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1、质粒质粒DNA的提取的提取纯化与鉴定纯化与鉴定 一、基因克隆的质粒载体一、基因克隆的质粒载体1 1、定义、定义 双链闭环DNA； 1kb-200kb； 独立存在于宿主染色体之外； 具复制起始点； 复制和转录不同程度依赖于宿主基因； 编码某些酶，使宿主具有特殊标志， 可供选择。2 2、载体性质、载体性质 （1）.复制能力； （2）.容纳外源DNA的能力； （3）.选择标记：抗生素耐受。 （4）.引入多克隆位点； （5）.引入重组选择标记。3 3、载体分类：、载体分类： 按功能分 1.克隆载体 2.表达载体 按宿主性质 1.原核载体:质粒载体、粘粒、噬 菌粒、 噬菌体、噬菌体M13等 2.真核载体
2、:逆转录病毒、腺病毒、 昆虫杆状病毒 3.穿梭载体 4 4、常用质粒载体、常用质粒载体 例如：1. pBR322、pUC 18/19、 pUC118/119、pGEM、 pBluescript、 pBluescript SK/KS等 2. pET、pGEMEX、pGEX等 3. pALTER等 5 5、常用质粒宿主、常用质粒宿主： HB101、DH5、TG1、JM系列等 BL21（DE3）等二、质粒二、质粒DNADNA的分离纯化的分离纯化试剂的参考配方试剂的参考配方: :vSolution ISolution I：50mmo150mmo1L L 葡萄糖、葡萄糖、5mmo15mmo1L L 三羟
3、甲基氨基三羟甲基氨基甲烷甲烷(Tris)Tris(Tris)Tris HCl(pH8.0)HCl(pH8.0)、1.0 mmo11.0 mmo1L L 乙二胺四乙乙二胺四乙酸酸(EDTA)(pH8.0)(EDTA)(pH8.0)vSolution IISolution II：0.4mo10.4mo1L Na0HL Na0H，2 2SDS(SDS(十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠) )，用前等体积混合，用前等体积混合vSolution IIISolution III：5mo15mo1L L 醋酸钾醋酸钾 60 60 mLmL、冰乙酸、冰乙酸 11.5mL11.5mL、水水 28.5mL28.5mLv
4、TETE缓冲液：缓冲液：10mmo110mmo1L L TrisTris HClHCl、1mmo11mmo1L EDTA(pH8.0)L EDTA(pH8.0)（一）、细菌培养物的生长和收获（一）、细菌培养物的生长和收获 将将3mL3mL含含AmpAmp的的LBLB液体培养基加入到两支试管中，接入含液体培养基加入到两支试管中，接入含重组质粒的大肠杆菌，重组质粒的大肠杆菌，3737振荡培养过夜振荡培养过夜。 （二）、质粒（二）、质粒DNADNA的提取的提取1 1将过夜培养的将过夜培养的2-4m12-4m1细菌，细菌，12,000rpm12,000rpm高速离心高速离心1 1分钟，分钟，彻底去除上
5、清。彻底去除上清。( (菌液较多时可以多次离心收集菌体菌液较多时可以多次离心收集菌体) )2 2加入加入200 200 l solution I l solution I，用枪头或振荡器充分悬浮，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。（注：细菌。（注：Solution ISolution I内含内含RNaseARNaseA，每次实验结束后，每次实验结束后，44保存。）保存。）3 3加入加入250 250 l Solution II l Solution II，立即轻柔上下颠倒离心，立即轻柔上下颠倒离心管管5-105-10次，使细菌裂解，室温放置次，使细菌裂解，室温放置(2-5(2-5分钟左右分钟左右)
6、)至溶至溶液变成澄清。（注：温度低时，液变成澄清。（注：温度低时，SoluionSoluion II II有白色沉淀有白色沉淀析出，析出，3737度以下保温溶解，摇匀后使用。）度以下保温溶解，摇匀后使用。）4 4加入加入350 350 l Solution III l Solution III，立即轻柔上下颠倒，立即轻柔上下颠倒5-105-10次至出现大量白色絮状沉淀，使之充分中和，室温放置次至出现大量白色絮状沉淀，使之充分中和，室温放置2 2分钟。分钟。5 512,000rpm12,000rpm高速离心高速离心1515分钟。分钟。6 6取出取出2ml2ml样品收集管和吸附柱，在管壁标上样品号
7、，将样品收集管和吸附柱，在管壁标上样品号，将步骤步骤5 5中的上清小心吸取全部转移到吸附柱里。中的上清小心吸取全部转移到吸附柱里。12,000rpm12,000rpm离心离心1 1分钟。分钟。7 7取下吸附柱，弃去掉收集管中的废液，将吸附柱放入取下吸附柱，弃去掉收集管中的废液，将吸附柱放入同一支收集管中，吸取同一支收集管中，吸取700 700 l Wash Solution l Wash Solution到吸附柱，到吸附柱，离心离心1 1分钟。分钟。8 8重复步骤重复步骤7 7一次。一次。9 9取下吸附柱，弃去掉收集管中的废液，将柱放入同取下吸附柱，弃去掉收集管中的废液，将柱放入同支收集管中，
8、支收集管中，12,000rpm12,000rpm高速离心高速离心2 2分钟。分钟。1010将吸附柱放入干净的将吸附柱放入干净的1 15m15m1的离心管中，在柱子膜中的离心管中，在柱子膜中央加央加30-50 30-50 l TE l TE或灭菌纯水，不要盖上离心管盖，室温或灭菌纯水，不要盖上离心管盖，室温下放置下放置2 2分钟；盖上离心管盖，室温分钟；盖上离心管盖，室温12,000rpm12,000rpm高速离心高速离心1 1分钟。分钟。注意：将注意：将TETE或水预热到或水预热到5050左右可以提高洗脱效率。左右可以提高洗脱效率。1111取取1-21-2 l l洗脱液做浓度测定，洗脱液做浓度
9、测定，1%1%琼脂糖凝胶电泳或琼脂糖凝胶电泳或酶切分析。酶切分析。三、质粒三、质粒DNA的鉴定的鉴定（一）、紫外光谱分析（一）、紫外光谱分析 通常使用样品的吸光度鉴定其浓度和通常使用样品的吸光度鉴定其浓度和纯度。纯度。（二）、（二）、EBEB荧光分析荧光分析（三）、电泳鉴定（三）、电泳鉴定 在凝胶电泳中，在凝胶电泳中，DNADNA分子的迁移速度与分子的迁移速度与分子量的对数值成反比关系。质粒分子量的对数值成反比关系。质粒DNADNA经经单一酶切后与单一酶切后与DNA MarkerDNA Marker进行电泳对照，进行电泳对照，即可知该质粒的分子量大小。即可知该质粒的分子量大小。质粒的电泳图谱质
10、粒的电泳图谱 质粒质粒DNA的鉴定和酶切分析的鉴定和酶切分析 一、质粒的琼脂糖凝胶电泳鉴定一、质粒的琼脂糖凝胶电泳鉴定二、质粒的限制性内切酶消化鉴定二、质粒的限制性内切酶消化鉴定 实验原理实验原理 DNA分子在高于等电点的分子在高于等电点的pH 溶液中带负溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量碱基的双链架在结构上的重复性质，相同数量碱基的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。样的速度向正极方向移动。 在一定的电场强度下，在一定的电场强度下，DNA分子
11、的迁移速分子的迁移速度取决于分子本身的大小和构型，迁移速度与度取决于分子本身的大小和构型，迁移速度与DNA分子量的对数值成反比关系。分子量的对数值成反比关系。一般提取的质粒有一般提取的质粒有3种构型：种构型：超螺旋的共价闭合环状超螺旋的共价闭合环状开环开环DNA，即共价闭合环状质粒，即共价闭合环状质粒DNA有一有一条链断裂条链断裂线状质粒线状质粒DNA， 即质粒即质粒DNA 在同一处两在同一处两条链都发生断裂。条链都发生断裂。通常抽提的质粒在电泳后往往出现通常抽提的质粒在电泳后往往出现3条带，条带，其中超螺旋质粒其中超螺旋质粒DNA泳动最快，泳动最快，其次为线状其次为线状DNA，最慢的为开环质
12、粒最慢的为开环质粒DNA。 实验步骤实验步骤1、制备1琼脂糖凝胶：称取1 g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入100mL 1TAE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀。2、胶板的制备 1） 选择适当大小干净的有机玻璃内槽，放好样品梳子。2）将冷到60左右的琼脂糖凝胶液，加入3-5l EB储存液（2mg/mL）摇匀，缓缓倒入有机玻璃制胶槽内，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)。3）待胶凝固后，小心地拔出梳子，将有机玻璃内槽放在电泳槽内。注意：DNA样品孔应朝向负电极一端。4）加电泳缓冲液至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面1-1.5毫米。3、加样用移液枪将已加入上样缓冲液的D
13、NA样品（5l质粒+1l 6 loading buffer)加入加样孔(记录点样顺序及点样量)。4、电泳1）接通电泳槽与电泳仪的电源。DNA的迁移速度与电场强度成正比，一般电场强度不要超过5Vcm。2）当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿12cm处，停止电泳。 限制性内切酶限制性内切酶1. 定义：识别双链定义：识别双链DNA分子核苷酸序列分子核苷酸序列 并加以切开并加以切开2. 来源：细菌的限制修饰系统来源：细菌的限制修饰系统3. 特性：识别特性：识别4 6个核苷酸序列个核苷酸序列 产生平端和粘端产生平端和粘端4. 应用：定点切割应用：定点切割 酶切产生的末端酶切产生的末端（1 1） G A TG A
14、 TA T CA T C C T AC T AT A GT A G EcoREcoR酶切产生平端酶切产生平端 G A T G A T P PA T CA T C C T AC T AP P T A G T A G（2 2） G GA A T T CA A T T C C T T A AC T T A AG G EcoREcoR酶切产生酶切产生5 5突出粘端突出粘端 G G P PA A T T CA A T T C C T T A AC T T A AP P G G (3 (3） C T G C AC T G C AG G G GA C G T CA C G T C PstPst酶切产生酶切产
15、生3 3突出粘端突出粘端 C T G C A C T G C A P PG G G GP P A C G T C A C G T C 酶切反应酶切反应限制性内切酶反应一般在灭菌的限制性内切酶反应一般在灭菌的0.5ml0.5ml离心管中进行。离心管中进行。20l20l体积反应体系体积反应体系如下：如下： A: A: 质粒（质粒（pGEMpGEM-T easy-NGF-T easy-NGF） 0.2-1 0.2-1 gg B: 10 B: 10酶切酶切buffer 2.0lbuffer 2.0l C: C:限制性内切酶限制性内切酶 EcoREcoR 0.5l 0.5l D: D: 加加ddHddH2 2O O 至至20l20l3737水浴消化水浴消化1 1小时。小时。 质粒的酶切电泳质粒的酶切电泳 M1 1 2 3 M2 注意事项注意事项购买的限制性内切酶多保存于50%甘油中，于-20是稳定的。进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后即混匀，再从-20冰箱中取出酶，立即放置于冰上。每次取酶时都应更换一个无菌吸头，以免酶被污染。加酶的操作尽可能快，用完后立即将酶放回-20冰箱。尽量减少反应体积，但要确保酶体积不超过反应总体积的10%，否则酶活性将受到甘油的抑制。通常延长时间可使所需的酶量减少，在切割大量DNA时可用。在消化过程中可取少量反应液进行微量凝胶电泳以检测消化进程。
