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1、第十三章第十三章 植物原生植物原生质质体培育和体体培育和体细细胞胞杂杂交交2024/9/51960年年，英英国国植植物物生生理理学学家家Cocking初初次次获得得烟烟草叶片原生草叶片原生质体，体，酶解解细胞壁法。胞壁法。1971年年，Nagata 和和 Takebe初初次次从从烟烟草草叶叶肉肉组织的原生的原生质体中体中诱导出再生植株。出再生植株。种种间或或属属间甚甚至至科科间完完成成了了原原生生质体体交交融融，并并再生再生为体体细胞胞杂种种somatic hybrid植株。植株。2024/9/52024/9/5conventional crossing procedures can be r
2、ealized by protoplast fusion The Tomatoffel - a product ofintergeneric hybridization 2024/9/5原生原生质体培育体培育 Protoplast culture主主要要目目的的：实现远缘物物种种的的体体细胞胞杂交交。外外源源染染色体、色体、DNA或或细胞器胞器导入，入，发明明远缘新种。新种。流流程程：原原生生质体体分分别 原原生生质体体培培育育 体体细胞胞杂交交 杂种种细胞胞 产生愈生愈伤组织再生植株。再生植株。 2024/9/5原原生生质体体：指指植植物物细胞胞脱脱去去细胞胞壁壁的的、裸裸露露的的、有有生活
3、力的原生生活力的原生质团。原原生生质体体培培育育 ：指指将将植植物物细胞胞游游离离成成原原生生质体体，在在适适宜宜的的培培育育条条件件下下，根根据据细胞胞的的全全能能性性使使其其再再生生细胞胞壁壁，进展展细胞胞的的分分裂裂分分化化，并并发育育成成完完好好植植株株的的过程。程。 第一节第一节 植物原生质体培育和植物原生质体培育和体细胞杂交的概念及意义体细胞杂交的概念及意义 2024/9/5原生质体培育的意义：原生质体培育的意义：1 1单细胞无性系的建立胞无性系的建立 2 2遗传转化的良好受体。化的良好受体。3 3多种根底研多种根底研讨的的实验体系。体系。4 4体体细胞胞杂种的构成。种的构成。 2
4、024/9/5体细胞杂交的概念体细胞杂交的概念又称原生质体交融又称原生质体交融protoplast fusion指在人工控制条件下，不经过有性过程，两种体指在人工控制条件下，不经过有性过程，两种体细胞原生质体相互交融产生杂种的方法。细胞原生质体相互交融产生杂种的方法。由交融细胞培育成的植株为体细胞杂种。由交融细胞培育成的植株为体细胞杂种。2024/9/5原生质体自发交融和诱发交融原生质体自发交融和诱发交融当细胞壁被溶解后，胞间连丝发生膨大，相当细胞壁被溶解后，胞间连丝发生膨大，相邻细胞原生质和细胞器经过膨大的胞间连丝邻细胞原生质和细胞器经过膨大的胞间连丝交融构成同核体，实现原生质体的自发交融。
5、交融构成同核体，实现原生质体的自发交融。仅限于同一物种内。仅限于同一物种内。2024/9/5第二节第二节 植物原生质体分别植物原生质体分别细胞壁主要成分：胞壁主要成分：纤维素、半素、半纤维素、果胶素、果胶质和少量蛋白和少量蛋白质等。等。原生原生质体分体分别方法：方法： 机械分机械分别法法 酶解分解分别法法2024/9/5一、原生质体分别一、原生质体分别- -机械分别法机械分别法方法：利器或机械磨方法：利器或机械磨损等，使等，使细胞壁破胞壁破损，促使，促使原生原生质体体释放。放。将将资料置于高渗糖溶液中料置于高渗糖溶液中预处置，使其置，使其发生生质壁壁分分别，然后用利刀切割或机械磨，然后用利刀切
6、割或机械磨损组织，伤口口处可以可以释放出完好的原生放出完好的原生质体。体。只能只能获得少量原生得少量原生质体，完好的原生体，完好的原生质体更少。体更少。 2024/9/5一、原生质体分别一、原生质体分别- -酶解分别法酶解分别法可可获得大量原生得大量原生质体。不用体。不用发生生质壁分壁分别，对活活细胞胞的的损伤较轻。常用常用酶类： 纤维素素酶类，包括，包括纤维素素酶、半、半纤维素素酶、解体、解体酶。 果胶果胶酶类，包括果胶，包括果胶酶、离析、离析酶。 蜗牛牛酶 胼胝胼胝质酶主要用于花粉母细胞和四主要用于花粉母细胞和四分孢子原生质体分别分孢子原生质体分别2024/9/5原原生生质体体2024/9
7、/5二、原生质体的纯化二、原生质体的纯化酶液液处置后的混合液：置后的混合液： 完好的未完好的未损伤原生原生质体体 亚细胞碎屑叶胞碎屑叶绿体和微管等体和微管等 未消化未消化细胞胞 破碎或破碎或损伤原生原生质体等体等去除去除这些些杂质的的过程程为原生原生质体体纯化。化。纯化方法：沉降法化方法：沉降法 漂浮法漂浮法 不延不延续梯度法梯度法2024/9/5沉降法沉降法方方法法：比比重重小小的的等等渗渗溶溶液液中中，对酶解解物物先先过滤，再低速离心，使完好的原生再低速离心，使完好的原生质体沉降于管底。体沉降于管底。浸透浸透压调理理剂：甘露醇。：甘露醇。筛网网过滤：除除去去大大的的组织碎碎片片和和残残渣渣
8、，孔孔径径44169m，依原生，依原生质体大小来定。体大小来定。离心：离心：9004500r/min。2024/9/5漂浮法漂浮法方方法法：比比艰苦苦的的等等渗渗溶溶液液，使使原原生生质体体漂漂浮浮在在液液体表体表层。浸透浸透压调理理剂：蔗糖。：蔗糖。优点：不易受点：不易受损，本，本钱低。低。缺缺乏乏：对离离心心力力要要求求比比较严厉，掌掌握握不不好好，原原生生质体不易漂浮。体不易漂浮。2024/9/5不延续梯度法不延续梯度法采采用用两两种种比比重重不不同同的的溶溶液液构构成成不不延延续续梯梯度度，经经过过离离心心使使原原生生质质体体与与破破损损细细胞胞分分别别处处于于不不同同液液相中，从而纯
9、化原生质体的方法。相中，从而纯化原生质体的方法。2024/9/5叶肉原生质体分别纯化叶肉原生质体分别纯化2024/9/52024/9/5纯化后的叶肉原生质体纯化后的叶肉原生质体2024/9/5三、原生质体活力测定三、原生质体活力测定原生质体活力关系到细胞壁再生、细胞分裂和分化原生质体活力关系到细胞壁再生、细胞分裂和分化以及再生植株的构成，反映了原生质体分别和纯化以及再生植株的构成，反映了原生质体分别和纯化技术的成败。技术的成败。2024/9/5四、影响原生质体数量和活力的要素四、影响原生质体数量和活力的要素原原生生质质体体培培育育胜胜利利的的首首要要条条件件是是获获得得大大量量、完完好好、有活
10、力的原生质体。有活力的原生质体。影影响响要要素素主主要要有有：供供试试资资料料、酶酶的的种种类类和和组组合合及及酶酶解解时时间间、浸浸透透压压稳稳定定剂剂、质质膜膜稳稳定定剂剂、pH值值、光照和温度等。光照和温度等。2024/9/5一供试资料一供试资料1.1.自然生长资料的幼嫩叶片。自然生长资料的幼嫩叶片。 2.2.无菌实生苗子叶和下胚轴。无菌实生苗子叶和下胚轴。3.3.外植体来源的愈伤组织和细胞悬浮培育物。外植体来源的愈伤组织和细胞悬浮培育物。 4.4.花粉细胞花粉细胞2024/9/5二酶的种类、组合和酶解时间二酶的种类、组合和酶解时间草本植物：草本植物：23种酶混合液。纤维素酶为种酶混合液
11、。纤维素酶为0.5%3%，果胶酶为，果胶酶为0.1%1%。木本植物木本植物 ：纤维素酶同草本，果胶酶更多。：纤维素酶同草本，果胶酶更多。 成熟花粉粒和四分体小孢子：除纤维素酶类和果成熟花粉粒和四分体小孢子：除纤维素酶类和果胶酶类外，尚需降解胼胝质层的蜗牛酶和胼胝质胶酶类外，尚需降解胼胝质层的蜗牛酶和胼胝质酶，浓度为酶，浓度为0.5%2%。 2024/9/5( (三三) ) 浸透压稳定剂浸透压稳定剂常用：甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖和盐类常用：甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖和盐类等。等。不同物种原生质体分别时，所需的浸透压稳定不同物种原生质体分别时，所需的浸透压稳定剂也不同。剂也不同。 原生质体在
12、细微高渗溶液中比在等渗溶液中更原生质体在细微高渗溶液中比在等渗溶液中更为稳定。为稳定。较高程度的浸透剂可以阻止原生质体的破裂和较高程度的浸透剂可以阻止原生质体的破裂和出芽，但同时也能够会抑制原生质体的分裂。出芽，但同时也能够会抑制原生质体的分裂。 2024/9/5四质膜稳定剂四质膜稳定剂常用：常用： 葡聚糖硫酸钾葡聚糖硫酸钾0.2%0.3% MES2-N-吗啉吗啉-乙烷磺酸乙烷磺酸 氯化钙氯化钙0.11.0 M 磷酸二氢钾等。磷酸二氢钾等。2024/9/5五五pH值值酶的活性与酶的活性与pH值有关。值有关。低低pH值值4.5：酶活力强，原生质体分别速度：酶活力强，原生质体分别速度快，但原生质体
13、活力差。快，但原生质体活力差。pH值偏高：酶活力差，原生质体分别速度慢，完值偏高：酶活力差，原生质体分别速度慢，完好原生质体数目较多。好原生质体数目较多。2024/9/5六光照和温度六光照和温度酶的活力与温度也有关系。的活力与温度也有关系。酶的最适温度是的最适温度是40504050。分分别原生原生质体温度：体温度：25302530。分分别原生原生质体的体的过程要在黑暗条件下程要在黑暗条件下进展：脱壁展：脱壁的原生的原生质体体对光非常敏感。光非常敏感。2024/9/5第三节第三节 植物原生质体培育植物原生质体培育过程程：普普通通情情况况下下，原原生生质体体在在适适宜宜的的培培育育基基和和培培育育
14、条条件件下下经培培育育24d可可再再生生细胞胞壁壁，并并很很快快进展展细胞胞分分裂裂，3060d出出现肉肉眼眼可可见的的细胞胞团，以以后后细胞胞继续分分裂裂增增殖殖，几几个个月月后后构构成成愈愈伤组织或胚状体，最后构成完好的小植株。或胚状体，最后构成完好的小植株。2024/9/5一、原生质体培育方法一、原生质体培育方法 类似于单细胞培育。类似于单细胞培育。培育方法有三种培育方法有三种: : 液体浅层培育法液体浅层培育法 固体平板培育法固体平板培育法 双层培育法双层培育法2024/9/52024/9/5双层培育法双层培育法液体液体- -固体双固体双层培育法：培育法：将原生将原生质体体悬液涂布在固
15、体液涂布在固体琼脂培育基外表。脂培育基外表。固体固体- -固体双固体双层培育法：培育法：将原生将原生质体体悬液与液与琼脂混合，涂布在固体脂混合，涂布在固体琼脂培脂培育基外表。育基外表。2024/9/5液体浅层培育法液体浅层培育法方法：将原生方法：将原生质体体悬液于培育皿中浅液于培育皿中浅层静止培育。静止培育。特点：每天悄然晃特点：每天悄然晃动两三次，加两三次，加强通气。通气。当当原原生生质体体经细胞胞壁壁再再生生，并并构构成成细胞胞团后后，应立刻立刻转入固体培育基上培育，以利分化构成植株。入固体培育基上培育，以利分化构成植株。2024/9/5二、影响原生质体培育的要素二、影响原生质体培育的要素
16、原生原生质体活力体活力原生原生质体起始密度体起始密度浸透浸透压稳定定剂培育基培育基营养养培育条件：光照和温度培育条件：光照和温度植物植物资料和基因型料和基因型2024/9/5原生质体起始密度原生质体起始密度常用：常用：104105个个/ml。浓度度较高高：由由不不同同的的原原生生质体体构构成成的的细胞胞团彼彼此交此交错生生长在一同，构成嵌合体在一同，构成嵌合体组织。浓度度低低于于103个个/ml：细胞胞壁壁再再生生后后，仅分分裂裂12次，就无法次，就无法继续分裂。分裂。2024/9/5浸透压稳定剂浸透压稳定剂原原生生质体体是是在在高高浸浸透透压中中生生长，再再生生出出细胞胞壁壁，构构成成细胞胞
17、团后后，应逐逐渐降降低低浸浸透透压，最最后后转至至不不含含浸浸透透压剂的新的新颖培育基中，才干很好地分化。培育基中，才干很好地分化。 2024/9/5培育基营养培育基营养原原生生质体体培培育育常常用用：MS、B5、NT、N6、MT或它或它们的衍生培育基。的衍生培育基。无无机机盐浓度度要要低低，适适当当提提高高Ca2+、Mg2+含含量量而而降降低低NO3-含含量量，有有助助于于提提高高原原生生质体体的的稳定定性，促性，促进细胞分裂。胞分裂。2024/9/5培育条件培育条件光照：光照： 培育初期需求黑暗或微弱的散射光。培育初期需求黑暗或微弱的散射光。 诱导器官器官发生生时，那么，那么须强光照。光照
18、。温度：温度： 普普通通为2430，但但不不同同物物种种间差差别比比较大。大。2024/9/5三、原生质体再生过程三、原生质体再生过程1、细胞壁再生、细胞壁再生2、细胞分裂和愈伤组织或胚状体构成、细胞分裂和愈伤组织或胚状体构成3、植株再生、植株再生2024/9/5细胞壁再生的过程细胞壁再生的过程过程程：先先是是质膜膜合合成成细胞胞壁壁主主要要成成分分微微纤维，然然后后在在质膜膜外外表表进展展聚聚协作作用用，生生成成多多片片层的的构构造造，以以后后在在质膜膜和和片片层构构造造之之间、或或在在膜膜上上产生生小小纤维丝，逐逐渐构构成成不不定定向向的的纤维团，最最后后构构成成完完好好细胞壁。胞壁。再再
19、生生壁壁的的成成分分不不同同于于其其来来源源细胞胞：主主要要成成分分为非非纤维素多糖，即葡萄糖占素多糖，即葡萄糖占65%，纤维素只占素只占5%。2024/9/5检测新壁合成的方法检测新壁合成的方法主要有：主要有：荧光增白光增白剂法和法和电镜技技术。荧光增白光增白剂是是专注性地与注性地与细胞壁胞壁纤维素的素的-葡萄葡萄糖苷糖苷键特异地特异地结合，因此可以用来合，因此可以用来检测细胞壁的胞壁的再生从而确定原生再生从而确定原生质体活力。体活力。有活力的原生有活力的原生质体体经染色后，可在染色后，可在细胞胞质膜的周膜的周围察看到察看到荧光光环。2024/9/52024/9/52 2、细胞分裂和愈伤组织
20、或胚状体构成、细胞分裂和愈伤组织或胚状体构成 原原生生质体体细胞胞壁壁的的存存在在是是进展展规那那么么有有丝分分裂裂的的前提。前提。再生再生细胞并不一定都能胞并不一定都能进展展细胞有胞有丝分裂。分裂。原原生生质体体植植板板率率分分裂裂频率率变化化很很大大，从从0.1%到到80%。2024/9/52024/9/5叶肉原生质体愈伤组织叶肉原生质体愈伤组织2024/9/5原生质体培育过程中原生质体培育过程中会发生有丝分裂不正常的景象会发生有丝分裂不正常的景象缘由：由： 核分裂和胞核分裂和胞质分裂的不平衡所致。分裂的不平衡所致。 高高浓度的度的酶处置置损伤了了质膜，影响膜，影响质膜构成膜构成细胞壁的正
21、常功能。胞壁的正常功能。 细胞胞质系系统尤其是高尤其是高尔基体的功能不正常。基体的功能不正常。2024/9/53 3、植株再生、植株再生原生质体培育构成的愈伤组织转移到分化培育原生质体培育构成的愈伤组织转移到分化培育基中，可构成不定芽和不定根或构成胚状体构基中，可构成不定芽和不定根或构成胚状体构造后直接发育成植株。造后直接发育成植株。2024/9/52024/9/5马铃薯原生质体再生植株马铃薯原生质体再生植株2024/9/5四、原生质体培育过程中的遗传变异四、原生质体培育过程中的遗传变异顺应性变异顺应性变异 为非遗传变异，会随着环境条件的改动丧失其为非遗传变异，会随着环境条件的改动丧失其变异特
22、征。变异特征。遗传性变异遗传性变异 能稳定传送给后代，涉及到染色体和基因变异，能稳定传送给后代，涉及到染色体和基因变异，影响着生物性状的表达。影响着生物性状的表达。 2024/9/5第四节第四节 植物体细胞杂交植物体细胞杂交2024/9/5一化学交融一化学交融化学交融剂：化学交融剂： NaNO3 高高PH-高浓度钙离子高浓度钙离子 聚乙二醇聚乙二醇 溶菌酶溶菌酶 明胶明胶 抗体抗体 植物凝集素伴刀豆球蛋白植物凝集素伴刀豆球蛋白A 聚乙烯醇等。聚乙烯醇等。2024/9/51 1 NaNO3 NaNO3 交融法交融法 原原理理：钠钠离离子子能能中中和和原原生生质质体体外外表表的的负负电电荷荷，使使
23、凝聚的原生质体的质膜严密接触，促进细胞交融。凝聚的原生质体的质膜严密接触，促进细胞交融。交融率为交融率为0.1%4%。2024/9/52高高pH-高浓度钙离子交融法高浓度钙离子交融法原原理理：钙钙离离子子浓浓度度决决议议着着细细胞胞膜膜的的稳稳定定性性和和可可塑塑性性，促促使使原原生生质质体体膜膜的的结结合合，而而高高pH又又能能改改蜕变膜的外表电荷，从而有利于细胞交融。蜕变膜的外表电荷，从而有利于细胞交融。交融率为交融率为10%左右。左右。钙钙离离子子浓浓度度和和pH值值范范围围因因植植物物种种类类的的不不同同而而不不同。同。2024/9/5高高pH-高浓度钙离子交融方法烟草高浓度钙离子交融
24、方法烟草a.两两亲本原生本原生质体混合体混合1：1；b.离心使原生离心使原生质体沉集在一同；体沉集在一同；c.去上清液，参与去上清液，参与2ml交融液交融液50mmol/LCaCl2H2O +400mmol/L甘露醇，甘露醇，pH10.5；d.离心使原生离心使原生质体堆体堆积，于，于37中水浴中水浴30min；e.用清洗介用清洗介质甘露醇，甘露醇，CaCl2H2O 置置换交融液，交融液，放置放置30minf.用清洗介用清洗介质洗洗2次，培育。次，培育。2024/9/5原生质体电交融原生质体电交融2024/9/5Fusion protoplast 2024/9/5一杂种细胞的选择一杂种细胞的选择
25、方法：互补选择法和机械选择法方法：互补选择法和机械选择法1 1互补选择法互补选择法 利用两个亲本具有不同的遗传或生理特性，在特利用两个亲本具有不同的遗传或生理特性，在特定的培育条件下，只需发生互补作用的杂种细胞定的培育条件下，只需发生互补作用的杂种细胞才干生长的选择方法。才干生长的选择方法。2 2机械选择法机械选择法二、体细胞杂种选择系统二、体细胞杂种选择系统 自学自学2024/9/52024/9/5二杂种植株的鉴定二杂种植株的鉴定杂种细胞的挑选只能是体细胞杂种真实性的间接杂种细胞的挑选只能是体细胞杂种真实性的间接证据。证据。交融后某一亲本染色体的丧失和突变、细胞器的交融后某一亲本染色体的丧失
26、和突变、细胞器的丧失、分别和培育过程中能够发生的体细胞变异丧失、分别和培育过程中能够发生的体细胞变异等都会影响杂种植株的最终获得。等都会影响杂种植株的最终获得。2024/9/5四、植物细胞质工程四、植物细胞质工程一细胞质杂种一细胞质杂种二细胞器移植叶绿体和细胞核二细胞器移植叶绿体和细胞核 三微生物移植固氮菌和绿蓝藻三微生物移植固氮菌和绿蓝藻四外源四外源DNA的摄入的摄入2024/9/5主要内容主要内容1.1.何谓原生质体、原生质体培育、体细胞杂交？何谓原生质体、原生质体培育、体细胞杂交？2.2.植物原生质体的分别和培育有那些主要步骤？植物原生质体的分别和培育有那些主要步骤？它在遗传操作中有何重要意义？它在遗传操作中有何重要意义？3.3.影响原生质体培育的要素有什么？如何获得大影响原生质体培育的要素有什么？如何获得大量的、有活力的原生质体？量的、有活力的原生质体？
