蛋白质组学及其研究进展

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1、蛋白质组学及其研究进展 蛋白质组学的含义蛋白质组学的含义 蛋白质组学研究的内容蛋白质组学研究的内容 蛋白质组学研究的手段蛋白质组学研究的手段 蛋白质组信息学蛋白质组信息学 差异蛋白质组学差异蛋白质组学 蛋白质组研究意义及前景蛋白质组研究意义及前景 讲授内容讲授内容一、蛋白质组学及其研究进展（晏本菊）一、蛋白质组学及其研究进展（晏本菊）二、核酶、抗体酶（陈惠）二、核酶、抗体酶（陈惠）三、蛋白质定向进化三、蛋白质定向进化DNA Shuffling 技术（陈惠）技术（陈惠）四、细胞信号传导、肽核酸（杨婉身）四、细胞信号传导、肽核酸（杨婉身） 生生物化学专题物化学专题 主讲教师主讲教师 杨婉身杨婉身

2、晏本菊晏本菊 陈惠陈惠蛋白质组学的含义 蛋白质组蛋白质组( (Proteome)Proteome)一词最早由澳大利亚学一词最早由澳大利亚学者者 等于等于19941994年提出年提出, ,指的是由一指的是由一个基因组个基因组geneomegeneome或一个细胞、组织表达的所有或一个细胞、组织表达的所有proteinprotein。蛋白质组学蛋白质组学( (proteomics)proteomics)是在蛋白质水是在蛋白质水平上定量、动态、整体性地研究生物体平上定量、动态、整体性地研究生物体。 同基因组学一样同基因组学一样, ,蛋白质组学不是一个封闭的、蛋白质组学不是一个封闭的、概念化的、稳定的

3、知识体系概念化的、稳定的知识体系, ,而是一个领域。它旨而是一个领域。它旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式在阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式, ,其内容包括蛋白质的定性鉴定、定量检测、细胞其内容包括蛋白质的定性鉴定、定量检测、细胞内定位、相互作用研究等内定位、相互作用研究等, ,最终揭示蛋白质功能最终揭示蛋白质功能, ,是基因组序列与基因功能之间的桥梁。是基因组序列与基因功能之间的桥梁。 蛋白质组学研究的内容蛋白质组学研究的内容蛋白质表达模式蛋白质表达模式( (或蛋白质组组成或蛋白质组组成) )的研究的研究 蛋白质组组成的分析鉴定是蛋白质组学中的与蛋白质组组成的分析鉴定是蛋白

4、质组学中的与基因组学相对应的主要内容。它要求对蛋白质组进行基因组学相对应的主要内容。它要求对蛋白质组进行表征表征, ,即实现所有蛋白质的分离、鉴定及其图谱化。即实现所有蛋白质的分离、鉴定及其图谱化。双向凝胶电泳双向凝胶电泳(2-(2-D) )和质谱和质谱( (Mass spectrometry) )技技术是当前分离鉴定蛋白质的两大支柱技术术是当前分离鉴定蛋白质的两大支柱技术 蛋白质组功能模式(目前主要集中在蛋白质相互作用网络关系)的研究原核及简单真核生物的蛋白质组研究 流感嗜血杆菌的蛋白质组研究流感嗜血杆菌的蛋白质组研究 大肠杆菌的蛋白质组研究大肠杆菌的蛋白质组研究 致病微生物的蛋白质组研究致

5、病微生物的蛋白质组研究 酿酒酵母的蛋白质组研究酿酒酵母的蛋白质组研究 流感嗜血杆菌的蛋白质组研究流感嗜血杆菌的蛋白质组研究 流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌( (HaeHae mophilusmophilus influenzaeinfluenzae) )是第一个获得是第一个获得基因组全序列的生物基因组全序列的生物. .瑞士的一个小组通过瑞士的一个小组通过2-2-DPAGEDPAGE研究了流感研究了流感嗜血杆菌的蛋白质组分嗜血杆菌的蛋白质组分, ,在在3-103-10的范围内鉴定了约的范围内鉴定了约300300个蛋个蛋白质组分白质组分, ,然后用有两个尿素浓度的麦黄酮然后用有两个尿素浓度的麦黄酮( (

6、tricinetricine) )胶分离了胶分离了很难分离到的很难分离到的5-205-20kuku范围内的蛋白质范围内的蛋白质, ,还鉴定了其中的还鉴定了其中的8080种种. .另另外用肝素亲和层析将碱性蛋白质富集后外用肝素亲和层析将碱性蛋白质富集后, ,在在6-116-11的范围内的范围内又鉴定了又鉴定了102102个蛋白质个蛋白质, ,其中许多是核酸结合蛋白尤其是核糖体其中许多是核酸结合蛋白尤其是核糖体蛋白蛋白. .华盛顿大学的另一个小组将双向电泳得到的流感嗜血杆华盛顿大学的另一个小组将双向电泳得到的流感嗜血杆菌菌303303个蛋白质斑点进行质谱分析个蛋白质斑点进行质谱分析, ,确定了确定

7、了263263个蛋白质个蛋白质, ,其中大其中大部分是外膜蛋白部分是外膜蛋白, ,以及与能量代谢和大分子合成相关的蛋白质以及与能量代谢和大分子合成相关的蛋白质. .另外发现了几种不能在基因组中找到对应序列的蛋白质另外发现了几种不能在基因组中找到对应序列的蛋白质. .令人令人惊奇的是惊奇的是, ,大约大约22%22%的被鉴定了的蛋白质表现出与预计不同的等的被鉴定了的蛋白质表现出与预计不同的等电点与分子质量电点与分子质量, ,显示它们可能经过了翻译后加工显示它们可能经过了翻译后加工. .大肠杆菌的蛋白质组研究大肠杆菌的蛋白质组研究 大肠杆菌全部大肠杆菌全部40004000多个基因的序列已被测定多个

8、基因的序列已被测定, ,人人们想到如果把双向电泳得到的蛋白质谱与基因组分析结果联们想到如果把双向电泳得到的蛋白质谱与基因组分析结果联合起来合起来, ,就会得到更多有用的信息就会得到更多有用的信息. .基于此想法基于此想法, ,建立蛋白质建立蛋白质 基因联合数据库基因联合数据库, ,希望籍此来回答以下几方面的问题希望籍此来回答以下几方面的问题: : 所所有编码基因的产物在双向图谱上的位置有编码基因的产物在双向图谱上的位置, , 各种蛋白质的丰各种蛋白质的丰度度, , 不同条件下各种蛋白质表达水平及合成速率的变化不同条件下各种蛋白质表达水平及合成速率的变化, , 各种蛋白质在细胞内的定位各种蛋白质

9、在细胞内的定位, , 某些蛋白质翻译后修饰某些蛋白质翻译后修饰的方式及水平的方式及水平. .目前目前, ,大肠杆菌的联合数据库已更新到第六版大肠杆菌的联合数据库已更新到第六版, ,大约包括大约包括16001600个蛋白质斑点的数据个蛋白质斑点的数据, ,其中大约其中大约400400个蛋白质斑个蛋白质斑点已与大约点已与大约350350个基因相对应个基因相对应( (有些基因可能有多个蛋白质产有些基因可能有多个蛋白质产物物),),对于这些蛋白质对于这些蛋白质, ,这个数据库可以提供这个数据库可以提供基因名称、蛋白基因名称、蛋白质名称、质名称、EC EC 编号、功能范畴、编号、功能范畴、Swiss-S

10、wiss-protprot数据库编号、数据库编号、enbankenbank序列号、基因图谱的位置、染色体上的转录方向以及序列号、基因图谱的位置、染色体上的转录方向以及一些生理信息一些生理信息( (如在不同生长条件下该蛋白质在细胞内的丰如在不同生长条件下该蛋白质在细胞内的丰度度).).致病微生物的蛋白质组研究致病微生物的蛋白质组研究 蛋白质组的一个重要应用是在阐明新抗生素作用机理的研蛋白质组的一个重要应用是在阐明新抗生素作用机理的研究上究上. .当今当今, ,细菌对大多数抗生素都有了抗性细菌对大多数抗生素都有了抗性, ,寻找作用于细菌寻找作用于细菌内新的靶子的研究工作已经展开内新的靶子的研究工作

11、已经展开, ,找到了许多有效的抗菌化合找到了许多有效的抗菌化合物物. .但目前遇到的困难在于难以揭示新的化合物的作用靶子及但目前遇到的困难在于难以揭示新的化合物的作用靶子及其作用机理其作用机理. .有时虽在体外发现新化合物能够使某种蛋白质失有时虽在体外发现新化合物能够使某种蛋白质失活活, ,但在体内是否有这种现象和这是否是抗菌的主要机制仍然但在体内是否有这种现象和这是否是抗菌的主要机制仍然未知未知, ,现在双向电泳分析提供了一个有效手段现在双向电泳分析提供了一个有效手段. .例如在研究抑制例如在研究抑制核糖体类抗生素对细菌的作用机制时核糖体类抗生素对细菌的作用机制时, ,对对1212种作用于翻

12、译过程种作用于翻译过程的不同阶段和核糖体内不同分子的抗生素加以考察的不同阶段和核糖体内不同分子的抗生素加以考察, ,发现其中发现其中8 8种诱导冷休克反应的一系列蛋白质种诱导冷休克反应的一系列蛋白质, ,另另4 4种诱导一系列热休克反种诱导一系列热休克反应的蛋白质应的蛋白质, ,因此预计新的作用于核糖体的化合物也是诱导这因此预计新的作用于核糖体的化合物也是诱导这两种反应两种反应, ,并且籍此可以推测大肠杆菌对冷热的反应发生于核并且籍此可以推测大肠杆菌对冷热的反应发生于核糖体水平上糖体水平上. .蛋白质组研究的重要优势在于能够从整体水平上蛋白质组研究的重要优势在于能够从整体水平上分析不同条件下蛋

13、白质谱的变化分析不同条件下蛋白质谱的变化. .例如作为一种差异显示技术例如作为一种差异显示技术, ,这一技术已被用于比较结核分枝杆菌与牛结核分枝杆菌蛋白的这一技术已被用于比较结核分枝杆菌与牛结核分枝杆菌蛋白的不同不同, ,结果发现一些在基因水平上很类似的蛋白在蛋白质水平结果发现一些在基因水平上很类似的蛋白在蛋白质水平上有很大差别上有很大差别, ,这可能部分解释近年来牛痘作为结核病疫苗会这可能部分解释近年来牛痘作为结核病疫苗会出现失败的现象出现失败的现象 酿酒酵母的蛋白质组研究酿酒酵母的蛋白质组研究 利用双向电泳技术分析酵母蛋白谱的工作早于蛋利用双向电泳技术分析酵母蛋白谱的工作早于蛋白质组概念的

14、提出白质组概念的提出. .酿酒酵母酿酒酵母( (SaccharomycesSaccharomyces cerevisiaecerevisiae) )基因组的完成及其蛋白质数据库在互联基因组的完成及其蛋白质数据库在互联网上的建立网上的建立, ,大大加速了这一工作大大加速了这一工作. .最新版的数据库最新版的数据库包括包括60006000多页多页, ,每页代表一个已知或推测的酵母蛋白每页代表一个已知或推测的酵母蛋白. .它包含以下几方面的信息它包含以下几方面的信息: : 以序列为基础的已知以序列为基础的已知和推测的酵母蛋白的特征信息和推测的酵母蛋白的特征信息, ,如分子质量、等电点、如分子质量、等

15、电点、氨基酸组成、多肽片段大小等氨基酸组成、多肽片段大小等; ; 一些研究得到的一些研究得到的关于各种蛋白质在翻译后加工、亚细胞定位、功能关于各种蛋白质在翻译后加工、亚细胞定位、功能分类方面的信息分类方面的信息; ; 从以往的超过从以往的超过50005000篇关于酵母篇关于酵母蛋白研究的文章中获得的有关各种蛋白质功能、相蛋白研究的文章中获得的有关各种蛋白质功能、相互作用、突变表型的信息互作用、突变表型的信息. .借助数据库的有力推动借助数据库的有力推动, ,在双向电泳蛋白质谱上最明显的蛋白质斑点的大部在双向电泳蛋白质谱上最明显的蛋白质斑点的大部分得到鉴定分得到鉴定. . 正在丹麦进行的一项研究

16、计划分别作出野生型正在丹麦进行的一项研究计划分别作出野生型和将基因系统缺失的缺陷型酵母的双向蛋白质图谱和将基因系统缺失的缺陷型酵母的双向蛋白质图谱. .初步的研究表明初步的研究表明, ,缺失单一基因将导致的结果并不缺失单一基因将导致的结果并不只是缺乏此基因编码的蛋白质只是缺乏此基因编码的蛋白质, ,而是能导致其他一而是能导致其他一系列蛋白质量的改变系列蛋白质量的改变. .一些蛋白质减少而另一些蛋一些蛋白质减少而另一些蛋白质增多白质增多, ,当然还有一些蛋白质被加工修饰而导致当然还有一些蛋白质被加工修饰而导致性状改变性状改变. .单一基因缺失的结果总是引起蛋白质组单一基因缺失的结果总是引起蛋白质

17、组全局性的变化全局性的变化. .大约大约20%20%的酵母基因缺失是致死性的的酵母基因缺失是致死性的, ,另外另外80%80%则不然则不然, ,这时机体能通过调节蛋白质的表达这时机体能通过调节蛋白质的表达来对抗这种内源性的变化来对抗这种内源性的变化. .这种基这种基 因缺失的研究可因缺失的研究可能会告诉我们一些关于能会告诉我们一些关于细胞内蛋白质分子间相互细胞内蛋白质分子间相互“对话对话”和和“作用作用”的重要信息的重要信息, ,如蛋白质间的物理如蛋白质间的物理联系联系( (这些蛋白质可能会组成蛋白质复合物这些蛋白质可能会组成蛋白质复合物) )、信号、信号传递途径传递途径, ,以帮助我们了解细

18、胞是如何构成的以及以帮助我们了解细胞是如何构成的以及是如何协同工作的。是如何协同工作的。 多细胞真核生物的蛋白质组研究多细胞真核生物的蛋白质组研究 线虫的蛋白质组研究线虫的蛋白质组研究 果蝇的蛋白质组研究果蝇的蛋白质组研究 人类的蛋白质组研究人类的蛋白质组研究 植物的蛋白质组研究植物的蛋白质组研究线虫的蛋白质组研究线虫的蛋白质组研究 利用双向电泳技术利用双向电泳技术, ,iniini对线虫对线虫( (. .eleganselegans) )进行了蛋白质组分析进行了蛋白质组分析, ,在等电点在等电点3.5-93.5-9和和分子质量分子质量10-20010-200k k的范围内可分辨的范围内可分辨

19、20002000个以上的个以上的蛋白质斑点蛋白质斑点, ,然后利用然后利用微量测序技术对微量测序技术对其中其中2424个斑点进行分析个斑点进行分析, ,得到其中得到其中1212个蛋白质的个蛋白质的端序列端序列. .其余的由于端封闭而未能测出序列其余的由于端封闭而未能测出序列. .已已测出的测出的1212个中有个中有1 1个未能找到与其匹配的基因个未能找到与其匹配的基因. .另另外外1111个与能量代谢、酸性核蛋白、蛋白等对应个与能量代谢、酸性核蛋白、蛋白等对应. . .eleganselegans的的1900019000个基因已于个基因已于19981998年年1212月全部测月全部测出出, ,

20、预计会对蛋白质组的研究提供帮助预计会对蛋白质组的研究提供帮助 果蝇的蛋白质组研究果蝇的蛋白质组研究 不同性别果蝇不同性别果蝇( () )成成虫的头、胸、腹部的蛋白质组图谱虫的头、胸、腹部的蛋白质组图谱已被分别作出已被分别作出, ,总共约有总共约有12001200个蛋白个蛋白质被检出质被检出, ,其中的大多数在头、胸、其中的大多数在头、胸、腹中是相同的腹中是相同的, ,但也发现了一部分其但也发现了一部分其部位、性别特异的蛋白质部位、性别特异的蛋白质. . 人类的蛋白质组研究人类的蛋白质组研究 人类的蛋白质组研究吸引了最多的注意力人类的蛋白质组研究吸引了最多的注意力. .由由于人有着大量的组织、细

21、胞类型和发育阶段于人有着大量的组织、细胞类型和发育阶段, ,对人对人蛋白质组的研究主要聚焦在特异的组织、细胞和蛋白质组的研究主要聚焦在特异的组织、细胞和疾病上疾病上. .已有的证据表明已有的证据表明, ,尽管人的不同组织有着尽管人的不同组织有着很大的功能差别很大的功能差别, ,但其中的许多蛋白质是看家蛋白但其中的许多蛋白质是看家蛋白, ,因此它们的双向图谱可能也是近似的因此它们的双向图谱可能也是近似的. .这点与简单这点与简单生物不同生物不同, ,简单生物在不同的发育阶段有着极不相简单生物在不同的发育阶段有着极不相同的蛋白质组同的蛋白质组. .因此对于人类来说因此对于人类来说, ,一个高质量的

22、一个高质量的基本的双向图谱是非常有用的基本的双向图谱是非常有用的, ,它可以作为其他组它可以作为其他组织、细胞的参照图谱织、细胞的参照图谱. .人的各种组织、器官、细胞人的各种组织、器官、细胞乃至各种细胞器已被广泛研究乃至各种细胞器已被广泛研究. .植物的蛋白质组研究植物的蛋白质组研究 人的各种体液人的各种体液( (血液、淋巴、脊髓、乳汁和血液、淋巴、脊髓、乳汁和尿等尿等) )都被用于研究与某些疾病的关系都被用于研究与某些疾病的关系. .最近澳最近澳大利亚科学家利用双向电泳技术研究眼泪中的大利亚科学家利用双向电泳技术研究眼泪中的蛋白质与生理状态的关系蛋白质与生理状态的关系. .他们发现了一种新

23、他们发现了一种新的蛋白质的蛋白质, ,这个蛋白质非常相似于在乳腺癌细这个蛋白质非常相似于在乳腺癌细胞里高表达的另一种蛋白质胞里高表达的另一种蛋白质. .这个发现可能会这个发现可能会提供疾病诊治的新的手段提供疾病诊治的新的手段. .在一项利用蛋白质在一项利用蛋白质组研究技术进行的酒精对人体毒性的研究中发组研究技术进行的酒精对人体毒性的研究中发现现, ,乙醇会改变血清蛋白糖基化作用乙醇会改变血清蛋白糖基化作用, ,导致许多导致许多糖蛋白的糖基缺乏糖蛋白的糖基缺乏, ,如转铁蛋白。如转铁蛋白。 肿瘤至今仍是人类的一个顽敌肿瘤至今仍是人类的一个顽敌. .癌细胞不癌细胞不仅有许多特异蛋白质产物仅有许多特

24、异蛋白质产物, ,而且这些产物还会而且这些产物还会影响其他蛋白质的翻译后加工及许多蛋白质的影响其他蛋白质的翻译后加工及许多蛋白质的表达水平表达水平. .肿瘤的蛋白质组研究能提供一些以肿瘤的蛋白质组研究能提供一些以往其他技术所不能提供的早期诊断依据往其他技术所不能提供的早期诊断依据, ,例如例如利用不同细胞组织的特征蛋白质谱利用不同细胞组织的特征蛋白质谱, ,可以判别可以判别一些难以判定来源的肿瘤细胞的来源一些难以判定来源的肿瘤细胞的来源. .丹麦的丹麦的一个小组利用蛋白质组研究技术结合组织冰冻一个小组利用蛋白质组研究技术结合组织冰冻切片技术分析了切片技术分析了150150例膀胱癌病人的组织例膀

25、胱癌病人的组织, ,发现发现在所有的鳞状细胞瘤的尿液中均能发现一种化在所有的鳞状细胞瘤的尿液中均能发现一种化学引诱剂学引诱剂银屑素银屑素( (),),推测其极可能作为这种肿瘤的早期标志物推测其极可能作为这种肿瘤的早期标志物. .基因组计划无疑为医疗、医药领域带来一场革基因组计划无疑为医疗、医药领域带来一场革命命, ,但也应该看到但也应该看到, ,单纯的遗传分析很难诊断多因单纯的遗传分析很难诊断多因素的疾病素的疾病. .复杂的基因间相互作用复杂的基因间相互作用, ,细胞内活动和细胞内活动和环境的影响都会影响基因的表达及蛋白质的翻译环境的影响都会影响基因的表达及蛋白质的翻译后加工后加工. .因此因

26、此, ,可靠的诊断和治疗应基于机体渐进可靠的诊断和治疗应基于机体渐进发展过程的调控及失调发展过程的调控及失调, ,并且必须考虑到环境因素并且必须考虑到环境因素的影响的影响. .蛋白质组的研究正是探索这一领域的有力蛋白质组的研究正是探索这一领域的有力武器武器. .人们不难预期人们不难预期, ,基因组计划的不断推进会给基因组计划的不断推进会给蛋白质组研究提供更多更全的数据库蛋白质组研究提供更多更全的数据库; ;生物信息学生物信息学的发展会给蛋白质组计划提供更方便有效的计算的发展会给蛋白质组计划提供更方便有效的计算机分析软件机分析软件; ;国际互联网会使各国各领域科学家有国际互联网会使各国各领域科学

27、家有关蛋白质组研究的成果出现新的集成关蛋白质组研究的成果出现新的集成; ;新的技术会新的技术会不断涌现不断涌现, ,蛋白质组研究方法会象技术一样蛋白质组研究方法会象技术一样易于操作易于操作, ,并渗透到人类活动的方方面面并渗透到人类活动的方方面面, ,对工业、对工业、农业、医疗卫生各行各业带来新的革命农业、医疗卫生各行各业带来新的革命 功能蛋白质组学功能蛋白质组学功能蛋白质组学的提出及概念功能蛋白质组学的提出及概念 功能蛋白质组学是指从动态和整体的角度研究蛋白质的功能蛋白质组学是指从动态和整体的角度研究蛋白质的功能及其结构基础，是位于对个别蛋白质的传统研究和以功能及其结构基础，是位于对个别蛋白

28、质的传统研究和以全部蛋白质为研究对象的蛋白质组研究之间的层次。全部蛋白质为研究对象的蛋白质组研究之间的层次。功能蛋白质组学的研究内容功能蛋白质组学的研究内容 蛋白质群体研究蛋白质群体研究 数据库 说明 WWW地址蛋白质序列库:SWISS-PROT 内容丰富,提示详尽 http:/www.expasy.ch/sport/PIR较 http:/www-nbrf.georgetown.edu/pir/pir-psi.htmlTrEMBL (EMBL的翻译) http:/www.expasy.ch/sprot/OWL (非冗余库) http:/www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbb

29、rowser/OWL/OWL.html核苷酸数据库:EMBL 欧州分子生物学http:/www.ebi.ac.uk/ebi-docs/embl-db/ebi/topembl.htmlGenBank美国生物工程信息中心http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Search/index.htmldbESTCDNA序列标记http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/模体与域:PROSITE 序列模体 http:/www.expasy.ch/sport/prosite.htmlBLOCKS 保守序列 http:/www.blocks.fhcrc.org/ Pr

30、oDom蛋白质域http:/protein.toulouse.inra.fr/prodom.htmlSBASE蛋白质域http:/base.icgeb.trieste.it/sbase/二维电泳(2DPAGE):WORLD-2DPAGE国际2DPAGE库的完整索引http:/www.expasy.ch/ch2d/2d-index.htmlLinksto2DPAGEPhoretix公司的连络表http:/ 表3用于蛋白质鉴定的数据库搜索软件属性参数/软件名称 WWW地址蛋白质质量+蛋白质序列标记PeptideSearchhttp:/www.mann.embl-heidelberg.de/Serv

31、ices/PeptideSearch/PeptideSearchIntro.htmlTagIdenthttp:/expasy.hcuge.ch/sprot/tagident.html蛋白质的肽质印记:MassSearchhttp:/cbrg.inf.ethz.ch/subsection3-1-3.htmlMS-Fithttp:/falcon.ludwig.ucl.ac.uk/ucsfhtml/msfit.htmPetideSearchhttp:/www.mann.embl-heidelberg.de/Services/PeptideSearch/PeptideSearchIntro.htmlP

32、roFoundhttp:/prowl.rockefeller.edu/PROWL/prot-id-main.html表3用于蛋白质鉴定的数据库搜索软件属性参数/软件名称 WWW地址蛋白质质量+蛋白质序列标记PeptideSearchhttp:/www.mann.embl-heidelberg.de/Services/PeptideSearch/PeptideSearchIntro.htmlTagIdenthttp:/expasy.hcuge.ch/sprot/tagident.html蛋白质的肽质印记:MassSearchhttp:/cbrg.inf.ethz.ch/subsection3-1

33、-3.htmlMS-Fithttp:/falcon.ludwig.ucl.ac.uk/ucsfhtml/msfit.htmPetideSearchhttp:/www.mann.embl-heidelberg.de/Services/PeptideSearch/PeptideSearchIntro.htmlProFoundhttp:/prowl.rockefeller.edu/PROWL/prot-id-main.htmlMultiIdenthttp:/expasy.hcuge.ch/sprot/multiident.html 蛋白质组学研究的手段蛋白质组学研究的手段蛋白质组分析概述蛋白质组分析

34、概述蛋白质组研究的核心蛋白质组研究的核心用于分离的双向电泳用于分离的双向电泳(2 -DE) 蛋白质组研究的百科全书蛋白质组研究的百科全书数据库数据库(database) 蛋白质组技术的支柱蛋白质组技术的支柱鉴定技术鉴定技术(Identication)蛋白质组技术的规模蛋白质组技术的规模高流通量筛选高流通量筛选(HTS) 目前双向凝胶电泳一般只能分辨到目前双向凝胶电泳一般只能分辨到1000-30001000-3000个蛋个蛋白质点白质点( (SPOT),SPOT),而一个细胞系可以表达上万个基因而一个细胞系可以表达上万个基因, ,加加上蛋白质加工修饰的多样性上蛋白质加工修饰的多样性, ,一个样品

35、中的蛋白种类可一个样品中的蛋白种类可达达10106 6种。因此种。因此, ,对于一些低拷贝蛋白对于一些低拷贝蛋白, ,通常先将蛋白粗通常先将蛋白粗提液通过亲和柱纯化提液通过亲和柱纯化, ,再由一维或二维电泳分离。单向再由一维或二维电泳分离。单向电泳的优点在于几乎所有蛋白质均溶于电泳的优点在于几乎所有蛋白质均溶于, ,分子量分子量在在10000-30000010000-300000范围内均能有效分离范围内均能有效分离, ,极酸、极碱蛋白极酸、极碱蛋白极易检出。双向凝胶电泳极易检出。双向凝胶电泳(2-(2-dimensional gel dimensional gel electrophoresi

36、s)electrophoresis)原理简明原理简明, ,第一向进行等电聚焦第一向进行等电聚焦, ,蛋蛋白质沿梯度分离白质沿梯度分离, ,至各自的等电点至各自的等电点; ;随后随后, ,在沿垂直在沿垂直的方向进行分子量的分离。的方向进行分子量的分离。8080年代固相化梯度年代固相化梯度( (, ,IPG)IPG)的发明和完善的发明和完善, ,解决了梯度不稳的问题解决了梯度不稳的问题, ,使使2-2-的重复性和上样量大为改善。的重复性和上样量大为改善。双向双向凝胶电泳（凝胶电泳（2-2-DEDE）样品的制备样品的制备高分辨率和重复性高分辨率和重复性 分离后的斑点检测分离后的斑点检测(spot d

37、etection) 概念概念 蛋白质组研究的发展以双向电泳技蛋白质组研究的发展以双向电泳技术作为核心术作为核心. . 双向电泳由双向电泳由arrellarrell，s s于于19751975年首次建立并成功地年首次建立并成功地分离约分离约10001000个个 蛋白蛋白, ,并表并表明蛋白质谱不是稳定的明蛋白质谱不是稳定的, ,而是随环境而而是随环境而变化变化 。双向电泳原理简明。双向电泳原理简明, ,第一向进第一向进行等电聚焦行等电聚焦, ,蛋白质沿梯度分离至蛋白质沿梯度分离至各自的等电点各自的等电点, ,随后随后, ,再沿垂直的方向再沿垂直的方向进行分子量的分离进行分子量的分离. . 目前目

38、前, ,随着技术的随着技术的飞速发展飞速发展, ,已能分离出已能分离出1000010000个斑点个斑点( () ) 样品制备和溶解同样事关样品制备和溶解同样事关2- 的成效的成效,目标是尽可能目标是尽可能扩大其溶解度和解聚扩大其溶解度和解聚,以提高分辨率以提高分辨率 用化学法和机械裂解用化学法和机械裂解法破碎以尽可能溶解和解聚蛋白法破碎以尽可能溶解和解聚蛋白,两者联合有协同作用两者联合有协同作用 对对样品的预处理涉及溶解、变性和还原来完全破坏蛋样品的预处理涉及溶解、变性和还原来完全破坏蛋白间的相互作用白间的相互作用,并除去如核酸等非蛋白物质并除去如核酸等非蛋白物质 。理想的状。理想的状态是人们

39、应一步完成蛋白的完全处理态是人们应一步完成蛋白的完全处理 。低丰度蛋白在细胞。低丰度蛋白在细胞内可能具有重要的调节功能内可能具有重要的调节功能,代表蛋白质组研究的代表蛋白质组研究的“冰山之冰山之尖尖”,故分高低丰度蛋白是一种挑战亚细胞分级和蛋白质预故分高低丰度蛋白是一种挑战亚细胞分级和蛋白质预分级、提高加样量分级、提高加样量(已达到已达到115级的标准级的标准) 、应用敏、应用敏感性检测感性检测,可以提高其敏感性可以提高其敏感性 如一种多肽免疫如一种多肽免疫2 -印迹印迹是利用几种单克隆抗体技术来分析和检测提高组蛋白和核是利用几种单克隆抗体技术来分析和检测提高组蛋白和核糖体蛋白等碱性蛋白的分离

40、是另一难点，糖体蛋白等碱性蛋白的分离是另一难点， 由于碱性范由于碱性范围内凝胶基质的不稳定及逆向电渗流的产生围内凝胶基质的不稳定及逆向电渗流的产生,对对pI超过超过10的的碱性蛋白碱性蛋白,通过产生通过产生010%的山梨醇梯度和的山梨醇梯度和16%的异丙醇的异丙醇可减少之，可减少之， 亦可用双甲基丙烯酰胺来增加基质的稳定性。亦可用双甲基丙烯酰胺来增加基质的稳定性。 2 -2 -面临的挑战是高分辨率和重复性面临的挑战是高分辨率和重复性 ：高分：高分辨率确保蛋白最大程度的分离辨率确保蛋白最大程度的分离, ,高重复性允许进行凝胶高重复性允许进行凝胶间配比间配比. .对对2-2-而言而言, ,有有3

41、3种方法分离蛋白种方法分离蛋白: 1): 1)ISO-ISO-DALTDALT以以FarrellFarrell, ,s s技术为基础技术为基础 第一向应用载体两性第一向应用载体两性电解质电解质, ,在管胶内建立梯度在管胶内建立梯度 随着聚焦时间的延长随着聚焦时间的延长, ,梯度不稳梯度不稳, ,易产生阴极漂易产生阴极漂.2).2)NEPHNEPH用于分离碱用于分离碱性蛋白性蛋白( (7.0) 7.0) 如果聚焦达到平衡状态如果聚焦达到平衡状态, ,碱性蛋白碱性蛋白会离开凝胶基质而丢失会离开凝胶基质而丢失 因此因此, ,在等电区域的迁移须在在等电区域的迁移须在平衡状态之前完成平衡状态之前完成,

42、,但很难控制但很难控制 3) 3)IPG-DALTIPG-DALT发展于发展于8080年代早期年代早期. .由于固相梯度的出现解决了梯度不由于固相梯度的出现解决了梯度不稳的问题稳的问题 . .通过通过immobilineimmobiline共价偶联于丙烯酰共价偶联于丙烯酰胺产生固定的梯度胺产生固定的梯度, ,克服了的缺点克服了的缺点, ,从而达从而达到高度的重复性到高度的重复性 目前可以精确制作线性、渐进性和目前可以精确制作线性、渐进性和型曲线型曲线, ,范围或宽或窄的梯度范围或宽或窄的梯度. . 新的酸性新的酸性3-53-5或碱性或碱性6-116-11的的IPGIPG凝胶梯度联合商品化的凝胶

43、梯度联合商品化的4-74-7的梯度可对蛋白质形成蛋白质组重叠群从而有效分离的梯度可对蛋白质形成蛋白质组重叠群从而有效分离. . 分离后的斑点检测分离后的斑点检测( () )亦很重要亦很重要 . .所采用的检测策略和分离后所采用的所采用的检测策略和分离后所采用的方法的相互作用是很重要的方法的相互作用是很重要的. . 此外此外, ,还需考虑反应的还需考虑反应的线性、饱和阈线性、饱和阈/ /动态范围、敏感性、对细胞蛋白群的动态范围、敏感性、对细胞蛋白群的全体定量分析的适应性、可行性全体定量分析的适应性、可行性. . 目前目前, ,没有一种蛋没有一种蛋白染色覆盖广泛的浓度和及分离后分析技术白染色覆盖广

44、泛的浓度和及分离后分析技术. . 银染已成为一种检测银染已成为一种检测2- 2- D D的流行方法的流行方法, ,可检测少到可检测少到2 25 5的蛋白的蛋白, ,因此较考马斯亮蓝因此较考马斯亮蓝- 250- 250敏感敏感. . 多数糖蛋白不能被考马斯亮蓝染色多数糖蛋白不能被考马斯亮蓝染色, ,一些有机染料不一些有机染料不适于膜适于膜 放射性标记不依赖其代谢的活性放射性标记不依赖其代谢的活性, ,并仅适于对合成的蛋白质检测并仅适于对合成的蛋白质检测. .另有一种改良的另有一种改良的2- 2- ( (差异凝胶电泳差异凝胶电泳),),即应用两种不同的染料荧光标即应用两种不同的染料荧光标记两个样品

45、记两个样品, ,使在同一凝胶上电泳后的凝胶图象为两使在同一凝胶上电泳后的凝胶图象为两个个, ,避免了几种避免了几种2 -2 -的比较的比较, ,可在纳克级进行检测可在纳克级进行检测. . 蛋白质组技术的支柱蛋白质组技术的支柱鉴定技术鉴定技术 与质谱与质谱(mass spectrometry)相关的技术相关的技术 氨基酸组分分析氨基酸组分分析 图象分析技术图象分析技术(Image analysis) 微量测序微量测序(micro-sequencing) 肽肽质质指纹术指纹术（peptide mass fingerprint,PMF） 肽片段肽片段（peptide fragment)的部分测序的部

46、分测序 质谱技术的现状质谱技术的现状 质谱技术的应用质谱技术的应用质谱技术的应用质谱技术的应用 蛋白质和蛋白质和DNA的序列测定的序列测定 分析复合体的蛋白质组分析复合体的蛋白质组 研究蛋白质修饰研究蛋白质修饰 分析单核苷酸多态性分析单核苷酸多态性 研究生物分子的相互作用研究生物分子的相互作用 鉴定蛋白质的三维结构鉴定蛋白质的三维结构图象分析技术图象分析技术“满天星满天星”式的式的2 图谱分析不能依靠本能的直觉图谱分析不能依靠本能的直觉,每每一个图象上斑点的上调、下调及出现、消失一个图象上斑点的上调、下调及出现、消失,都可能在生理和都可能在生理和病理状态下产生病理状态下产生,必须依靠计算机为基

47、础的数据处理必须依靠计算机为基础的数据处理,进行定量进行定量分析分析 在一系列高质量的在一系列高质量的2 凝胶产生凝胶产生(低背景染色低背景染色,高度的高度的重复性重复性)的前提下的前提下,图象分析包括斑点检测、背景消减、斑点配图象分析包括斑点检测、背景消减、斑点配比和数据库构建。比和数据库构建。 首先首先,采集图象通常所用的系统是电荷耦合采集图象通常所用的系统是电荷耦合(charge coupled device) 照相机照相机;激光密度仪激光密度仪(laser densitometers)和和Phospho或或Fluoro-imagers,对图象进行数字化对图象进行数字化 并成为以象素并成

48、为以象素(pixels)为基础的空间和网格为基础的空间和网格 其次其次,在图象灰度在图象灰度水平上过滤和变形水平上过滤和变形,进行图象加工进行图象加工,以进行斑点检测以进行斑点检测. 利用利用laplacian Gaussian, DOG(difference of Gaussians) opreator使使有意义的区域与背景分离有意义的区域与背景分离,精确限定斑点的强度、面积、周长精确限定斑点的强度、面积、周长和方向和方向 图象分析检测的斑点须与肉眼观测的斑点一致图象分析检测的斑点须与肉眼观测的斑点一致 在这一在这一原则下原则下,多数系统以控制斑点的重心或最高峰来分析多数系统以控制斑点的重心

49、或最高峰来分析,边缘检测边缘检测的软件可精确描述斑点外观的软件可精确描述斑点外观,并进行边缘检测和邻近分析并进行边缘检测和邻近分析,以增以增加精确度加精确度 通过阈值分析、边缘检测、销蚀和扩大斑点检测的通过阈值分析、边缘检测、销蚀和扩大斑点检测的基本工具还可恢复共迁移的斑点边界基本工具还可恢复共迁移的斑点边界 联邦数据库互渗事例联邦数据库互渗事例用肽用肽序列标记搜索序列标记搜索dbEST库库 CID谱和肽序列标记谱和肽序列标记 从从dbEST中搜索到的匹配序列中搜索到的匹配序列从从SW ISS-2DPAGE的人肝参考图中蛋白斑点的击示事例的人肝参考图中蛋白斑点的击示事例 a-乳清蛋白的一个酶解

50、肽段的乳清蛋白的一个酶解肽段的CID谱谱 翻译后修饰的自动解释的示意图翻译后修饰的自动解释的示意图Protein sampleImage analysisProtein in gelProtein on membraneProtein in solution2-D PAGEExcisionBlottingElutionPartial degradationPeptide mixtureMass of proteinN-terminalsequenceMSEdman degradation Peptide mass fingerprintPeptide sequence MS/MS dataDa

51、tabase searchingNovel or previously studied proteinCharacterization of post-translocation modifications蛋蛋 白白 质质 组组 的的 分分 析析 流流 程程成像成像分析软件分析软件MelanieII功能示意图功能示意图 差异蛋白质组研究差异蛋白质组研究 差异蛋白质组学的研究在技术上有更高的差异蛋白质组学的研究在技术上有更高的 可实现性可实现性 差异蛋白质组学反映了蛋白质的动态本质差异蛋白质组学反映了蛋白质的动态本质 差异蛋白质组学具有广泛和明确的应用前景差异蛋白质组学具有广泛和明确的应用前景差异蛋白质组学的研究方法差异蛋白质组学的研究方法 双向电泳双向电泳 用于蛋白质定量和比较研究的质用于蛋白质定量和比较研究的质 谱相关技术谱相关技术 SELDI蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术