重要的营养物质，也是食品中重要的营养指标。蛋白质分析PPT课件食食品品中中的的蛋蛋白白质质种种类类非非常常复复杂杂，其其中中很很多多已已经经被被纯纯化化和和定定性性。蛋蛋白白质质分分子子量量的的变变化化范范围围通通常常为为50001000,000道道尔

2、尔顿顿，它它们们包包括括氢氢、碳碳、氮氮、氧氧和和硫硫等等元元素素，二二十十种种常常见见-氨氨基基酸酸是是蛋蛋白白质质的的主主要要构构成成。蛋蛋白白质质中中的的氨氨基基酸酸残残基基是是由由多多肽键连结的。肽键连结的。含含氮氮是是蛋蛋白白质质区区别别于于其其他他有有机机化化合合物物的的主要标志。主要标志。蛋白质分析PPT课件由由于于一一些些食食品品的的组组份份具具有有相相似似的的物物化化性性质质而而使使得得对对蛋蛋白白质质的的分分析析变变得得非非常常复复杂杂。非非蛋蛋白白氮氮可可能能来来自自于于游游离离氨氨基基酸酸、小小肽肽核核酸酸、磷磷脂脂、氨氨基基糖糖、嘌嘌呤呤以以及及某某些些维维生素、生物

3、碱、尿酸、脲和氨基离子。生素、生物碱、尿酸、脲和氨基离子。因因此此，食食品品中中的的总总有有机机氮氮主主要要来来自自于于蛋蛋白白质质，小小部部分分来来自自于于非非蛋蛋白白质质组组份份的的有有机氮，他们会干扰蛋白质的测定。机氮，他们会干扰蛋白质的测定。食食品品中中其其他他主主要要成成分分包包括括脂脂类类和和碳碳水水化化合合物物都都完完全全有有可可能能会会干干扰扰食食品品蛋蛋白白质质的的分析。分析。蛋白质分析PPT课件蛋白质分析的重要性1生生物物活活性性测测定定：一些蛋白质包括酶或酶抑制因子和食品科学与营养有关，例如肉类嫩化中的蛋白酶、水果成熟中的果胶酶以及豆类中的胰蛋白酶抑制因子都是蛋白质。2功

4、功能能性性质质调调查查：不同种类食品中的蛋白质都有其独特的食品功能性质，例如小麦面粉中的麦醇溶蛋白和麦谷蛋白具有成面团性，牛奶中的酪蛋白在干酪制作中具有凝结作用，而鸡蛋卵清蛋白具有起泡能力。3营营养养标标签签：当你想要了解以下几个蛋白质指标，就必须进行蛋白质分析。 总蛋白质含量 氨基酸组成 混合物中的特定蛋白质的含量 蛋白质分离纯化过程中的蛋白质含量 非蛋白氮 蛋白质的营养价值（消化率、蛋白质功效比或氮平衡） 蛋白质分析PPT课件蛋白质的测定方法1凯凯氏氏定定氮氮法法（1833年年Kieldahl,常常量量法法、微微量量法法、自自动定氮仪、半微量法、改良凯氏定氮法）动定氮仪、半微量法、改良凯氏

5、定氮法）2 2双缩脲法双缩脲法3福林酚（福林酚（Lowry）法）法4BicinchoninicAcid法法5280nm紫外吸收法紫外吸收法6染色法染色法6.1阴离子染色法阴离子染色法6.2布兰德福特（布兰德福特（Bradford）法）法7茚三酮法茚三酮法8比浊法比浊法9杜马斯法（燃烧法）杜马斯法（燃烧法）10红外光谱法红外光谱法蛋白质分析PPT课件一、凯氏定氮法（常量） 凯氏定氮法凯氏定氮法通过测出样品中的通过测出样品中的总含氮量总含氮量再再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质含量的，乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质含量的，由于样品中常含有少量非蛋白质含氮化合物，由于样品中常含有少量非蛋白质含氮化

6、合物，故此法的结果称为粗蛋白含量。故此法的结果称为粗蛋白含量。 此外，双缩脲法、染料结合法、酚试剂法此外，双缩脲法、染料结合法、酚试剂法等也常用于蛋白质含量测定，由于方法等也常用于蛋白质含量测定，由于方法简便快简便快速速，故多用于生产单位质量控制分析。，故多用于生产单位质量控制分析。蛋白质分析PPT课件原理样品与浓硫酸（氧化、脱水）和催样品与浓硫酸（氧化、脱水）和催化剂（硫酸铜）一同加热消化，使化剂（硫酸铜）一同加热消化，使蛋白质分解，其中蛋白质分解，其中C,H氧化为氧化为CO2和和H2O，有机，有机N转化为氨与硫酸结合成转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。加碱蒸馏时氨蒸出，用硼硫酸铵。加碱蒸馏时氨蒸

7、出，用硼酸吸收后，再以标准盐酸或硫酸溶酸吸收后，再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。液滴定。蛋白质分析PPT课件样品制备样品制备消化消化中和、蒸馏中和、蒸馏滴定滴定计算计算利利用用换换算算系系数数可可以以把把氮氮的的百百分分含含量量转转化化成成样样品品粗粗蛋蛋白白质质含含量量。由由于于大大部部分分蛋蛋白白质质含含有有16%的的 氮氮 ， 所所 以以 其其 换换 算算 系系 数数 一一 般般 为为6.25（100/16=6.25）。）。即：即：%N6.25=%蛋白质蛋白质蛋白质分析PPT课件 蛋白质含量蛋白质含量 换算系数换算系数 蛋或肉蛋或肉 16.0 6.25 牛牛 奶奶 15.7 6.38 小小

8、麦麦 18.76 5.33 玉玉 米米 17.70 5.56 燕燕 麦麦 18.66 5.36 大大 豆豆 18.12 5.52 大大 米米 19.34 5.17 部分食品的蛋白质换算系数部分食品的蛋白质换算系数*蛋白质分析PPT课件在消化反应中,为了加速蛋白质的分解,缩短消化时间,常加入下列物质1 1）硫酸钾硫酸钾: 提高溶液的沸点，加快有机物分解。它与硫酸作用生提高溶液的沸点，加快有机物分解。它与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度，一般纯硫酸的沸点在成硫酸氢钾可提高反应温度，一般纯硫酸的沸点在340340左右左右, ,而添加硫酸钾后而添加硫酸钾后, ,可使温度提高至可使温度提高至40040

9、0以以上，原因主要在于随着消化过程中硫酸不断地被分解上，原因主要在于随着消化过程中硫酸不断地被分解, ,水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大, ,故沸点升高故沸点升高, ,其反其反应式如下：应式如下： K2SO4 + H2SO4 2KHSO4 2KHSO4 K2SO4 + H2O+ SO3 蛋白质分析PPT课件硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起引起生成的铵盐发生热分解放出氨而造成损失。除硫酸钾外，也可以加入硫酸钠、氯化钾等盐类来提高沸点，但效果不如硫酸钾。蛋白质分析PPT课件（2） （催化剂、指示剂）（催化剂、指示剂）硫酸铜硫酸铜 起催化剂的作用。使用

10、时常加入少量过起催化剂的作用。使用时常加入少量过氧化氢、次氯酸钾等作为氧化剂以加速氧化氢、次氯酸钾等作为氧化剂以加速有机物氧化。有机物氧化。 指示消化终点的到达，为清澈的蓝绿色。指示消化终点的到达，为清澈的蓝绿色。指示蒸馏时的碱加入量是否足够。指示蒸馏时的碱加入量是否足够。 除硫酸铜外，还有氧化汞、汞、硒粉、除硫酸铜外，还有氧化汞、汞、硒粉、二氧化钛等也可用的催化剂。二氧化钛等也可用的催化剂。蛋白质分析PPT课件装置蛋白质分析PPT课件操作步骤操作步骤消化消化 准确称取固体样品准确称取固体样品0.20.22g2g（半固体样品（半固体样品2 25g5g，液体样品，液体样品101020ml20ml

11、）移入凯氏烧瓶移入凯氏烧瓶加入加入研细的硫酸铜研细的硫酸铜0.5g0.5g、硫酸钾、硫酸钾10g10g和浓硫酸和浓硫酸20ml20ml摇匀摇匀安装消化装置安装消化装置于凯氏瓶口放一于凯氏瓶口放一漏斗漏斗以以4545角斜支于有小孔的石棉网上角斜支于有小孔的石棉网上用用电炉先以小火加热至内容物全部炭化，泡沫停电炉先以小火加热至内容物全部炭化，泡沫停止后止后加大火力保持瓶内液体微沸加大火力保持瓶内液体微沸至液体变至液体变蓝绿色透明蓝绿色透明继续加热微沸继续加热微沸3030分钟分钟冷却冷却 定溶定溶 加入玻璃珠数粒以防蒸馏时暴沸。加入玻璃珠数粒以防蒸馏时暴沸。蛋白质分析PPT课件蒸馏蒸馏 吸取5mL稀

12、释后的消化液加入凯氏定氮仪内加10mL40%的氢氧化钠夹好漏斗夹冷凝管下端插入吸收瓶液面下(瓶内预先装入10ml4%硼酸溶液及混合指示剂) 加热蒸馏至氨全部蒸出(由红变蓝后约10分钟) 将冷凝管下端提离液面用蒸馏水冲洗管口继续蒸馏1分钟加热。 蛋白质分析PPT课件滴定 将上述吸收液用0.1000mol/L盐酸标准溶液直接滴定至由蓝色变为微红色微红色（用（用甲基红溴甲酚绿混合指示剂）甲基红溴甲酚绿混合指示剂）即为终点，同时作一试剂空白。蛋白质分析PPT课件计算Page 220 公式蛋白质分析PPT课件当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30%过氧化氢过氧化氢23ml后再继续消化。一

13、般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色深绿色。蒸馏装置不能漏气。蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。蛋白质分析PPT课件硼酸吸收液的温度不应超过40，否则对氨的吸收作用减弱而造成损失，此时可置于冷水浴中使用。蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面，清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源，否则可能造成吸收液倒吸。蛋白质分析PPT课件二、自动二、自动凯氏定氮法凯氏定氮法 将将凯氏

14、定氮装置组装成具有自动操作功能的凯氏定氮装置组装成具有自动操作功能的一套装置，原理与试剂同前。一套装置，原理与试剂同前。自动凯氏定氮仪：该装置内具有自动加碱蒸馏自动凯氏定氮仪：该装置内具有自动加碱蒸馏装置，自动吸收和滴定装置以及自动数字显示装置，自动吸收和滴定装置以及自动数字显示装置。装置。消化装置：由优质玻璃制成的凯氏消化瓶及红消化装置：由优质玻璃制成的凯氏消化瓶及红外线加热装置组合而成的消化炉。外线加热装置组合而成的消化炉。蛋白质分析PPT课件方法特点及应用范围方法特点及应用范围灵敏灵敏准确准确快速快速样品用量少样品用量少蛋白质分析PPT课件三、微量凯氏定氮法原理及适用范围同常量凯氏定氮法

15、主要仪器：凯氏烧瓶（100mL）；微量凯氏定氮仪试剂：0.01000mol/L HCl 标准液，其余同常量法Page 221223蛋白质分析PPT课件蛋白质的快速测定双缩脲法原理蛋白质分析PPT课件方法特点及应用范围方法特点及应用范围灵敏度较低，但操作简单快速，在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品的测定。也可定量测定分离也可定量测定分离纯化后的蛋白质。纯化后的蛋白质。蛋白质分析PPT课件步骤标准曲线的绘制：以采用凯氏定氮法测出蛋白质含量的样品作为标准蛋白质样。按蛋白质含量 40mg、 50mg、 60mg、 70mg、 80mg、 90mg、1

16、00mg、110mg分别称取混合均匀的标准蛋白质样于8支50ml纳氏比色管中，然后各加入1ml四氯化碳，再用碱性硫酸铜溶液（或）准确稀释至50ml，振摇10分钟，静置1小时，取上层清夜离心5分钟，取离心分离后的透明液于比色皿中，在560nm波长下以蒸馏水作参比液调节仪器零点并测定各溶液的吸光度A，以蛋白质的含量为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线。蛋白质分析PPT课件样品的测定：准确称取用品适量（使得蛋白质含量在40110mg之间）于50mL纳氏比色管中，加1ml四氯化碳，按上述步骤显色后，在相同条件下测其吸光度A。用测得的A值在标准曲线上即可查得蛋白质mg数，进而由此求得蛋白质含量。蛋白质

17、分析PPT课件优点：优点：该该方方法法比比凯凯氏氏定定氮氮法法费费用用低低，速速度度快快（可可在在不不到到30min的的时时间间内内完完成成），是是分分析析蛋蛋白白质质最最简简单的方法。单的方法。比比福福林林酚酚法法、紫紫外外吸吸收收法法或或比比浊浊法法更更少少发发生生颜颜色偏离。色偏离。几乎没有物质干扰食品中蛋白质的双缩脲反应。几乎没有物质干扰食品中蛋白质的双缩脲反应。不包含非多肽或非蛋白质来源的氮。不包含非多肽或非蛋白质来源的氮。蛋白质分析PPT课件缺点：缺点：不不如如福福林林酚酚法法灵灵敏敏，分分析析时时至至少少需需要要24mg蛋白质。蛋白质。如果存在胆汁素，则吸光度会虚假增加。如果存在

18、胆汁素，则吸光度会虚假增加。高浓度的胺盐会干扰反应。高浓度的胺盐会干扰反应。不不同同蛋蛋白白质质其其最最终终反反应应产产物物的的颜颜色色不不同同，例例如如明胶的双缩脲反应产生红紫色。明胶的双缩脲反应产生红紫色。如如果果有有高高浓浓度度的的脂脂（用用醚醚抽抽出出）或或碳碳水水化化合合物物存在时，最终的反应溶液中可能会呈乳白色。存在时，最终的反应溶液中可能会呈乳白色。此此方方法法不不是是一一个个测测量量绝绝对对值值的的方方法法，必必须须用用已已知知浓浓度度的的蛋蛋白白质质（如如BSA）或或经经凯凯氏氏定定氮氮法法校校正。正。蛋白质分析PPT课件三、福林酚（三、福林酚（Lowry）法）法原理原理蛋白

19、质与福林酚试剂反应，生成的蓝色复合物。蛋白质与福林酚试剂反应，生成的蓝色复合物。其中蛋白质中的其中蛋白质中的肽键与碱性铜离子反应形成双肽键与碱性铜离子反应形成双缩脲反应缩脲反应，同时蛋白质中存在的酪氨酸和色氨，同时蛋白质中存在的酪氨酸和色氨酸同磷钼酸酸同磷钼酸- -磷钨酸试剂反应产生颜色，蛋白磷钨酸试剂反应产生颜色，蛋白质浓度与吸光度有较好的线性关系。质浓度与吸光度有较好的线性关系。蛋白质分析PPT课件优点优点因因为为福福林林酚酚法法简简单单、灵灵敏敏，已已被被广广泛泛应应用用于于蛋蛋白白质质的的生生物物化化学学中中。然然而而，一一般般不不用用于于测测定定未未从食品混合物中纯化的蛋白质。从食品

20、混合物中纯化的蛋白质。 1非常非常灵敏灵敏：A:较双缩脲法灵敏较双缩脲法灵敏50100倍。倍。B：较：较280nm紫外吸收法灵敏紫外吸收法灵敏1020倍。倍。C：较茚三酮法灵敏好几倍。：较茚三酮法灵敏好几倍。D：与奈斯勒方法的灵敏度相似，但操作比其方便。：与奈斯勒方法的灵敏度相似，但操作比其方便。2测定结果较少受到样品混浊度的影响。测定结果较少受到样品混浊度的影响。3特异性特异性要高于其他大多数方法。要高于其他大多数方法。4操作相对简单，可以在操作相对简单，可以在11.5小时内完成。小时内完成。 蛋白质分析PPT课件缺点缺点由由于于下下列列因因素素，福福林林酚酚法法在在某某些些应应用用中中需需

21、采采用用标标准准曲曲线进行校正。线进行校正。1反反应应产产生生的的颜颜色色比比双双缩缩脲脲法法更更易易因因蛋蛋白白质质的的种种类类不不同同而发生变化。而发生变化。2反应最终的颜色深浅并不直接与蛋白质浓度成正比。反应最终的颜色深浅并不直接与蛋白质浓度成正比。3蔗蔗糖糖、脂脂类类、磷磷酸酸盐盐缓缓冲冲液液、单单糖糖和和己己胺胺会会不不同同程程度度的干扰反应。的干扰反应。4.4.高浓度的还原糖、硫酸铵和巯基化合物会干扰反应。高浓度的还原糖、硫酸铵和巯基化合物会干扰反应。蛋白质分析PPT课件四、紫外吸收法四、紫外吸收法原理原理蛋白质在蛋白质在UV280nmUV280nm处有强烈吸收，这是由处有强烈吸收

22、，这是由于蛋白质中于蛋白质中有色氨酸和酪氨酸等芳香环有色氨酸和酪氨酸等芳香环残基存在残基存在。由于存在于每一种食品的蛋。由于存在于每一种食品的蛋白质中色氨酸和酪氨酸的含量相当恒定，白质中色氨酸和酪氨酸的含量相当恒定，所以可用比色法，即在所以可用比色法，即在280nm280nm处比色测定处比色测定蛋白质的浓度。蛋白质的浓度。蛋白质分析PPT课件适用范围适用范围应用应用简便迅速，常用于生物化学研究工作，但由于简便迅速，常用于生物化学研究工作，但由于许多非蛋白成分在紫外光区也有吸收作用，故许多非蛋白成分在紫外光区也有吸收作用，故还没有广泛应用于食品体系。还没有广泛应用于食品体系。已经用于测定牛奶和肉

23、制品中蛋白质的含量，已经用于测定牛奶和肉制品中蛋白质的含量，但此法但此法更适用于纯化的蛋白质体系、已经抽提更适用于纯化的蛋白质体系、已经抽提在碱液或变性剂（如在碱液或变性剂（如8M8M尿素）中的蛋白质测定尿素）中的蛋白质测定。尽管蛋白质中的肽键在尽管蛋白质中的肽键在190nm190nm220nm处的紫外处的紫外吸收比在吸收比在280nm更强，但在低紫外区域的测更强，但在低紫外区域的测定更困难。定更困难。蛋白质分析PPT课件优点优点快快速速，相相对对较较灵灵敏敏（在在280nm处处需需要要100ug或或更更多多的的蛋蛋白白质质，比比双双缩缩脲脲法法灵灵敏数倍）。敏数倍）。反应不受硫酸铵和其它缓冲

24、液的干扰。反应不受硫酸铵和其它缓冲液的干扰。不不破破坏坏样样品品原原有有的的性性质质，在在测测定定完完蛋蛋白白质质含含量量后后仍仍然然可可用用于于其其它它分分析析。广广泛泛用用于层析柱分离后的蛋白质测定。于层析柱分离后的蛋白质测定。蛋白质分析PPT课件缺点缺点核核酸酸在在280nm处处也也有有紫紫外外吸吸收收，纯纯蛋蛋白白质质和和纯纯核核酸酸的的280nm/260nm紫紫外外吸吸收收比比分分别别为为1.75和和0.5。如如果果知知道道280nm/260nm的的值值，就能校正核酸在就能校正核酸在280nm处的吸收值。处的吸收值。不不同同种种类类食食品品的的蛋蛋白白质质中中，芳芳香香族族氨氨基基酸

25、酸的的含含量明显不同。量明显不同。样品溶液必须纯净无色。样品溶液必须纯净无色。此法适用于相对纯净的体系。此法适用于相对纯净的体系。蛋白质分析PPT课件Bicinchoninic Acid(BCA)法原理原理 SmithSmith等人提出等人提出, ,在碱性条件下蛋白在碱性条件下蛋白质将铜离子还原成亚铜离子，质将铜离子还原成亚铜离子，亚铜离子亚铜离子- -蛋白质复合物和苹果绿的蛋白质复合物和苹果绿的BCABCA试剂反应形试剂反应形成浅紫色成浅紫色。反应形成颜色的深浅与蛋白。反应形成颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。质浓度成正比。蛋白质分析PPT课件Bicinchoninic Acid(BCA)法方法

26、方法1蛋蛋白白质质溶溶液液和和含含有有BCA钠钠盐盐、Na2CO3、NaOH、CuSO4、pH11.25的的BCA试试剂剂一一步步混混合。合。2在在37保保温温30min或或室室温温下下放放置置2hr,或或60保保温温30min。温温度度的的选选择择取取决决于于灵灵敏敏度度的要求。较高的温度导致较深的颜色反应。的要求。较高的温度导致较深的颜色反应。3在在562nm处比色读数，并做空白比较。处比色读数，并做空白比较。4.4.用用BSABSA作标准曲线。作标准曲线。蛋白质分析PPT课件Bicinchoninic Acid(BCA)法优点 BCA法法已已经经应应用用于于蛋蛋白白质质的的分分离离和和纯

27、纯化化中中。此此法法对测定复杂食品体系中蛋白质的适用性还未见报道。对测定复杂食品体系中蛋白质的适用性还未见报道。1灵灵敏敏度度与与福福林林酚酚法法相相似似。微微量量BCA法法的的灵灵敏敏度度（0.510ug）稍高于福林酚法。）稍高于福林酚法。2一步混合的操作比福林酚法更简单。一步混合的操作比福林酚法更简单。3所用试剂比福林酚法简单。所用试剂比福林酚法简单。4非离子型表面活性剂和缓冲液不对反应产生干扰。非离子型表面活性剂和缓冲液不对反应产生干扰。5中中等等浓浓度度的的变变性性剂剂（4M盐盐酸酸胍胍或或3M尿尿素素）不不对对反反应产生干扰。应产生干扰。蛋白质分析PPT课件Bicinchoninic

28、 Acid(BCA)法缺点：缺点：1反应产生的颜色不稳定，需要仔细地控制比色时间。反应产生的颜色不稳定，需要仔细地控制比色时间。2还原糖会对此反应产生的干扰比对福林酚法更大。还原糖会对此反应产生的干扰比对福林酚法更大。3不同蛋白质反应引起的颜色变化与福林酚法相似。不同蛋白质反应引起的颜色变化与福林酚法相似。4比色的吸光度与蛋白质浓度不成线性关系。比色的吸光度与蛋白质浓度不成线性关系。蛋白质分析PPT课件阴离子染色法阴离子染色法原理原理含含蛋蛋白白质质的的样样品品溶溶于于缓缓冲冲液液中中和和已已知知的的过过量量阴阴离离子子染染色色剂剂混混和和，蛋蛋白白质质与与染染色色剂剂形形成成不不溶溶性性复复

29、合合物物。反反应应平平衡衡后后，离离心心或或过过滤滤除除去去不不溶溶性性的的复复合合物物，再再测测定定溶溶液液中中未未结结合合的的可可溶溶性性染染色色剂。剂。蛋白质分析PPT课件蛋蛋白白质质+过过量量染染色色剂剂蛋蛋白白质质-染染色色剂剂复复合不溶物合不溶物+未结合可溶性染色剂未结合可溶性染色剂阴阴离离子子磺磺酸酸基基染染色色剂剂，包包括括酸酸性性十十二二号号橙橙，橙橙G G和和酰酰黑黑10B10B，都都可可以以和和基基本本氨氨基基酸酸残残基基中中的的阳阳性性基基团团（组组氨氨酸酸中中的的咪咪唑唑基基、精精氨氨酸酸中中的的胍胍基基和和赖赖氨氨酸酸中中的的-氨氨基基等等），以以及及蛋蛋白白质质中

30、中游游离的氨基酸终端基团结合离的氨基酸终端基团结合. .未未结结合合的的染染色色剂剂与与样样品品中中蛋蛋白白质质的的含含量量成成反反比比, ,可用分光光度计法测定。可用分光光度计法测定。蛋白质分析PPT课件方法方法1样品粉碎（样品粉碎（60目或更小），加入过量的染色剂目或更小），加入过量的染色剂。2剧剧烈烈摇摇晃晃内内容容物物加加速速染染色色反反应应至至平平衡衡，过过滤滤或或离离心心去除不溶物。去除不溶物。3测测定定滤滤液液中中未未结结合合染染色色剂剂溶溶液液的的吸吸光光度度，从从标标准准曲曲线中计算染色剂浓度。线中计算染色剂浓度。4通通过过对对未未结结合合染染色色剂剂浓浓度度与与样样品品的的

31、蛋蛋白白质质总总氮氮含含量量作图，得到一条线性的标准曲线。作图，得到一条线性的标准曲线。5与与样样品品同同类类的的未未知知样样品品的的蛋蛋白白质质含含量量可可以以根根据据标标准准曲线计算，或通过最小二乘法得到的回归方程计算。曲线计算，或通过最小二乘法得到的回归方程计算。蛋白质分析PPT课件应用应用阴阴离离子子染染色色法法已已经经用用来来测测定定牛牛奶奶及及乳乳制制品品、小小麦面粉、大豆制品和肉制品中的蛋白质。麦面粉、大豆制品和肉制品中的蛋白质。AOAC中中共共有有二二种种染染色色方方法法（使使用用酸酸性性12号号橙橙的的 方方 法法 967.12和和 使使 用用 酰酰 胺胺 黑黑 10B的的

32、方方 法法975.17）分析牛奶中的蛋白质。）分析牛奶中的蛋白质。蛋白质分析PPT课件优点优点快快速速（10min或或更更短短），费费用用便便宜宜，结结果果相相对对比较准确。比较准确。因因为为染染色色剂剂不不与与不不可可利利用用的的赖赖氨氨酸酸结结合合，因因此此可可用用于于测测定定谷谷物物产产品品在在加加工工过过程程可可利利用用赖赖氨氨酸酸的的含含量量，（而而赖赖氨氨酸酸是是谷谷物物产产品品中中的的限限制制氨氨基基酸酸，所所以以可可利利用用赖赖氨氨酸酸含含量量代代表表谷谷物物产产品品的的蛋蛋白质营养价值。）白质营养价值。）不用腐蚀性试剂不用腐蚀性试剂。不需测定非蛋白氮。不需测定非蛋白氮。蛋白质

33、分析PPT课件缺点缺点灵敏度低灵敏度低，需要毫克级的蛋白质。，需要毫克级的蛋白质。蛋蛋白白质质因因基基本本氨氨基基酸酸不不同同而而具具有有不不同同的的染染色色容容量量，因因此此，对对于于待待测测食食品品需需要要制制作作标准曲线标准曲线。因一些非蛋白组份结合染色剂（如淀粉）因一些非蛋白组份结合染色剂（如淀粉）或蛋白质（如钙或磷）而造成最后结果或蛋白质（如钙或磷）而造成最后结果的偏差。钙和重金属离子引起的问题可的偏差。钙和重金属离子引起的问题可用含有草酸的缓冲试剂来解决。用含有草酸的缓冲试剂来解决。蛋白质分析PPT课件考马斯亮兰染料比色考马斯亮兰染料比色法法原理原理n 当考马斯亮兰当考马斯亮兰G-

34、250与蛋白质相结合时，与蛋白质相结合时，染色剂会从红色变成蓝色，其最大吸收波长染色剂会从红色变成蓝色，其最大吸收波长从从465nm变化至变化至620nm，在，在620nm处的处的吸光度与样品中蛋白质的浓度成正比。吸光度与样品中蛋白质的浓度成正比。蛋白质分析PPT课件方法方法将将考考马马斯斯亮亮兰兰G-250溶溶解解于于95%酒酒精精中中，并用并用85%磷酸酸化。磷酸酸化。含含有有蛋蛋白白质质（1100ug/ml）的的样样品品和和标准标准BSA溶液分别与溶液分别与Bradford试剂混合。试剂混合。在在595nm处读取吸光度并扣空白。处读取吸光度并扣空白。样品中的蛋白质浓度可通过样品中的蛋白质

35、浓度可通过BSA的标准的标准曲线来计算。曲线来计算。蛋白质分析PPT课件应用应用已已经经成成功功用用于于测测定定麦麦芽芽汁汁、啤啤酒酒产产品品和和马马铃铃薯薯块块茎茎中中的的蛋蛋白白质质含含量量。此此方方法法可可改改善善测测定定微微量量蛋蛋白白质质的的结结果果。该该法法快快速速、灵灵敏敏，且且比比福福林林酚酚法法较较少少受受其其他他因因素素干干扰扰，已已广广泛泛应应用用于于蛋蛋白白质质纯纯化化过过程程中中的的含量测定。含量测定。蛋白质分析PPT课件优点优点快速，反应可在快速，反应可在2min内完成。内完成。重现性好。重现性好。灵敏度高。灵敏度高。不受阳离子如不受阳离子如K+、Na+和和Mg+等

36、的干扰。等的干扰。不受硫酸铵干扰。不受硫酸铵干扰。不受多酚和碳水化合物干扰，如蔗糖等。不受多酚和碳水化合物干扰，如蔗糖等。可测定分子量大约等于或高于可测定分子量大约等于或高于40004000道尔顿的蛋道尔顿的蛋白质。白质。蛋白质分析PPT课件缺点缺点受受非非离离子子和和离离子子型型去去垢垢剂剂的的干干扰扰，如如三三硝硝基基甲甲苯苯 和和 十十 二二 烷烷 基基 硫硫 酸酸 钠钠 。 而而 由由 于于 少少 量量 的的（0.1%）去去垢垢剂剂的的存存在在而而导导致致的的结结果果偏偏差差可可用适当的控制来校正。用适当的控制来校正。蛋蛋白白质质-染染色色剂剂的的复复合合物物可可与与石石英英比比色色皿

37、皿结结合合，分析人员必须使用分析人员必须使用玻璃比色皿玻璃比色皿。反反应应颜颜色色随随不不同同种种类类的的蛋蛋白白质质而而变变化化，因因此此，必须仔细地选择作为标准的蛋白质。必须仔细地选择作为标准的蛋白质。蛋白质分析PPT课件比浊法比浊法原理原理低低浓浓度度（310%）的的三三氯氯乙乙酸酸、磺磺基基水水杨杨酸酸和和乙乙酸酸中中的的铁铁氰氰化化钾钾能能使使提提取取的的蛋蛋白白质质沉沉淀淀形形成成蛋蛋白白质质颗颗粒粒的的悬悬浊浊液液。其其浊浊度度可可由由辐辐射射光光传传送送过过程程中中的的衰衰减减而而确确定定，辐辐射射光光传传送送过过程程中中的的衰衰减减是是由由于于蛋蛋白白质质颗颗粒粒的的散散射射

38、造造成成的的，辐辐射射光光衰减的程度与溶液中的蛋白质浓度成正比。衰减的程度与溶液中的蛋白质浓度成正比。蛋白质分析PPT课件比浊法方法方法测测定定小小麦麦蛋蛋白白质质的的常常规规方方法法为为磺磺基基水水杨杨酸酸法，具体方法如下所述：法，具体方法如下所述：1小麦面粉用小麦面粉用0.05N氢氧化钠溶液萃取。氢氧化钠溶液萃取。2溶溶于于碱碱液液的的蛋蛋白白质质从从不不溶溶性性原原料料中中离离心心分离。分离。3磺基水杨酸和蛋白质溶液混合。磺基水杨酸和蛋白质溶液混合。4在在540nm处测定其浊度，并扣去空白。处测定其浊度，并扣去空白。5蛋白质的含量可根据经凯氏定氮法校正蛋白质的含量可根据经凯氏定氮法校正过

39、的标准曲线来计算。过的标准曲线来计算。蛋白质分析PPT课件比浊法应用应用 比比浊浊法法已已经经用用于于测测定定小小麦麦面面粉粉和和玉玉米米的的蛋蛋白质含量。白质含量。优点：优点：1快速，可在快速，可在15min内完成。内完成。2测定结果不包括除了核酸外的非蛋白氮。测定结果不包括除了核酸外的非蛋白氮。缺点：缺点：1不同的蛋白质沉淀的速率不同。不同的蛋白质沉淀的速率不同。2浊度随酸试剂浓度的不同而变化。浊度随酸试剂浓度的不同而变化。3.核酸也能被酸试剂沉淀。核酸也能被酸试剂沉淀。 蛋白质分析PPT课件杜马斯法（燃烧法）原理原理 样样品品在在高高温温下下（700800）燃燃烧烧，释释放放的的氮氮气气

40、由由带带热热导导检检测测器器（TCD）的的气气相相色色谱谱仪仪测测定定。测测得得的的氮氮含含量量转转换换成成样品中的蛋白质含量样品中的蛋白质含量。蛋白质分析PPT课件杜马斯法（燃烧法）方法方法样品（大约样品（大约100500mg）称量后置）称量后置于样品盒中，放入具有自动装置的燃烧于样品盒中，放入具有自动装置的燃烧反应器中，释放的氮气由内置的气相色反应器中，释放的氮气由内置的气相色谱仪测定。谱仪测定。 蛋白质分析PPT课件杜马斯法（燃烧法）应用应用燃燃烧烧法法适适用用于于所所有有种种类类的的食食品品，AOAC方方法法992.15和和992.23分别用于肉类和谷物食品。分别用于肉类和谷物食品。优

41、点：优点：1燃烧法是凯氏定氮法的一个替代方法。燃烧法是凯氏定氮法的一个替代方法。2不需要任何有害化合物。不需要任何有害化合物。3可在可在3min内完成。内完成。4最最先先进进的的自自动动化化仪仪器器可可在在无无人人看看管管状状态态下下分分析析多多达达150个样品。个样品。缺点：缺点：1需要的仪器价格昂贵。需要的仪器价格昂贵。2非蛋白氮也包括在内。非蛋白氮也包括在内。蛋白质分析PPT课件红外光谱法红外光谱法原理原理红外光谱法测定由食品或其他物质中分子红外光谱法测定由食品或其他物质中分子引起的辐射吸收（近红外、中红外、远红外区）引起的辐射吸收（近红外、中红外、远红外区）。食品中不同的功能基团吸收不

42、同频率的辐射。食品中不同的功能基团吸收不同频率的辐射。对于蛋白质和多肽，多肽键在中红外波段对于蛋白质和多肽，多肽键在中红外波段（6.47um6.47um）和近红外）和近红外(NIR)(NIR)波段波段 ( (如如330033003500nm,20802220nm,15601670nm)的特的特征吸收可用于测定食品中的蛋白质含量。针对征吸收可用于测定食品中的蛋白质含量。针对所要测的成份，用红外波长光辐射样品，通过所要测的成份，用红外波长光辐射样品，通过测定样品反射或透射光的能量（反比于能量的测定样品反射或透射光的能量（反比于能量的吸收）可以预测其成份的浓度。吸收）可以预测其成份的浓度。蛋白质分析

43、PPT课件红外光谱法应用应用 红红外外牛牛奶奶分分析析仪仪采采用用中中红红外外光光谱谱法法测测定定牛牛奶奶蛋蛋白白质质含含量量，同同时时近近红红外外光光谱谱仪仪也也广广泛泛应应用用于于食食品品蛋蛋白白质质的的分分析析中中（如如谷谷物物、谷谷类类制制品品、肉肉类类和和乳乳制制品品中中）。这这些些仪仪器器非非常常昂昂贵贵,且且必必须须经经适适当当的的调调试试。但但分分析析人人员员只只需需经经最最低低程程度度的的培培训训就就可可以快速分析样品以快速分析样品(30sec2min)。蛋白质分析PPT课件氨基酸的测定方法氨基酸的测定方法蛋白质分析PPT课件一、茚三酮比色法一、茚三酮比色法原理原理氨基酸（酰

44、氨键）在碱性溶液中能与茚三酮作氨基酸（酰氨键）在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物（除脯氨酸外均有此反用，生成蓝紫色化合物（除脯氨酸外均有此反应），可用吸光光度法测定。应），可用吸光光度法测定。该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长为比，其最大吸收波长为570570nmnm，故据可以测定故据可以测定样品中氨基酸含量。样品中氨基酸含量。蛋白质分析PPT课件应用应用常用来定性测定食品中蛋白质和氨基酸的存在。常用来定性测定食品中蛋白质和氨基酸的存在。茚茚三三酮酮法法还还没没有有广广泛泛应应用用于于食食品品中中蛋蛋白白质质的的定定量量

45、，然然而而可可用用来来测测定定食食品品加加工工中中多多肽肽键键的的水水解解和氨基酸的定量。和氨基酸的定量。比比较较快快速速，但但准准确确性性较较低低，反反应应生生成成的的颜颜色色随随不不同同的的氨氨基基酸酸化化合合物物而而变变化化。标标准准曲曲线线必必须须针针对每一个具体情况而准备。对每一个具体情况而准备。蛋白质分析PPT课件二、甲醛滴定法二、甲醛滴定法原理原理氨基酸具有酸性的氨基酸具有酸性的-COOH基和碱性的基和碱性的-NH2基。基。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，加入甲醛溶液时，-NH2基与甲醛结合，从而基与甲醛结合，从而使

46、其碱性消失。这样就可以用强碱标准溶液来使其碱性消失。这样就可以用强碱标准溶液来滴定滴定-COOH基，并用间接的方法测定氨基酸基，并用间接的方法测定氨基酸总量。总量。蛋白质分析PPT课件方法特点及应用方法特点及应用此法简单易行、快速方便。此法简单易行、快速方便。在发酵工业中常用此法测定发酵液中氨基氮含在发酵工业中常用此法测定发酵液中氨基氮含量的变化，以了解可被微生物利用的氮源的量量的变化，以了解可被微生物利用的氮源的量及利用情况，并以此作为控制发酵生产的指标及利用情况，并以此作为控制发酵生产的指标之一。之一。脯氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物，使脯氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物，使结果偏低

47、；酪氨酸含有酚羧基，滴定时也会消结果偏低；酪氨酸含有酚羧基，滴定时也会消耗一些碱而致使结果偏高；溶液中若有铵存在耗一些碱而致使结果偏高；溶液中若有铵存在也可与甲醛反应，往往使结果偏高。也可与甲醛反应，往往使结果偏高。蛋白质分析PPT课件操作方法操作方法吸取含氨基酸约吸取含氨基酸约2020mgmg的样品溶液于的样品溶液于100100mlml容量容量瓶中，加水至标线，混匀后吸取瓶中，加水至标线，混匀后吸取20.020.0mlml置于置于200200mlml烧杯中，加水烧杯中，加水6060mlml，开动磁力搅拌器，开动磁力搅拌器，用用0.050.05mol/lmol/l氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计氢

48、氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示指示pH8.2pH8.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液记录消耗氢氧化钠标准溶液mlml数数（V V1010），），供计算总含量。供计算总含量。加入加入10.010.0mlml甲醛溶液，混匀。再用上述氢氧化甲醛溶液，混匀。再用上述氢氧化钠标准溶液继续滴定至钠标准溶液继续滴定至pH9.2pH9.2，记录消耗氢氧记录消耗氢氧化钠标准溶液体积（化钠标准溶液体积（V V1111）。）。蛋白质分析PPT课件同时取同时取80ml80ml蒸馏水置于另一蒸馏水置于另一200ml200ml洁净烧瓶中，洁净烧瓶中，先用氢氧化钠标准溶液调至先用氢氧化钠标准溶液调至PH8.2PH8.2，（此时

49、不，（此时不计碱消耗量），再加入计碱消耗量），再加入10.0ml10.0ml中性甲醛溶液，中性甲醛溶液，用用0.05mol/l0.05mol/l氢氧化钠标准溶液滴定至氢氧化钠标准溶液滴定至pH9.2pH9.2，作为试剂空白试验。作为试剂空白试验。蛋白质分析PPT课件结果计算结果计算氨基酸态氮（氨基酸态氮（%）=式中：式中：V V1 1（V V1111-V-V1010）样品稀释液在加入甲醛后滴定至样品稀释液在加入甲醛后滴定至终点（终点（PH9.2PH9.2）所消耗氢氧化钠标准溶液的体积，）所消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mlml； V V2 2空白试验加入甲醛后滴定至终点所消耗的氢空白试验加入甲醛

50、后滴定至终点所消耗的氢氧化钠标准溶液的体积，氧化钠标准溶液的体积，mlml； c c氢氧化钠标准溶液的浓度，氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/lmol/l； m m测定用样品溶液相当于样品的质量测定用样品溶液相当于样品的质量.g.g； 0.014 0.014氮的毫摩尔质量，氮的毫摩尔质量，g/mmolg/mmol。蛋白质分析PPT课件说明及注意事项说明及注意事项也可用双指示剂法指示终点。也可用双指示剂法指示终点。此法准确快速，适用于测定食品中游离氨基酸。此法准确快速，适用于测定食品中游离氨基酸。固体样品应先进行粉碎，准确称样后用水萃取，固体样品应先进行粉碎，准确称样后用水萃取，然后测定萃取液；液

51、体试样如酱油、饮料等可然后测定萃取液；液体试样如酱油、饮料等可直接吸取试样进行测定。直接吸取试样进行测定。若样品颜色较深或浑浊需用若样品颜色较深或浑浊需用电位滴定法电位滴定法进行测进行测定。定。蛋白质分析PPT课件氨基酸的分离及测定氨基酸的分离及测定薄层色谱法薄层色谱法氨基酸自动分析仪法氨基酸自动分析仪法气相色镨法气相色镨法液相色谱法液相色谱法蛋白质分析PPT课件薄层色谱法薄层色谱法原理原理取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层板取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、

52、交换组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等作用，同一物质具有相同的等作用，同一物质具有相同的Rf值，不同成分则值，不同成分则有不同的有不同的Rf值，因而各种氨基酸可达到彼此分离值，因而各种氨基酸可达到彼此分离的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，即可鉴别样品中所含氨基酸的种类，从显对比，即可鉴别样品中所含氨基酸的种类，从显色斑点颜色的深浅可大致确定其含量。色斑点颜色的深浅可大致确定其含量。蛋白质分析PPT课件氨基酸自动分析仪法氨基酸自动分析仪法氨基酸的组分分析，现代广泛的采用氨基酸的组分分析，现代广泛的采用离子交换法离子交换法，并，并由

53、自动化的仪器来完成。由自动化的仪器来完成。原理原理：利用各种氨基酸的酸碱性、极性和分子量大小：利用各种氨基酸的酸碱性、极性和分子量大小不同等性质，使用阳离子交换树脂在色谱柱上进行分不同等性质，使用阳离子交换树脂在色谱柱上进行分离。当样液加入色谱柱顶端后，采用不同的离。当样液加入色谱柱顶端后，采用不同的peyaH值值和离子浓度的缓冲溶液即可将它们依次洗脱下来，即和离子浓度的缓冲溶液即可将它们依次洗脱下来，即先是酸性氨基酸和极性较大的氨基酸，其次是非极性先是酸性氨基酸和极性较大的氨基酸，其次是非极性的芳香性氨基酸，最后是碱性氨基酸；分子量小的比的芳香性氨基酸，最后是碱性氨基酸；分子量小的比分子量大

54、的先被洗脱下来，洗脱下来的氨基酸可用茚分子量大的先被洗脱下来，洗脱下来的氨基酸可用茚三酮显色，从而定量各种氨基酸。三酮显色，从而定量各种氨基酸。定量测定的依据：定量测定的依据：氨基酸和茚三酮反应生成蓝紫色化氨基酸和茚三酮反应生成蓝紫色化合物的颜色深浅与各有关氨基酸的含量成正比。但脯合物的颜色深浅与各有关氨基酸的含量成正比。但脯氨酸和羟脯氨酸则生成黄棕色化合物，故需在另外波氨酸和羟脯氨酸则生成黄棕色化合物，故需在另外波长处定量测定。长处定量测定。蛋白质分析PPT课件氨基酸分析仪有两种，一种是低速型，使用氨基酸分析仪有两种，一种是低速型，使用300400目的离子交换树脂；另一种是高速目的离子交换树

55、脂；另一种是高速型，使用直径型，使用直径46um的树脂。不论哪一种，的树脂。不论哪一种，在分析组成蛋白质的各种氨基酸时，都用柠檬在分析组成蛋白质的各种氨基酸时，都用柠檬酸缓冲液；完全分离和定量酸缓冲液；完全分离和定量4046种游离氨种游离氨基酸时，则使用柠檬酸锂缓冲液。但分析后者基酸时，则使用柠檬酸锂缓冲液。但分析后者时，由于所用缓冲液种类多，柱温也要变为三时，由于所用缓冲液种类多，柱温也要变为三个梯度，因此一般不能用低速型。个梯度，因此一般不能用低速型。蛋白质分析PPT课件气相色镨法气相色镨法原理原理将本身没有挥发性的氨基酸转变为适合将本身没有挥发性的氨基酸转变为适合于气相色镨分析的衍生物于

56、气相色镨分析的衍生物三氟酰基三氟酰基正丁酯。它包括用正丁醇的酯化合用三正丁酯。它包括用正丁醇的酯化合用三氟乙酸酐（氟乙酸酐（TFFAA）的酰化两各步骤。）的酰化两各步骤。将酰化好的氨基酸衍生物进行气相色镨将酰化好的氨基酸衍生物进行气相色镨分析。分析。蛋白质分析PPT课件液相色谱法液相色谱法原理原理蛋白质样品经酸或碱水解后再用丹磺酰蛋白质样品经酸或碱水解后再用丹磺酰氯进行衍生化作用而溶解于流动相溶液氯进行衍生化作用而溶解于流动相溶液中，采用中，采用C8反相柱的高压液相色镨仪分反相柱的高压液相色镨仪分离并用荧光检测器进行测定，即可测定离并用荧光检测器进行测定，即可测定出各种氨基酸的含量。出各种氨基

57、酸的含量。蛋白质分析PPT课件方法的比较方法的比较样品的比较样品的比较原理原理灵敏性灵敏性速度速度蛋白质分析PPT课件1样品的比较：采采用用凯凯氏氏定定氮氮法法和和红红外外光光谱谱法法则则样样品品几几乎乎不不需需要要多多加加处处理理，20目目或或更更小小的的颗颗粒粒一一般般都都可可以以满满足足这这些些测测定定方方法法的的要要求求，一一些些更更新新型型的的NIR仪仪能能够够直直接接测测定定不不经经磨磨碎碎或或其其他他方方法法处处理理的的完完整整的的谷谷物物，以以及及其其他他粗粗糙糙的的颗颗粒粒产产品品。本本章章中中介介绍绍的的其其他他方方法法则则要要求求原原料料必必须须是是微微小小的的颗颗粒粒，

58、以便于从复杂的食品体系中抽提蛋白质。以便于从复杂的食品体系中抽提蛋白质。蛋白质分析PPT课件2原理：杜杜马马斯斯法法和和凯凯氏氏定定氮氮法法直直接接测测定定食食品品中中有有机机氮氮元元素素的的总总量量。其其他他方方法法测测定定蛋蛋白白质质的的各各种种性性质质，例例如如，双双缩缩脲脲测测定定多多肽肽键键，福福林林酚酚法法测测定定多多肽肽键键、酪酪氨氨酸酸和和色色氨氨酸酸，红红外外光光谱谱法法利利用用样样品品特特别别是是多多肽肽键键经经红红外外波波长长的的光光辐辐射射时时的的能能量量吸吸收收直直接测定蛋白质含量接测定蛋白质含量。蛋白质分析PPT课件3灵敏性：凯凯氏氏定定氮氮法法、杜杜马马斯斯法法、

59、双双缩缩脲脲法法和和阴阴离离子子染染色色法法的的灵灵敏敏度度低低于于紫紫外外测测定定法法、福林酚法、福林酚法、BCA法或法或Bradford法。法。蛋白质分析PPT课件4速度：在在仪仪器器经经适适当当的的调调试试后后，红红外外光光谱谱法法可可能能是是上上述述讨讨论论过过的的最最为为快快速速的的方方法法。在在涉涉及及到到比比色色测测定定的的方方法法中中，在在和和显显色色试试剂剂混混合合前前，必必须须把把蛋蛋白白质质从从干干扰扰实实验验的的不不溶溶性性物物质质中中分分离离出出来来，或或者者在在混混和和后后从从显显色色的的蛋蛋白白质质-试试剂剂复复合合物物中中除除去去不不溶溶性性物物质质，但但是是比

60、比色色法法的的测测定定速速度度还还是是快快于于凯氏定氮法凯氏定氮法。蛋白质分析PPT课件特殊的注意事项1针针对对具具体体的的应应用用、灵灵敏敏度度、精精确确度度、重重现现性性以以及及食食品品的的物物化化性性质质来来考考虑虑选选择择适适用用的的测测定定方法。方法。2食食品品加加工工方方法法，如如加加热热可可能能会会减减弱弱分分析析时时蛋蛋白白质质萃萃取取的的能能力力，从从而而在在涉涉及及萃萃取取的的步步骤骤时时会导致蛋白质含量的测定偏低。会导致蛋白质含量的测定偏低。3.3.除了凯氏定氮法和紫外测定法，其他所有方除了凯氏定氮法和紫外测定法，其他所有方法对纯化蛋白质的测定都需要使用标准或参比法对纯化

61、蛋白质的测定都需要使用标准或参比蛋白质，样品中的蛋白质必须与标准蛋白质具蛋白质，样品中的蛋白质必须与标准蛋白质具有相似的结构和性质有相似的结构和性质蛋白质分析PPT课件特殊的注意事项4. 4. 非蛋白氮存在于所有食品中。要测定蛋白非蛋白氮存在于所有食品中。要测定蛋白氮，样品通常先要在碱性条件下萃取蛋白质，氮，样品通常先要在碱性条件下萃取蛋白质，然后用三氯醋酸或磺基水杨酸沉淀。酸的使用然后用三氯醋酸或磺基水杨酸沉淀。酸的使用浓度影响沉淀得率，因此，非蛋白氮的含量随浓度影响沉淀得率，因此，非蛋白氮的含量随所用试剂的种类和浓度而变化。加热能够帮助所用试剂的种类和浓度而变化。加热能够帮助酸、乙醇或其他

62、有机溶剂沉淀蛋白质。除了酸酸、乙醇或其他有机溶剂沉淀蛋白质。除了酸沉淀法用于非蛋白质的测定外，其他较少数方沉淀法用于非蛋白质的测定外，其他较少数方法如透析、超滤和柱色谱法也能从含少量非蛋法如透析、超滤和柱色谱法也能从含少量非蛋白组分的物质中分离得到蛋白质白组分的物质中分离得到蛋白质。 蛋白质分析PPT课件特殊的注意事项5.5.在测定食品蛋白质的营养价值如蛋白质消化在测定食品蛋白质的营养价值如蛋白质消化率和蛋白质功效比（率和蛋白质功效比（PERPER）时，凯氏定氮法采）时，凯氏定氮法采用用6.256.25的换算系数来计算蛋白质的含量。如果的换算系数来计算蛋白质的含量。如果相当数量的非蛋白氮存在于

63、食品中相当数量的非蛋白氮存在于食品中, , 测得的测得的PERPER值就可能会偏低。如果食物样品中的非蛋值就可能会偏低。如果食物样品中的非蛋白氮含量较高（特别是如果非蛋白氮不含许多白氮含量较高（特别是如果非蛋白氮不含许多氨基酸或者小肽），所得到的氨基酸或者小肽），所得到的PERPER值可能会低值可能会低于含有相似的蛋白质结构成份，但非蛋白氮含于含有相似的蛋白质结构成份，但非蛋白氮含量较低的样品的量较低的样品的PERPER值。值。蛋白质分析PPT课件总结本本章章介介绍绍了了基基于于蛋蛋白白质质和和氨氨基基酸酸的的特特性性来来测测定定蛋蛋白白质质的的方方法法，其其中中杜杜马马斯斯法法和和凯凯氏氏定

64、定氮氮法法测测定定氮氮含含量量，双双缩缩脲脲法法和和福福林林酚酚法法利利用用铜铜-肽肽键键的的反反应应来来分分析析，紫紫外外280nm比比色色法法、染染色色法法、茚茚三三酮酮法法和和福福林林酚酚法法涉涉及及到到了了氨氨基基酸酸性性质质。BCA法法利利用用蛋蛋白白质质在在碱碱性性溶溶液液中中的的还还原原性性，红红外外光光谱谱法法则则基基于于多多肽肽对对红红外外波波长长光光辐辐射射的的吸吸收收性质。不同方法的分析速度和灵敏度各不相同。性质。不同方法的分析速度和灵敏度各不相同。不不同同食食品品体体系系的的复复杂杂性性导导致致各各种种蛋蛋白白质质分分析析方方法法都都会会有有一一些些问问题题。通通常常都都要要使使用用经经选选择择的的蛋蛋白质作为标准（如凯氏定氮）方法校正。白质作为标准（如凯氏定氮）方法校正。蛋白质分析PPT课件