《多聚酶链式反应扩增DNA片段.PPT》由会员分享，可在线阅读，更多相关《多聚酶链式反应扩增DNA片段.PPT（23页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、实验四 PCR基因扩增1.实验目的l通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。2.实验原理l聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。l在待扩增的DNA片断两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。3.PCR技术的原理l1.变性：在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA，称之为变性。l2.退火：是模板与引物的复性。引物是与模板某区序列互补的一小段DNA片段。l3.延伸：从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，将四种脱
2、氧核苷酸以碱基配对形式按53的方向沿着模板顺序合成新的DNA链。4.(c)(c)(b)(b)引物引物引物引物2 2553333335555(d)(d)新引物新引物新引物新引物5533靶靶靶靶DNADNA的扩增的扩增的扩增的扩增(a)(a)5533引物引物引物引物1 13 3 553355引物引物引物引物2 2互补链互补链互补链互补链引物引物引物引物1 1互补链互补链互补链互补链单位长度的链单位长度的链单位长度的链单位长度的链不同长度的链不同长度的链不同长度的链不同长度的链5 5 3 3 3355引物引物引物引物1 1互补链互补链互补链互补链引物引物引物引物2 2互补链互补链互补链互补链目的片段
3、（不同长度的链未示出）目的片段（不同长度的链未示出）目的片段（不同长度的链未示出）目的片段（不同长度的链未示出）聚合酶链式反应示意图聚合酶链式反应示意图聚合酶链式反应示意图聚合酶链式反应示意图(e)(e)(f)(f)(g)(g)5.6.7.8.9.10.温度温度温度温度（）时间时间时间时间（minmin）9494727260609494变性变性变性变性（1min1min）60 60 退火退火退火退火（1min1min）72 72 延伸延伸延伸延伸（1.5min1.5min）循环循环循环循环1 1 循环循环循环循环2 2 循环循环循环循环3 3PCRPCRPCRPCR反应的温度循环周期反应的温度
4、循环周期反应的温度循环周期反应的温度循环周期PCR PCR PCR PCR 反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由DNADNADNADNA变性、引变性、引变性、引变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是应参数是应参数是应参数是94949494变性变性变性变性1min1min1min1min， 60 60 60 60 退火退火退火退火1min1min1min1min
5、， 72 72 72 72 延延延延伸伸伸伸1.5min1.5min1.5min1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增产。如此周而复始，重复进行，直至扩增产。如此周而复始，重复进行，直至扩增产。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。物的数量满足实验需求为止。物的数量满足实验需求为止。物的数量满足实验需求为止。11.一般一般PCR反应条件反应条件12.实验仪器电泳仪电泳仪13.琼脂糖凝胶电泳槽琼脂糖凝胶电泳槽琼脂糖凝胶电泳槽琼脂糖凝胶电泳槽14.PCR仪仪15.凝胶成像系统凝胶成像系统凝胶成像系统凝胶成像系统16.移液器移液器17.实验材料l1、DNA模板l2、4种
6、dNTPl3、引物1、引物2l4、Taq酶l5、琼脂糖l6、DNA相对分子质量标准物l7、吸头、50ulPCR管18.试剂l10PCR缓冲液(含Mg2)l4dNTP(每种1mmol)lTag酶1U/ullDNA模板l引物1:5-GGGGAATTCATGGTGAGCAAGGGC-3l引物2:5-GACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGC-3 l引物溶液浓度10pmol/ul19.实验步骤l1在0.5mlRCR管内配置20ul反应体系：CK(ul)1#(ul)模板01引物10.40.4引物20.40.410 PCR Buffer22Taq酶0.50.5dNTPs0.40.4ddH2O14.3
7、15.3Total202020.PCRPCR反应程序反应程序(1) 94(1) 94(1) 94(1) 94变性变性变性变性5min5min5min5min，(2) 94(2) 94(2) 94(2) 94变性变性变性变性1min1min1min1min， (3) 52 (3) 52 (3) 52 (3) 52 退火退火退火退火1min1min1min1min， (4) 72 (4) 72 (4) 72 (4) 72 延伸延伸延伸延伸1min1min1min1min。(5) (5) (5) (5) 重复重复重复重复(2)-(4)30(2)-(4)30(2)-(4)30(2)-(4)30次次次次（6 6 6 6）72 72 72 72 延伸延伸延伸延伸1min1min1min1min。21.实验报告l要求：l1、写出本实验目的、原理；l2、实验器材及实验步骤；l3、列出实验结果示意图并分析原因。22.实验结果PCR结果。1、对照(无模板)；26、PCR产物（5ul样品）23.
