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1、信号信号转导通路通路研究策略和研究策略和常用方法常用方法 搞懂信号通路搞懂信号通路 查找文献，找文献，了解信号系了解信号系统的研究的研究进展和展和热点点 找到研究点找到研究点功能分析功能分析表达分析表达分析如何分析信号蛋白？如何分析信号蛋白？ 何何时何地表达何地表达 基因基因过表达表达，或，或基因基因沉默沉默( (细胞水平和整体水平胞水平和整体水平) ) 相互作用蛋白相互作用蛋白 立体立体论证 基因水平基因水平 转录水平转录水平 转录后加工转录后加工 翻译水平翻译水平 翻译后加工翻译后加工 mRNA和蛋白质降解和蛋白质降解蛋白质基因表达可以在不同层次上调节蛋白质基因表达可以在不同层次上调节基因
2、表达分析方法基因表达分析方法启启动子分析子分析:- EMSA- Reporter gene assay- CHIP assay- Nuclear Run-on assay- DNA Foot-printing assay- DNA truncation and site-directed mutagenesis翻翻译水平分析水平分析:- Western Blots- Immunocytochemistry Immunohistochemistry- Protein modification- Proteomics转录水平分析水平分析:- RT-PCR- Real Time PCR- In si
3、tu hybridization- Northern blots- RNase protection assay - Primer extention assay比比较转录组学学:- Differential screening- Subtractive hybridization- Differential display- Array-based methods1. 蛋白蛋白质表达水平和表达水平和细胞内定位研究胞内定位研究 信号蛋白分子表达水平信号蛋白分子表达水平检测: Western blot analysis. ELISA Proteomics 信号蛋白分子在信号蛋白分子在细胞内定位研
4、究胞内定位研究: : Immunohistochemistry / Immunocytochemistry Immunofluorescence (IF) Green fluorescent protein (GFP)-fusion proteintypically, live cells.印迹技印迹技术 blottingn将在凝胶中分离的生物大分子将在凝胶中分离的生物大分子转移到固相化介移到固相化介质上，并加上，并加以以检测分析的技分析的技术。n应用：用：DNA、RNA、蛋白、蛋白质的的检测 DNA 印迹印迹: Southern blottingRNA 印迹印迹: Northern blot
5、ting蛋白蛋白质印迹印迹: Western blottingn又又称称蛋蛋白白质印印迹迹技技术或或免免疫疫印印迹迹技技术。蛋蛋白白质经聚聚丙丙烯酰胺胺凝凝胶胶电泳泳分分离离后后转移移（电转）至至膜膜性性支支持持物物上上(NC(NC膜膜）, ,再与溶液中的抗体相互再与溶液中的抗体相互结合的技合的技术。n主主要要用用于于检测样品品中中特特异异性性蛋蛋白白质的的存存在在、细胞胞中中特特异异蛋蛋白白质的的半半定定量量分分析析、蛋蛋白白质化化学学修修饰（磷磷酸酸化化），以以及蛋白及蛋白质分子分子间的相互作用研究等。的相互作用研究等。Western blottingElectrophoresis转膜膜
6、Protein HRPDABH2O21Ab2Ab抽提抽提细胞蛋白，定量胞蛋白，定量聚丙聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶电泳泳与特异性抗体与特异性抗体杂交。交。根据根据标记物特点物特点显色色硝酸硝酸纤维素膜素膜目的蛋白目的蛋白质抗目的蛋白一抗抗目的蛋白一抗标记的二抗的二抗偶偶联的碱的碱性磷酸性磷酸酶磷酸化生色体系磷酸化生色体系脱磷酸脱磷酸显色色采用采用Western blot方法方法检测蛋白蛋白质原理示意原理示意图应用举例应用举例n某某药物是否可引起目的蛋白的表达物是否可引起目的蛋白的表达变化（上化（上调或下或下调）？）？ 分分别抽提抽提细胞蛋白（未胞蛋白（未处理、理、药物物处理），定量理），定量 相同相同
7、质量上量上样，聚丙，聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶电泳泳 印迹（印迹（电转移）移） 杂交（抗体）交（抗体） 显色色/ /显影影 根据根据显影影结果判断：果判断：内参内参目目标蛋白蛋白检测标本很多的情况检测标本很多的情况下下WesternWestern 无法满足高通量的需求无法满足高通量的需求ELISA / Phosphospecific-ELISAs (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 检测蛋白蛋白质表达量或者活性状表达量或者活性状态 (化学修化学修饰饰-磷酸化磷酸化) 比比western blot更快速、更高效更快速、更高效.蛋白蛋白质组（proteome）：）：
8、一个基因一个基因组所表达的全部蛋白所表达的全部蛋白质.蛋白蛋白质组学（学（proteomics)： 研究研究细胞、胞、组织或生物体蛋白或生物体蛋白质组成及其成及其变化化规律的科学。律的科学。 蛋白蛋白质组学学(Proteomics) 同一基因同一基因组在不同在不同细胞、不同胞、不同组织中的表中的表达情况各不相同；达情况各不相同； 在空在空间和和时间上呈上呈动态变化化蛋白蛋白质组学研究技学研究技术平台平台 ( (高效率高效率, ,高通量高通量) )n 双向双向电泳分离泳分离样品蛋白品蛋白质n 蛋白蛋白质点的定位和切取点的定位和切取n 质谱分析分析第一向：第一向：等等电聚焦聚焦电泳泳 （IEF）第
9、二向：第二向：SDS-PAGE电泳泳 免疫免疫荧光技光技术Immunofluorescence (IF) n利用某些利用某些荧光素如光素如FITC等通等通过化学反化学反应与抗体或其它蛋白与抗体或其它蛋白结合制合制备成成荧光探光探针，然后与被，然后与被测抗原或配体抗原或配体发生特异性生特异性结合，形成的合，形成的荧光复合物在一定波光复合物在一定波长光的激光的激发下可下可产生生荧光，因此利用光，因此利用荧光光显微微镜可可对抗原抗原进行定性或定位行定性或定位检测。n采用流式采用流式细胞免疫胞免疫荧光技光技术（FCM）可从）可从单细胞水平胞水平检测不同不同细胞胞亚群中的蛋白群中的蛋白质分子，用两种不同
10、的分子，用两种不同的荧光素分光素分别标记抗不同蛋白抗不同蛋白质分子的抗体，可在同一分子的抗体，可在同一细胞内同胞内同时检测两种不同的分子（两种不同的分子（Double IF），也可用多参数流式，也可用多参数流式细胞胞术对胞内多种分子胞内多种分子进行行检测。2. 蛋白蛋白质与蛋白与蛋白质相互作用研究技相互作用研究技术: Co-IP（免疫共沉淀免疫共沉淀） with antibody against one protein followed by Western blot with antibody against another protein GST pull-down assay Yeast
11、 two-hybrid assay FRET (fluorescence resonance energy transfer) assayagarose beadn IP 是利用抗原蛋白是利用抗原蛋白质和抗体的特异性和抗体的特异性结合以及合以及细菌蛋白菌蛋白质的的“protein A/G”能特异能特异结合免疫球蛋白合免疫球蛋白FC片段的片段的现象而象而发展展的方法。目前多用精制的的方法。目前多用精制的protein A/G预先先结合固化在合固化在agarose beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，后，beads上的上的prorein A/G就能吸附抗
12、原抗体达到沉淀抗原的目的。就能吸附抗原抗体达到沉淀抗原的目的。proteinA抗原抗原抗体抗体YABY裂解细胞裂解细胞 免疫沉淀蛋白质免疫沉淀蛋白质X免疫共沉淀（免疫共沉淀（Co-IP）技）技术 非非变性条件下裂解性条件下裂解时，完整，完整细胞内存在的胞内存在的许多蛋白多蛋白质蛋白蛋白质间的相互作用被保留了下来。若用蛋白的相互作用被保留了下来。若用蛋白质X的抗体免疫沉的抗体免疫沉淀淀X，那么与，那么与X在体内在体内结合的蛋白合的蛋白质Y也能沉淀下来。也能沉淀下来。进一步一步进行行Western Blot和和质谱分析。常用于分析。常用于测定两种目定两种目标蛋白蛋白质是否在体内是否在体内结合，也可
13、用于确定一种特定蛋白合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用的新的作用搭档。搭档。缺点：可能缺点：可能检测不到低不到低亲和力和瞬和力和瞬间的蛋白的蛋白质相互作用。相互作用。Western Blot和和质谱分析分析Co-IP工作示意图工作示意图Co-immunoprecipitationbindingwashelutionYYYYYGST融合蛋白融合蛋白进行行Pulldown实验GST pull-down assay 原理原理 将将GST融合蛋白融合蛋白(tagged protein (标记蛋白蛋白) or the bait (饵蛋白蛋白)，GST, His6, Flag, biotin )作作
14、为探探针，与溶液中的特异性搭档蛋白与溶液中的特异性搭档蛋白(test protein, or prey被扑被扑获蛋白蛋白)结合，然后根据谷胱甘合，然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能脂糖球珠能够沉淀沉淀GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在发现抗体干抗体干扰蛋白蛋白质蛋白蛋白质之之间的相互作用的相互作用时，可以启，可以启用用GST沉降技沉降技术。该方法只是用于确定体外的相互作用。方法只是用于确定体外的相互作用。GST-Pulldown Assay转录激活因子激活因子DNA结合合结构域构域(BD)转录激活激活结构域构域(AD)酵母双酵母双杂交技交技术
15、酵母双酵母双杂交技交技术是一种基于是一种基于转录重建而建立的重建而建立的研究生物大分子相互作用的研究生物大分子相互作用的简便而有效的研究方法。便而有效的研究方法。n在酵母在酵母细胞中分析蛋白胞中分析蛋白质相互作用。相互作用。n以真核以真核细胞胞转录激活因子的激活因子的结构构为基基础。n将将编码某某一一蛋蛋白白X的的DNADNA序序列列与与DNADNA结合合域域BDBD的的编码序序列列融融合合形形成成一一个个杂交交体体( (“诱饵”bait)bait)，将将编码另另一一蛋蛋白白Y的的DNADNA序序列列与与DNADNA激激活活域域ADAD的的编码序序列列融融合合形形成成另另一一个个杂交交体体(
16、(“猎物物”或靶蛋白或靶蛋白prey or target protein);prey or target protein);n当当两两个个杂交交体体共共转化化酵酵母母细胞胞（此此酵酵母母细胞胞含含有有上上游游有有DNADNA结合合位位点点的的报告告基基因因），若若X和和Y没没有有相相互互作作用用，则单独独不不能能激激活活报告告基基因因的的转录；若若X X和和Y Y可可相相互互作作用用，则使使BDBD和和ADAD靠靠近近形形成成一一个个有有效效的的转录激激活活子子，激激活活报告告基基因因的的转录。因因此此可可通通过检测报告告基基因因的的转录来来研研究究蛋蛋白白质X X和和Y Y的的相互作用。但限
17、于核内表达的蛋白相互作用。但限于核内表达的蛋白质的相互作用。的相互作用。酵母双酵母双杂交系交系统 荧光光共共振振能能量量转移移(FRET)是是对生生物物大大分分子子之之间相相互互作作用用定定性性、定定量量检测的的一一种种有有效效方方法法，是是在在活活体体细胞胞中中实时地地对生生物大分子之物大分子之间的相互作用的相互作用进行行动态监测. 两个携两个携带不同不同荧光基光基团（如（如GFP、YFP、CFP等）等）的大的大分子在相互分子在相互间距离足距离足够近近时会会发生激生激发态能量非放射性地由一能量非放射性地由一个个荧光基光基团（供体）供体）向另一个向另一个荧光基光基团（受体）受体）转移的移的现象
18、。象。如果如果发生生FRET，则供体信号将淬供体信号将淬灭而受体信号将激活或增而受体信号将激活或增强. FRET 检测系系统可以快速高效地捕可以快速高效地捕获来自来自标定分子定分子间相互作用相互作用的短的短暂微弱的微弱的荧光信号，而以分子尺度分辨出供体光信号，而以分子尺度分辨出供体-受体的平受体的平均距离，并能均距离，并能显示出受体示出受体-供体的相互作用。供体的相互作用。 蛋白蛋白质直接相互作用的直接相互作用的荧光共振能量光共振能量转移移 Fluorescence Resonance Energy Transfer 以光以光线激激发后，供体后，供体荧光基光基团(ECFPX)会将激会将激发能量
19、能量转移至距离移至距离10100 以内的以内的受体受体荧光基光基团(EGFPY)，使，使之之发出出荧光。通光。通过检测受体受体荧光基光基团激激发的的荧光即可确光即可确认两蛋白两蛋白质间的相互作用。的相互作用。ECFP：强化型化型蓝荧光蛋白光蛋白；EGFP：强化型化型绿荧光蛋白光蛋白FRET 3. 磷酸化蛋白磷酸化蛋白质研究方法研究方法: Western blot with phospho-specific antibodies. ELISA Phosphopeptide and phosphoamino acid analysis by mass spectrophotometric anal
20、ysis.n 激激酶活性的活性的测定定信号信号转导过程中往往涉及多种激程中往往涉及多种激酶的活化，因而的活化，因而对这些激些激酶活性的活性的测定在信号定在信号转导研究中具有重要意研究中具有重要意义。常常见激激酶活性的活性的测定有定有PTK、PKC及及PI-3K等。均有商品等。均有商品化的化的试剂盒。盒。4. 基因基因转录活性活性检测 信号蛋白信号蛋白转录水平表达（水平表达（mRNA）的）的检测: RT- PCR / Realtime RT- PCR Northern blot analysis. “gene chip” to measure changes in gene expression
21、 at larger scales. 基因启基因启动子子/增增强子子转录活性的活性的检测: Transient or stable reporter assayluciferase (Luc) .RT- PCRMarker 组组1 组组2 内参基因内参基因目的基因目的基因RTRT：以以polyTpolyT为引物，在逆引物，在逆转录酶催化下催化下cDNAcDNA合成合成PCRPCR：特异引物特异引物进行目的行目的DNADNA的的扩增增应用：用：1.1.获得目的基因（得目的基因（编码蛋白）蛋白）2.2.比比较不同条件下不同条件下mRNAmRNA变化化RT- PCRReal-time PCR用于基因
22、用于基因DNADNA拷拷贝数和数和mRNAmRNA表达定量分析表达定量分析荧光染料：荧光染料：每形成一个每形成一个DNA双链，双链，就有一定数量的染料结就有一定数量的染料结合上去，染料一结合就合上去，染料一结合就产生荧光信号，信号强产生荧光信号，信号强度与度与DNA分子总数目成分子总数目成正比正比。 TaqMan 探针探针 寡核苷酸探寡核苷酸探针的的5端端标记一个一个荧光光报告基告基团（reporter ），），3端端标记一个一个荧光淬光淬灭基基团（quencher ）。）。报告告荧光光基基团与与淬淬灭基基团分分离离，荧光光共共振振能能量量转移不再移不再发生，生，报告基告基团发绿色色荧光光当当
23、激激发光光照照射射到到探探针时，被被激激发的的报告告基基团将能量将能量转移移给附近的淬附近的淬灭基基团而不而不发光。光。 每产生一条每产生一条DNADNA链，就切断一条探针，每链，就切断一条探针，每切断一条探针，就产生一个单位信号，切断一条探针，就产生一个单位信号，信号强度与结合探针的信号强度与结合探针的DNADNA分子数成正比分子数成正比。5. 蛋白蛋白质与与DNA相互作用的研究技相互作用的研究技术: Gel shift (or electrophoretic mobility shift) assay (EMSA)typically, with smaller DNA sizes. Chr
24、omatin-immunoprecipitation (ChIP) assayto assess occupancy of DNA sites with specific factors in living cells. Gel shift染色染色质免疫沉淀技免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP） 体内分析蛋白体内分析蛋白质-DNA相互作用相互作用 真核生物基因真核生物基因组DNA以染色以染色质的形式存在。因此，研究蛋的形式存在。因此，研究蛋白白质与与DNA在染色在染色质环境下的相互作用是境下的相互作用是阐明真核生物基因明真核生物基因
25、表达机制的基本途径。表达机制的基本途径。 CHIP的基本原理的基本原理: 在活在活细胞状胞状态下固定蛋白下固定蛋白质DNA复合复合物，并将其随机切断物，并将其随机切断为一定一定长度范度范围内的染色内的染色质小片段，然小片段，然后免疫沉淀此复合体，特异性地富集与目的蛋白后免疫沉淀此复合体，特异性地富集与目的蛋白结合的合的DNA片段，通片段，通过对目的片断的目的片断的纯化与化与检测，从而，从而获得体内蛋白得体内蛋白质与与DNA相互作用的信息。相互作用的信息。甲甲醛处理理使使蛋蛋白白质与与染染色色质DNADNA交交联；超超声声波波或或酶处理理使使染染色色质DNADNA片片段段化；化；抗体沉淀蛋白抗体
26、沉淀蛋白质-DNA-DNA交交联复复合体（合体（IPIP）；）；消化蛋白，解除交消化蛋白，解除交联，纯化化DNADNA；检 测 分分 析析 (PCR, qPCR, Microarray)6. 基因或蛋白基因或蛋白质功能研究功能研究 改改变基因基因结构构 基因突基因突变（点突（点突变、缺失、融合等）、缺失、融合等） 将突将突变基因或蛋白引入基因或蛋白引入细胞以胞以检测其功能其功能Dominantnegativemutants(缺失结构域突变体)(1)Ligand-bindingsite(2)Phosphorylationsite(3)Dockingsite(4)Protein-proteinbi
27、ndingsite(5)DNAbindingsite基因表达或蛋白基因表达或蛋白质活性的抑制，活性的抑制，观察表型察表型变化推化推测基因功能基因功能RNAiuseofsmallinterferingRNA(siRNA)toreducespecificmRNAlevels.AntisenseoligonucleotidesRibozymeMonoclonalAntibodySmallinhibitormolecules：tyrosinekinaseinhibitor(TKi)在生物整体内改在生物整体内改变基因表达或基因基因表达或基因结构（构（转基因技基因技术）transgenicKnock-ou
28、tRNA干扰技术干扰技术 RNA Interference (RNAi)由双链由双链RNA 所引起的序列特异性基因沉默所引起的序列特异性基因沉默1.长双链长双链RNA被细胞源性的双链被细胞源性的双链RNA特异的特异的核酸酶核酸酶切成个碱基对的短切成个碱基对的短双链双链RNA，称为小干扰，称为小干扰RNA2.小干扰小干扰RNA与细胞源性的某些与细胞源性的某些酶和蛋白质形成复合体，称为酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导沉默复合体诱导沉默复合体，该复合，该复合体可识别与小干扰体可识别与小干扰RNA有同源有同源序列的序列的RNA，并在特异位点，并在特异位点将该将该RNA切断。切断。 RNAi实例实例
29、(载体法载体法)：n 查找靶基因找靶基因mRNAn 利用网利用网络在在线支持，支持，寻找找siRNA序列序列n 根据根据查找的找的siRNA序列，合成序列，合成长链oligon 构建构建载体体n 转染染n 检测效效应（包括干（包括干扰效效应和生物学效和生物学效应）转基因：基因：将人工分离和修将人工分离和修饰过的基因的基因导入到生物体基因入到生物体基因组中，中，导入入基因的表达可引起生物体性状可基因的表达可引起生物体性状可遗传的改的改变，称之，称之为转基基因。因。转基因基因动物：物：以以实验方法将外源基因方法将外源基因导入入动物染色体基因物染色体基因组内内稳定整合定整合并能并能遗传给后代的一后代
30、的一类动物。物。转基因技基因技术 transgenic technology转基因基因动物模型物模型实验步步骤: : 转基因基因载体的构建；体的构建； 将将转基因基因载体体导入受精卵入受精卵细胞或胚胎干胞或胚胎干细胞；胞； 将将转基因受精卵或胚胎干基因受精卵或胚胎干细胞植入假孕小鼠子胞植入假孕小鼠子宫内；内； 对转基因基因动物物进行行鉴定。定。转基因载体结构基因报告基因增强子启动子受精全能性细胞注射植入假孕小鼠后代Southern blotRT-PCRWestern blot转基因小鼠基因小鼠基因敲除技基因敲除技术 Gene Knock-out 体外合成无效基因或突体外合成无效基因或突体外合成
31、无效基因或突体外合成无效基因或突变变基因；基因；基因；基因； 定向插入定向插入(同源重同源重同源重同源重组组) )宿宿主主细胞染色体胞染色体DNA中中取代取代取代取代相相相相应应正常基因正常基因正常基因正常基因, , 使特定目使特定目的基因在的基因在细胞内或生物体胞内或生物体内失活；内失活； 应应用用用用转转基因方法孵育出基因方法孵育出基因方法孵育出基因方法孵育出转转基因基因基因基因动动物物物物, ,即即即即为为基因敲基因敲基因敲基因敲除除除除动动物。物。物。物。基因敲除技基因敲除技术 Gene Knock-outn信号信号转导中第二信使含量的中第二信使含量的测定定第二信使含量的高低同信号传递
32、密切相关。1.Ca2+的的测定：定：原子光谱法、离子微电极测定法、放射示踪法及标记示踪法等。目前常用标记示踪法，即用荧光探针标记靶细胞。常用的荧光探针有quin-2/Am、Fura-2/Am及Indo-1等，后二者较为敏感。3的的测定：定：采用3H-TdR标记的肌醇标记靶细胞后，用不同的刺激剂刺激细胞，分离磷脂酰肌醇混合物，通过阴离子交换层析柱分离洗脱，收集IP3洗脱峰后进行液闪测定。此外，还可以使用Amersham公司生产的D-myo-IP33H分析系统直接测定粗提物中的IP3含量，此方法简易、敏感。的的测定：定：首先提取含DAG的样品，用DAG激酶催化底物DAG，使之发生磷酸化，外源加入3
33、2-ATP，最后将反应产物进行分离后测定放射性含量，根据标准品计算出样品中DAG的含量。的的测定：定：（1）cAMP3H分析系统，其优点是放射性半衰期长，可用于大量样品的分析；（2）cAMP125I分析系统，用于小量样品的分析；（3）cAMPELISA测定方法，此方法简便、敏感。例如例如检测组织或或细胞中某个信号通路及其作用胞中某个信号通路及其作用:1. 样本（本（组织，细胞）；胞）；2. 免疫免疫组化，免疫化，免疫细胞化学定位胞化学定位3. RT-PCR(Realtime PCR), Western blot 检测通路关通路关键信号信号分子的表达（分子的表达（mRNA水平，蛋白水平），磷酸化
34、状水平，蛋白水平），磷酸化状态；4. 检测通路相互作用蛋白（通路相互作用蛋白（CoIP等）等）6. 关关键信号分子基因沉默或增信号分子基因沉默或增强（沉默：抑制（沉默：抑制剂/siRNA/抗体抗体/基因敲除基因敲除动物；增物；增强：激：激动剂/构建构建过表达表达载体体转染）染）7. 芯片芯片/组学学检测 信号通路研究基本策略信号通路研究基本策略例如研究某例如研究某药物物对细胞的作用及相关信号通路胞的作用及相关信号通路:1. 药物刺激物刺激细胞（胞（时间梯度，梯度，浓度梯度）；度梯度）；2. 检测药物物对细胞的作用（毒性，增殖，凋亡，侵胞的作用（毒性，增殖，凋亡，侵袭，迁移，迁移等）；等）； 3
35、. 共聚焦共聚焦显微微镜定位；定位；4. RT-PCR(Realtime PCR), Western blot 检测通路关通路关键信号信号分子的表达（分子的表达（mRNA水平，蛋白水平），磷酸化状水平，蛋白水平），磷酸化状态；5. 检测通路相互作用蛋白（通路相互作用蛋白（CoIP，FRET等）等）6. 关关键信号分子基因沉默（抑制信号分子基因沉默（抑制剂/siRNA/抗体）后抗体）后检测7. 芯片芯片/组学学检测 谢谢信号通路研究基本策略信号通路研究基本策略基因功能研究策略基因功能研究策略新新发现的功能未知的基因：的功能未知的基因： 通通过生物信息学分析生物信息学分析对该基因所基因所编码蛋白蛋白质的空的空间结构及功能构及功能进行行预测; ; 应用分子生物学技用分子生物学技术在在细胞及胞及动物水平物水平进行研究（蛋行研究（蛋白表达，白表达，细胞定位，沉默或胞定位，沉默或过表达表达对细胞功能的影响等）胞功能的影响等）; ; 通通过探探讨与与该基因蛋白相互作用的蛋白而确定新基因基因蛋白相互作用的蛋白而确定新基因的功能。的功能。 蛋白蛋白质结构域分析和构域分析和结构构测定定
