酶的分离和纯化

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1、第二章第二章 酶的分离和纯化酶的分离和纯化 IsolationandPurificationofenzyme n方法概括方法概括 n原料处理：包括组织破碎、缓冲液抽原料处理：包括组织破碎、缓冲液抽n粗分级：一般采用硫铵沉淀、乙醇沉淀粗分级：一般采用硫铵沉淀、乙醇沉淀或其他方法或其他方法n细分级：一般采用离子交换层析、凝胶细分级：一般采用离子交换层析、凝胶层析、亲和层析和电泳层析、亲和层析和电泳 第一节第一节 原料选择及预处理原料选择及预处理 n动动物物原原料料：动动物物组组织织或或脏脏器器（活活体体取取出出） 充充分脱血分脱血 -10 -50保存保存n植物原料植物原料：植物原料：植物原料 磨碎

2、磨碎 加入缓冲液抽提加入缓冲液抽提n植植物物原原料料特特点点：1）纤纤维维含含量量高高 2）酚酚酶酶活活力力高高 3）缓冲液）缓冲液pH易被细胞内物质改变易被细胞内物质改变n微微生生物物原原料料：菌菌体体培培养养 做做酶酶活活时时间间曲曲线线 确定最大酶活时间确定最大酶活时间 细胞破碎细胞破碎 n微生物细胞破碎一般采用微生物细胞破碎一般采用 n1）化化学学法法：碱碱；去去垢垢剂剂；有有机机溶溶剂剂；酶酶解解；冰冰冻冻复融复融n2）物理法：热处理；渗透压；减压；声波振荡物理法：热处理；渗透压；减压；声波振荡n3）机械法：加磨料；研磨；挤压机械法：加磨料；研磨；挤压n4）缓冲液抽提缓冲液抽提n抽抽

3、提提缓缓冲冲液液的的加加入入要要少少量量多多次次，植植物物酶酶抽抽提提时时可可加加5mM的的Vc第二节第二节 酶的粗提酶的粗提n沉淀沉淀 n核酸沉淀：核酸沉淀：a）MnCl2、硫酸、硫酸鱼精蛋白、链霉素可使核酸沉鱼精蛋白、链霉素可使核酸沉淀，离心除掉淀，离心除掉（b）加入核酸）加入核酸酶将其降解酶将其降解n杂蛋白沉淀：根据目的酶的特杂蛋白沉淀：根据目的酶的特性方法各异性方法各异n选择性沉淀（盐析）：最常用选择性沉淀（盐析）：最常用的方法的方法n沉淀过程中随时监测蛋白浓度和酶活力沉淀过程中随时监测蛋白浓度和酶活力n 讨论：讨论：n（a）盐的加入速度合适）盐的加入速度合适n（b）蛋白质开始沉淀处的

4、硫铵浓度与蛋白浓度有关）蛋白质开始沉淀处的硫铵浓度与蛋白浓度有关n（c）硫铵浓度表示法；饱和度）硫铵浓度表示法；饱和度254.1Mn（d）硫硫铵铵饱饱和和溶溶液液pH7，若若目目的的酶酶易易酸酸变变性性必必须须用用缓冲液缓冲液n（e）硫铵溶液密度较高（）硫铵溶液密度较高（1.24），故需较大离心力），故需较大离心力n此步可除去此步可除去75%以上的杂蛋白，且可使蛋白浓缩以上的杂蛋白，且可使蛋白浓缩 透析与浓缩透析与浓缩 n1）透析袋处理：透析袋处理：n透透析析袋袋 0.5M EDTA煮煮半半小小时时 蒸蒸馏馏水水煮煮半半小小时时 反复八次反复八次 带橡皮手套用镊子拿取带橡皮手套用镊子拿取n2）

5、透透析析除除盐盐：200倍倍于于被被透透析析物物；4小小时时换换一一次次透透析液；监测电导值析液；监测电导值nSephadex G25 除除盐盐：柱柱长长50cm；上上样样小小于于床床体体积的积的20%n3）浓缩：浓缩：a）火棉胶）火棉胶 b）聚乙二醇（）聚乙二醇（PEG） n c）超滤（）超滤（3-5kg/cm2）d）冻干）冻干透析技术原理图透析技术原理图 超滤技术原理图超滤技术原理图 第三节第三节 酶的精制酶的精制 一、层析技术（一、层析技术（chromatography）1）分配层析分配层析：物质在两相中的分配系数不同：物质在两相中的分配系数不同a）纸层）纸层 b）薄层）薄层(比纸层灵敏

6、比纸层灵敏100倍但剥板困难倍但剥板困难) c）柱层）柱层2）吸吸附附层层析析（absorptionchromatography）：吸吸附附剂剂对对通通过过它它的的物物质质吸吸附附力力不不同同，吸吸附附力力包包括括离离子子引引力力、疏疏水作用、范德华力和氢键水作用、范德华力和氢键a）薄层）薄层 b）柱层）柱层n填填料料一一般般为为硅硅胶胶、氧氧化化铝铝、磷磷酸酸钙钙、活活性性白白土土和和羟羟基基磷磷灰灰石石；常常用用羟羟基基磷磷灰灰石石;带带正正电电, 稳稳定定范范围围pH5.5-10, 吸附量吸附量1mg/g湿剂湿剂纸层纸层薄层薄层3）离离子子交交换换层层析析（ionexchangechro

7、matography）：交交换换剂剂上上带带电电荷荷，可可根根据据样样品品的的电电荷荷予予以以分分离离na）阳离子交换层析）阳离子交换层析 b）阴离子交换层析）阴离子交换层析 nc）离离子子交交换换剂剂的的类类型型：离离子子交交换换树树脂脂、离离子子交交换换纤纤维维素、离子交换凝胶素、离子交换凝胶nd）实实验验室室常常用用的的离离子子交交换换剂剂：阴阴离离子子交交换换剂剂DEAE-Cellulose、DEAE-Sephadex；阳阳离离子子交交换换剂剂CM- Cellulose、CM- Sephadexne）离离子子交交换换剂剂的的预预处处理理：去去杂杂质质；溶溶胀胀；除除小小颗颗粒粒；改型改

8、型n阳离子交换剂：阳离子交换剂： 碱碱水水酸酸水水平衡平衡n阴离子交换剂：阴离子交换剂： 酸酸水水碱碱水水平衡平衡nf）柱柱层层析析：床床体体积积等等于于2-5倍倍束束缚缚样样品品需需要要量量； 径径 高高 = 1 15 ； 上上样样量量不不超超过过柱柱体体积积的的10%（*注注意意上上样样方方法法）；洗洗脱脱方方法法有有两两种种不不连连续续梯梯度度洗洗脱脱和和连连续续梯梯度度洗脱；分布收集器收集每管洗脱；分布收集器收集每管2-3mlng）交交换换剂剂后后处处理理：饱饱和和NaCl水水酸酸或或碱碱水水平衡平衡连续梯度洗脱连续梯度洗脱n梯度混合器 离子交换层析离子交换层析n阳离子交换剂阳离子交换

9、剂n阴离子交换剂阴离子交换剂Anionexchangechromatography 4）凝胶层析（分子筛层析）（凝胶层析（分子筛层析）（gel filtration gel filtration chromatographychromatography）：根据分子量大小予以分离：根据分子量大小予以分离 na）凝胶预处理：凝胶）凝胶预处理：凝胶浸入洗脱液浸入洗脱液轻轻搅拌轻轻搅拌n n 加热加热90-100（水浴加热）（水浴加热）nb）层层析析柱柱准准备备：2.5100柱柱； 稠稠胶胶灌灌柱柱； 2-3个个床体积的缓冲液平衡；床体积的缓冲液平衡； 流速流速16-18ml/hnc）层层析析：兰兰葡

10、葡聚聚糖糖（分分子子量量2106）验验柱柱并并求求外外水水体体积（积（V0）；上样量）；上样量1-5% ；n恒压洗脱；恒压洗脱； 流速流速16-18ml/hnd）凝凝胶胶后后处处理理：0.5N NaOH+0.5N NaCl处处理理后后4保存保存n长时间不用可采用乙醇脱水保存或低温干燥保存长时间不用可采用乙醇脱水保存或低温干燥保存 凝胶过滤层析原理图凝胶过滤层析原理图 Gel filtration chromatography 5）亲和层析亲和层析（affinitychromatography）特异性结合特异性结合na）关键：配体；配体与支持物的连接方法；吸附、洗脱条件）关键：配体；配体与支持物

11、的连接方法；吸附、洗脱条件nb）支支持持物物的的选选择择：非非特特异异性性吸吸附附作作用用低低；液液体体流流动动性性好好；较较宽宽的的pH、离子强度；丰富的化学基团；有效的多孔性、离子强度；丰富的化学基团；有效的多孔性 常用琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶和受控多孔玻璃球常用琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶和受控多孔玻璃球nc）配体的选择：有亲和力但不易过大）配体的选择：有亲和力但不易过大nd）配配体体与与支支持持物物的的连连接接：载载体体结结合合法法；物物理理吸吸附附法法；交交联联法法；包埋法（先活化支持物上的功能基团再将配体连上去）包埋法（先活化支持物上的功能基团再将配体连上去）ne）吸附剂的衍生物：支持物吸

12、附剂的衍生物：支持物+空间臂空间臂nf）层析条件的选择：蛋白质层析条件的选择：蛋白质+配体配体 蛋白质蛋白质-配体复合物配体复合物 起起初初配配体体浓浓度度恒恒定定，随随蛋蛋白白浓浓度度增增加加平平衡衡右右移移（逐逐渐渐保保留留特特性性），故亲和力较低也能成功的亲和。故亲和力较低也能成功的亲和。 g）洗脱：更高亲和力的物质置换；剧烈改变环境条件）洗脱：更高亲和力的物质置换；剧烈改变环境条件亲和层析原理亲和层析原理 Affinity chromatography 二、超离心技术超离心技术 利用物质的沉降系数、质量、利用物质的沉降系数、质量、浮力因子等方面的差别用强离心力进行分离浮力因子等方面的差

13、别用强离心力进行分离nF = w w2r （F 相相对对离离心心力力RCF；RCF以以g的的倍倍数数表表示）示）n RCF = w w2r/980 w = w = ( (转数转数/ /分）分）/ 30/ 30n RCF = 1.11910-5 r(转数转数/分分)2n离心机：离心机：na)桌式：桌式：3000转转/分分 红血球、酵母细胞等粗沉淀物红血球、酵母细胞等粗沉淀物nb)高高速速离离心心机机：20000 25000转转/分分 一一般般实实验验使使用但病毒、小细胞器或单个分子不能沉降用但病毒、小细胞器或单个分子不能沉降nc)超超速速离离心心机机：75000转转/分分 分分子子生生物物学学必

14、必备备；能能分分级只有在电镜下才能看得见的亚细胞器级只有在电镜下才能看得见的亚细胞器 二、电泳（二、电泳（electrophoresiselectrophoresis）技术）技术 n1）原理：原理：M =d L / E tM: 迁移率迁移率 L: 颗粒泳动距离颗粒泳动距离 t: 通电时间通电时间 E: 电势差电势差n迁迁移移率率与与下下列列因因素素有有关关：a）样样品品带带电电状状态态、分分子子形形状状与大小与大小 b）电场强度）电场强度c）缓冲液）缓冲液pH的和离子强度的和离子强度 d）支持介质的阻力、吸附作用）支持介质的阻力、吸附作用n2）电泳类型：）电泳类型：a）纸电泳）纸电泳 b）醋酸

15、纤维薄膜电泳）醋酸纤维薄膜电泳 c）琼脂糖电泳）琼脂糖电泳 d）聚丙烯酰胺凝胶电泳）聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE和和SDS-PAGEn聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳：Acr+Bis；TEMED，0.4%；过硫酸胺过硫酸胺,0.01-0.03%；n等等电电聚聚焦焦(isoelectricfocusing)：两两性性电电解解质质在在电电场场作作用用下建立一个下建立一个pH梯度分离蛋白质梯度分离蛋白质n电泳检测：电泳检测：a）考马斯亮兰（氨基黑）染色法）考马斯亮兰（氨基黑）染色法 nb）荧光染色法）荧光染色法 c）特异酶检测）特异酶检测 d）其他染色法）其他染色法 盘状电泳（盘状电泳（A）和平板

16、电泳（）和平板电泳（B） 第四节第四节 提纯过程中的定量提纯过程中的定量 n蛋蛋白白质质浓浓度度：1）双双缩缩脲脲法法：Cu+与与肽肽键键及及酪酪氨氨酸酸残残基基络络合合显显色；测定浓度色；测定浓度0.5-10mg/ml n2）Lowry法法：双双缩缩脲脲法法的的改改进进，Cu+与与蛋蛋白白质质在在碱碱性性溶溶液液中中络合，此络合物还原络合，此络合物还原Folin试剂，测定浓度试剂，测定浓度20-400g/ml n3)紫紫外外吸吸收收法法：Tyr、Trp、 Phe在在280nm有有最最大大光光吸吸收收，此此方方法法因因上上述述三三种种氨氨基基酸酸含含量量不不同同测测定定结结果果有有误误差差 测

17、测定定浓浓度度0.1-0.5mg/mln4） Bradford法法 :该该 法法 是是 根根 据据 蛋蛋 白白 质质 与与 考考 马马 斯斯 亮亮 蓝蓝（coomassie brilliant blue）结结合合产产生生的的蓝蓝色色物物质质在在595nm有有最最大大光光吸吸收收来来测测定定蛋蛋白白质质浓浓度度的的。该该方方法法简简单单、快快速速、可可靠靠、灵敏度高，可测定灵敏度高，可测定1-10m mg的蛋白质。的蛋白质。n酶活力：检测目的酶的活力酶活力：检测目的酶的活力n目的蛋白（非酶）检测较困难目的蛋白（非酶）检测较困难纯化倍数 = 回收率% = 100 酶的提纯过程记录格式酶的提纯过程记

18、录格式 步骤步骤总体积总体积（ml）蛋白总蛋白总量量（mg）总活总活力力（u）比活比活力力（u/mg）回收回收率率（%）提提纯纯倍倍数数粗抽提液粗抽提液50热变性除杂热变性除杂硫铵分级沉淀硫铵分级沉淀（30%-50%）DEAE-纤维素纤维素离子交换离子交换凝胶过滤凝胶过滤SephadexG-100100010002502510120008000750359.25000480002730182017000.4160.803.6752185100965536.4341.001.448.83125444第五节第五节 酶蛋白分子量的测定n渗透压法渗透压法n超速离心法超速离心法n凝胶层析法凝胶层析法 n

19、SDS-聚丙烯酰胺电泳法聚丙烯酰胺电泳法 渗透压法渗透压法nM为为蛋蛋白白质质的的摩摩尔尔质质量量（分分子子量量），R为为气气体体常常数数（0.082升升大大气气压压/摩摩尔尔/度度），T为为绝绝对对温温度度。为为了了测测定定蛋蛋白白质质的的分分子子量量，分分别别取取几几个个不不同同的的蛋蛋白白质质浓浓度度c，测测出出对对应应的的渗渗透透压压，然然后后以以/c对对c作作图图，并并作作延延长长线线外外推推至至c=0，得得到到的的y轴轴截截距距即即为为lim/c的的值值，代代入入上上式式可可求得分子量求得分子量M。n渗渗 透透 压压 法法 适适 合合 测测 定定 分分 子子 量量 范范 围围 在在

20、10,000100,000的的蛋蛋白白质质。其其优优点点是是实实验验装装置置简简单单，测测定定也也较较为为准准确确；缺缺点点是是要要求求蛋蛋白白样样品品纯纯度度高高，否否则则测测出出的的将是溶液中各种蛋白的平均分子量。将是溶液中各种蛋白的平均分子量。超速离心法超速离心法nM：分分子子量量 S：沉沉降降系系数数 R：气气体体常常数数 T：绝绝对对温温度度 D：扩扩散散系系数数 ：溶溶质质分分子子微微分分比比容容 ：介介质密度质密度 SDS-聚丙烯酰胺电泳法聚丙烯酰胺电泳法M 被测蛋白分子量被测蛋白分子量a，b 常数，用已知分子量蛋白作标准曲线求得常数，用已知分子量蛋白作标准曲线求得 de 酶蛋白

21、的泳动距离酶蛋白的泳动距离 do 小分子染料的泳动距离小分子染料的泳动距离n亚基分子量亚基分子量 SDS-PAGE的分子量标准曲线的分子量标准曲线 凝胶层析法凝胶层析法M 被测蛋白分子量被测蛋白分子量a，b 常数，用已知分子量蛋白作标准曲线求得常数，用已知分子量蛋白作标准曲线求得 Ve 酶蛋白洗脱体积酶蛋白洗脱体积 Vo 空体积（可用蓝葡聚糖求得）空体积（可用蓝葡聚糖求得） 凝胶过滤分子量标准曲线凝胶过滤分子量标准曲线 思考题n下表是一种酶的各个纯化步骤的总蛋白和总活下表是一种酶的各个纯化步骤的总蛋白和总活性单位数。性单位数。从表中给出的信息计算每一纯从表中给出的信息计算每一纯化步骤得到的酶溶

22、液的比活；化步骤得到的酶溶液的比活；n哪哪一一纯纯化化步步骤骤最最有有效效（即即相相对对纯纯度度增增加加最最大）；大）；n哪一纯化步骤效率最低？哪一纯化步骤效率最低？n按按照照表表中中的的6 6个个步步骤骤纯纯化化的的酶酶是是纯纯化化的的酶酶，表表中中结结果果是是否否有有指指示示？有有没没有有别别的的方方法法评评价价酶酶的的纯度？纯度？ 作 业n请请说说明明酶酶纯纯化化过过程程中中常常用用的的分分离离技技术术。从从肝肝细细胞胞中中提提取取的的一一种种蛋蛋白白水水解解酶酶的的粗粗提提液液300mL含含有有150mg蛋蛋白白质质，总总活活力力为为360单单位位。经经过过一一系系列列纯纯化化步步骤骤以以后后得得到到的的4mL酶酶制制品品（含含有有0.08mg蛋蛋白白），总总活活力力为为288单单位位。整整个个纯纯化化过过程的收率是多少？纯化了多少倍？程的收率是多少？纯化了多少倍？