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1、第五章第五章 固定化酶与固定化细胞固定化酶与固定化细胞第一节第一节酶的固定化酶的固定化一、固定化酶一、固定化酶（immobilizedenzyme）：是指在一定空间内呈闭锁状态闭锁状态存在的酶，能连续进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。优点：极易将固定化酶与底物、产物分开，简化了提纯工艺，提高酶的使用效率；在大多数情况下，能够提高酶的稳定；可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应；酶反应过程能够加以严格控制；较游离酶更适合于多酶反应。泵泵储罐反应产物离心机离心机消消旋旋反反应应器器固定化酶柱子晶体L-AlaL-AlaA-D-AlaA-L-AlaA-D-Ala1物理吸附法酶被物理吸附于不
2、溶性载体的一种固定化方法。常用载体：活性碳、氧化铝、硅胶、淀粉、纤维素、树脂。优点：操作简单，酶活性中心不易被破坏和酶高级结构变化少，酶活力损失很少。缺点：酶与载体相互作用力弱、酶易脱落等。二二、固定化方法、固定化方法2离子结合法离子结合法酶通过离离子子键键结合于具有离子交换剂的水不溶性载体的固定化方法。常用载体：各种阴、阳离子交换剂。 如如CM-CM-纤纤维素、维素、DEAE-DEAE-纤维素、纤维素、DEAE-DEAE-葡聚糖凝胶等葡聚糖凝胶等优点：操作简单，酶活性中心不易被破坏和酶高级结构变化少，酶活力损失很少。缺点：载体和酶的结合力比较弱，酶易脱落。3.共价结合法共价结合法酶与载体以共
3、价键结合的固定化方法。将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶联反应。在载体上接上一个双功能试剂（常用的如戊二醛），然后将酶偶联上去。优点：酶与载体结合牢固，不易轻易脱落。缺点：反应条件苛刻，操作复杂，易引起酶蛋白高级结构变化，破坏部分活性中心。常用载体：多糖、多孔玻璃、聚酯、聚胺、尼龙等酶的功能团有：氨基或、羧基、巯基、羟基、咪唑基、酚基等。常用的活化方法：常用的活化方法：1）重氮化法：载体：含有芳香族氨基。酶的反应基团：游离氨基、咪唑基、酚基等。2）溴化氰法：载体：含羟基，即多糖类物质。酶的反应基团：氨基3 3）叠氮法）叠氮法对含有羧基的载体，与肼作用生成含有酰肼的载体，再与亚硝酸活化，
4、生成叠氮化合物。最后于酶偶联。4交联法交联法用双功能或多功能试剂使酶与酶之间交联的固定化方法。不使用载体常用的交联剂：戊二醛、异氰酸酯、双重氮联苯胺等。酶的反应基团：N末端的-氨基或赖氨酸-氨基、酚基、巯基和咪唑基等。优点：结合牢固，可以长时间使用缺点：因交联反应激烈，酶分子多个基团被交联，酶活损失大，颗粒较小，机械强度差，使用不便。5.包埋法包埋法酶分子包埋在高分子凝胶或高分子半透膜中。载体：聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、淀粉、明胶、胶原、海藻酸和卡拉胶等高分子化合物网格型网格型微囊型微囊型 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺： 丙烯酰胺单体、交联剂和悬浮在缓冲溶液中的酶混合，然后加入聚合催化系统使之开始聚合，结
5、果就在酶分子周围形成交联的高聚物网络。海藻酸钠：海藻酸钠： 可被多价离子Ca2+、Al3+凝胶化 。卡拉胶：卡拉胶： 冷却成胶或与二、三价金属离子成胶。优点：很少改变酶的局级结构，酶活回收率较高。缺点：有时酶也易失活，只适合作用于小分子底物和产物的酶。三、固定化酶的性质三、固定化酶的性质(一一)固定化后酶活力的变化固定化后酶活力的变化固定化酶的活力在多数情况下比天然酶小。原因：酶分子在固定化过程中，空间构象会有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；固定化后，空间位阻会直接影响到活性中心对底物的定位作用；扩散阻力使底物分子与酶的接近受阻；(二二)固定化对酶稳定性的影响固定化对酶稳定性的影响1固定化
6、酶表现在热稳定性提高；2对各种有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高。3对不同pH稳定性、对蛋白酶稳定性、贮存稳定性和操作稳定性都有提高。青霉素酰化酶于不同温度下保温青霉素酰化酶于不同温度下保温6小时小时稳定性提高的原因：稳定性提高的原因：固定化后酶分子与载体多点连接，可防止酶分子伸展变形。酶活力的缓慢释放。抑制蛋白酶的降解,阻挡了外界不利因素对酶的侵袭.（三）固定化酶的最适温度变化（三）固定化酶的最适温度变化最适温度提高。（四）固定化酶的最适（四）固定化酶的最适pH变化变化对底物作用的最适pH和酶活力-pH曲线常常发生偏移。原因：微环境表面电荷性质的影响。带负电荷载体：最适pH较游离酶偏高，即向碱性
7、偏移。带正电荷的载体：最适pH向酸性偏移。(五五)固定化酶的米氏常数固定化酶的米氏常数(Km)变化变化中性载体：固定化酶的表观Km值上升。载体与底物电荷相同：表观Km值显著上升；载体与底物电荷相反：Km？四、影响固定化酶性能的因素四、影响固定化酶性能的因素1构象改变、立体屏蔽构象改变、立体屏蔽构象改变：指固定化过程及酶和载体的相互作用，引起了酶的活性中心构象发生改变，从而导致酶活性改变的种效应。立体屏蔽立体屏蔽：指由于载体的孔径太小，或是由于固定化的方式与位置不当，给酶的活性中心或/和调节中心造成了空间障碍，底物与效应物等无法直接和酶接触，从而影响酶活性的一种效应。2分配效应和扩散限制效应分配
8、效应和扩散限制效应分配效应：是由于固定化载体所带电荷及的亲、疏水性、使酶的底物、产物以及其他效应物在微观环境与宏观体系间发生了不等分配，改变了酶反应系统的组成平衡，从而影响酶反应速度的一种因素。扩散限制效应扩散限制效应：指底物、产物以及其他效应物的迁移和运转速度受到限制的一种效应。外扩散限制：外扩散限制：指上述物质从宏观体系穿过包围在固定化酶颗粒周围的近乎停滞的液膜层(Nernst层)到颗粒表面所受的限制。内扩散限制：内扩散限制：指上述物质从颗粒表面到颗粒内部酶所在位点所受到的限制。第二节第二节评价固定化酶评价固定化酶(细胞细胞)的指标的指标一、固定化酶(细胞)的活力固定化酶(细胞)催化某一特
9、定化学反应的能力。活力单位：定义为每毫克干重固定化酶(细胞)每分钟转化底物(或生产产物)的量，表示为molmolminmin-1-1mgmg-1-1。如是酶膜、酶管、酶板，则以单位面积的反应初速度来表示即molmin-1cm-2。二、偶联率二、偶联率：载体结合酶量（或酶活）的百分数三、活力回收和相对活力三、活力回收和相对活力活力回收：固定化酶活力占溶液酶活力的百分数相对活力：固定化酶活力与同量蛋白量的溶液酶活力的比值四、固定化酶（细胞）的半衰期四、固定化酶（细胞）的半衰期t1/2：固定化酶（细胞）的活力下降为最初活力1/2所经历的连续工作时间；衡量操作稳定性的指标。Fig.2.Kinetico
10、fROLadsorptiononthesilicaaerogels.TheactivitywasmeasuredusingoliveoilemulsionassubstrateatpH8.5and37C.ImmobilizationofRhizopus oryzaelipaseonsilicaaerogelsbyadsorption:ComparisonwiththefreeenzymePore size of macroporous polystyrene microspheres affects lipase immobilizationFig.4.EffectofpHonthe(A)ac
11、tivityand(B)stabilityofthefreeandimmobilizedROL.Enzymesactivitieswereassayedat37Cusing10mloliveoilemulsionassubstrate.Enzymeswereincubated1hatdifferentpHforstabilitystudy.ImmobilizationofRhizopus oryzaelipaseonsilicaaerogelsbyadsorption:Comparisonwiththefreeenzyme第三节辅酶的固定化1.需辅酶的酶的固定化直接将酶蛋白共价结合于载体，向反
12、应系统补充辅酶。将辅酶固定化，然后将酶蛋白亲和吸附上去；将酶蛋白和辅酶共固定化；辅酶直接偶联于酶上制成酶辅酶络合物，2辅酶的固定化载体结合法辅酶分子本身具备不参与催化活性的的功能团；引入适当的功能团（羧基、氨基）包埋法需高分子化。磷酸吡哆醛的偶联基团NAD(P)的偶联基团3辅酶物质的再生及偶联酶系的固定化辅酶物质的再生及偶联酶系的固定化独立进行形式共组合形式图55(A)是由苹果酸脱氢酶(MDH)、乳酸脱氢酶(LDH)和柠檬酸缩和酶(CS)组成的NAD+NADH再生偶联酶系统；图55(B)是由乙酸激酶(AK)、谷胱甘肽合成酶(GSHS)组成的ADPATP再生偶联酶系统。第四节细胞的固定化固定化细
13、胞保持了胞内酶系的原始状态和天然环境，因而更稳定；省去酶的分离纯化工作，减少酶的活性损失，固定化细胞的制备与使用都比固定化酶更简便；可以作为单一的酶发挥作用，也可利用它所包含的复合酶系完成一部分代谢乃至整个发酵过程，特别适合需要辅助因子参与的合成代谢过程；1.优点：优点：缩短了发酵生产周期,固定化细胞的密度大，；稳定性好，可以较长时间反复使用或连续使用；发酵液中含菌体较少，有利于产品分离纯化，提高产品质量。利用的仅是胞内酶；细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副产物；细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制作用2.局限性：局限性：3.固定化细胞的分类固定化细胞的分类4固定化方法固定化方法直接固定化法
14、(适用于微生物细胞)在没有载体的情况下，借助物理或化学方法（加热、冰冻、絮凝剂等）将细胞直接固定的方法。吸附法包埋法共价与交联三、固定化对细胞性质的影响三、固定化对细胞性质的影响1.固定化对微生物生长速率的影响微生物经过固定化后，其生长参数可能降低、可能增加、也可能不发生变化。a.降低：传质限制引起的；微环境的变化,也可能导致微生物生长速率降低。b.增加：固定化载体对微生物提供的保护作用。免受高剪切力的作用，限制抑制性底物的局部浓度2.固定化对微生物活性的影响激活代谢活性；提高微生物次级代谢产物3.对酶活的影响由于细胞内环境的相对恒定和细胞的“缓冲作用”，固定化对细胞内酶产生的影响在某些方面不
15、象固定化酶那样明显。第五节：固定化酶（细胞）的应用第五节：固定化酶（细胞）的应用（一）固定化酶在工农业生产上的应用（二）固定化酶在医药治疗上的应用（二）固定化酶在医药治疗上的应用（三）固定化酶在分析化学中的应用（三）固定化酶在分析化学中的应用酶法分析：是以酶作为分析工具或分析试剂，用以测定样品。酶传感器：将酶与电化学传感器相连接来测定底物浓度的电极，也称为酶电极。酶传感器工作原理示意图酶传感器工作原理示意图酶传感器主要由固定化酶膜和变换器组成：酶传感器主要由固定化酶膜和变换器组成：固定化酶膜：固定化酶膜：选择性地选择性地“识别识别”并催化被检测物质并催化被检测物质发生化学反应；发生化学反应；变
16、换器：变换器：把催化反应中底物或产物的变量转换成电把催化反应中底物或产物的变量转换成电信号，通过仪表显示出来。信号，通过仪表显示出来。 葡萄糖酶电极 酶电极示意图D葡萄糖葡萄糖O2 D葡萄糖酸葡萄糖酸1，5内酯内酯H2O2半透膜酶胶层感应电极GlucoseGluconicacidGlucoseoxidaseOxygenHydrogenperoxideMembraneElectrode 根据反应中消耗的根据反应中消耗的O O2 2、生成的葡萄糖酸和、生成的葡萄糖酸和H H2 2O O2 2的量，的量，可以用氧电极、可以用氧电极、pHpH电极和电极和H H2 2O O2 2电极来测定葡萄糖的含量。
17、电极来测定葡萄糖的含量。 手掌型葡萄糖手掌型葡萄糖(glucose)(glucose)分析仪分析仪酶传感器应用实例测定对象酶检测用电极葡萄糖麦芽糖半乳糖尿素尿酸胆甾醇中性脂质L-氨基酸L-精氨酸L-谷氨酸L-天（门）冬酰胺L-赖氨酸青霉素苦杏仁苷硝基化合物亚硝基化合物葡萄糖苷酶淀粉酶半乳糖酶脲酶尿酸酶胆甾醇氧化酶蛋白脂酶L-氨基酸酶精氨酸酶谷氨酸脱氢酶天（门）冬酰胺酶赖氨酸脱羧酶青霉素酶苦杏仁苷酶硝基还原酶-亚硝基还原酶亚硝基还原酶H2O2，O2，I-，pHPtPtNH3,CO2，pHO2H2O2，O2PHH2O2，O2，I-，NH3NH3CO2，,NH4+NH4+CO2，,pHCN-NH4+
18、NH3第六节第六节固定化技术的改进固定化技术的改进固定化酶的不足之处：固定化时，酶活力有损失；增加了生产的成本；适用于小分子底物，对大分子底物不适宜；一、传统固定化技术的改善一、传统固定化技术的改善1采用光、辐射、声等物理新技术来改善固定化条件的方法，以减少酶在固定化过程中活性的损失。光敏树脂包埋法：如光敏聚乙烯醇光照聚合，条件温和、易控制交联度、固定化时间短。带光敏性基团的载体共价固定法等离子体引发丙烯酰胺聚合包埋固定化超声波固定化方法低温下60Co辐照冰冻态水溶性单体与酶的水溶液混合体时将使单体聚合与酶固定化同步完成，其回到常温时因冰融化而形成的多孔结构非常有利于底物与产物的扩散。2.添加
19、化学试剂来改善固定化载体的添加化学试剂来改善固定化载体的性质。性质。 改善固定化酶的通透性：加入能够溶出或被微生物分解的试剂。将光敏预聚物、卡拉胶、海藻酸钠和酶混匀滴入CaCl2溶液中，光照聚合包埋，然后将固化酶通过浸入生理盐水或磷酸盐缓冲液,分别溶出卡拉胶或海藻酸钠，即得通透性改善了的（PVA）载体。提高固定化酶机械性能提高固定化酶机械性能；添加化学试剂对原有的固定化载体进行硬化处理。添加聚丙烯酰胺一类聚合物可加强琼脂载体的强度。在 PVA凝胶制备过程中加入少量活性炭粉末 ,有提高强度增加传质速度的效果琼脂-陶瓷双介质包埋：用于细胞固定，琼脂是细菌最适培养基 ,有利于保持菌体生物的活性，而陶
20、瓷粒则能增加固定化细胞的强度。有机聚合物涂缚在无机载体上，兼具了两者的优点3定向固定化技术定向固定化技术把酶和载体在酶的特定位点上连接起来，使酶在载体表面按一定的方向排列，使它的活性位点面朝固体表面的外侧排列，有利于底物进入到酶的活性位点，酶的活力和固定量都有显著提高。4多种固定化方法联用多种固定化方法联用采取吸附-交联法、包埋-交联法，细胞凝聚-交联法、包埋-共价结合法、二次包埋法等提高固定化产物的多方面的性能。包埋包埋-交联法：交联法：先用明胶包埋,再用戊二醛交联，稳定性有极大提高。吸附吸附-交联法交联法：离子交换树脂吸附后再用多功能基化合物交联，可提高固定化酶的活性及稳定性，机械性能也较
21、好。二次包埋法：二次包埋法：聚丙烯酰胺凝胶交联过程中放热及单体和交联剂自身的毒性造成细胞及酶的失活现象，先用琼脂包埋细胞,再用PAM包埋的二次固定法。5多酶联合固定化技术多酶联合固定化技术充分利用其各自特点，把不同来源的酶和整个细胞的生物催化性能结合一起。辅酶再生苹果酸脱氢酶(MDH)、乳酸脱氢酶(LDH)和柠檬酸缩和酶(CS)组成的NAD+NADH再生偶联酶系统；乙酸激酶(AK)、谷胱甘肽合成酶(GSHS)组成的ADPATP再生偶联酶系统。-淀粉酶与糖化酶的共固定化实现了淀粉的液化与糖化两步反应的合二为一、淀粉一步水解为葡萄糖，且操作半衰期可达920h，而当-淀粉酶、糖化酶及葡萄糖异构酶共固
22、定化时又可使淀粉转化果糖。采用甲酸脱氢酶（FDH）甲醛脱氢酶（FADH）和乙醇脱氢酶（ADH)三种脱氢酶包埋共固定，酶法转化2为甲醇。二、新型载体材料及技术二、新型载体材料及技术1价廉宜得的天然高分子材料纤维素及其衍生物壳聚糖及其衍生物家蚕丝纤维：储量丰富的自然资源，对蛋白质具有较高的亲合性，易改性，制备简易,安全无毒和具较好的生物相容性。2特殊功能的新型载体特殊功能的新型载体 无孔微球载体：无孔微球载体： 微小的体积, 提高了酶的结合效率；并消除了底物和产物的扩散阻力。 新型的多孔型或大孔性载体新型的多孔型或大孔性载体： 能够使固化酶的通透性得以改善。磁性高分子微球：磁性高分子微球：内部含有
23、磁性金属或金属氧化物的超细粉末而具有磁响应性的高分子微球。利用外部磁场可以控制固定化酶的运动方式和方向,替代传统的机械搅拌方式;有利于从反应体系中分离和回收，操作简便。温敏性水凝胶载体：温敏性水凝胶载体：随温度改变溶解状态，可实现均相催化和异相分离的统一。以-异丙基丙烯酰胺与丙烯酰胺及其衍生物共聚得到温敏性水凝胶载体酸酸敏敏性性载载体体：肠溶衣聚合物：pH5.0，可溶。 载载体体加加臂臂：有利于减少空间阻碍而提高载酶量及固定化酶活性，。以不同链长的二元胺活化聚丙烯酸甲酯及聚氯乙烯大孔球状载体时，固定化酶的活力则随活化侧基的链长增加而提高。重点：1.五种固定化方法及其各自特点2.固定化酶的性质及其影响因素3.评价固定化酶的指标关注：固定化技术的改进
