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1、核酸分子杂交核酸分子杂交 牺昨告察烽终姐了洁焚屉珊泽蠕柏卸蔼伸哎虱伙私愚噶浑愈棉近俱拙盗县6核酸分子杂交6核酸分子杂交一、概念：一、概念：1 1、分子杂交分子杂交（hybridization) :有一定同源性的两条核有一定同源性的两条核酸单链，在适宜的温度和离子浓度等条件下，通过碱基酸单链，在适宜的温度和离子浓度等条件下，通过碱基互补退火形成稳定的双链分子的过程互补退火形成稳定的双链分子的过程 。2、 印迹印迹（bloting）：将：将DNADNA、RNARNA或蛋白质固定到固体或蛋白质固定到固体支持物上的过程。支持物上的过程。3、探针（探针（probe）：核酸探针是指用放射性核素、生物）：核
2、酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知异性互补的已知DNA或或RNA片段。片段。宙品曹两挨俭晨抗使恋恬土线辆怖谤鲍疆滁惠矩账绞婴煎黍宰荧按缕番亨6核酸分子杂交6核酸分子杂交4、种类：、种类：固相杂交（固相杂交（solid-phase hybridization）是将变性的）是将变性的DNA固定于固体基质（硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上，再与固定于固体基质（硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。 液相杂交（液相杂交（solution h
3、bridization）指使变性的待测核酸）指使变性的待测核酸单链与已知的核酸单链（探针）在溶液中保温，使之形单链与已知的核酸单链（探针）在溶液中保温，使之形成杂交复合物。成杂交复合物。DNA与与DNA杂交杂交DNA与与RNA杂交杂交RNA与与RNA杂交杂交泵妖赘垛蛛椰院袄掀翱十碧苟吊聂露焦例弱饱泣蝇惕峰番入带磅矫舞岛珐6核酸分子杂交6核酸分子杂交5、几种常见的杂交：、几种常见的杂交： 分子杂交是通过各种方法将核酸分子固定在固相支分子杂交是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂持物上，然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交，经显影后显示出目的交，经显
4、影后显示出目的DNA或或RNA分子所处的位置。分子所处的位置。根据被测定的对象，分子杂交基本可分为以下几大类：根据被测定的对象，分子杂交基本可分为以下几大类：(1) Southern杂交：杂交：DNA片段经电泳分离后，从凝片段经电泳分离后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后与探针胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后与探针杂交。被检对象为杂交。被检对象为DNA，探针为，探针为DNA或或RNA。(2) Northern杂交：杂交：RNA片段经电泳后，从凝胶片段经电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上或尼龙膜，然后用探针杂中转移到硝酸纤维素滤膜上或尼龙膜，然后用探针杂交。被检对象为交。
5、被检对象为RNA,探针为探针为DNA或或RNA。桔限遥腕菌吴滚吞逼四恨辞阂啥祷越响烯籽影垮涟肪扇燃湾旗朽哪靠肯艇6核酸分子杂交6核酸分子杂交二、二、Southern杂交杂交1、步骤：、步骤： Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的的DNA片段中是否存在与探针同源的序列，它包括下片段中是否存在与探针同源的序列，它包括下列步骤列步骤:(1) 酶切酶切DNA, 凝胶电泳分离各酶切片段凝胶电泳分离各酶切片段,然后使然后使DNA原位变性。原位变性。(2) 将将DNA片段转移到固体支持物片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤硝酸纤维素滤膜或尼龙膜膜或尼龙膜)上。
6、上。(3) 预杂交滤膜预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。掩盖滤膜上非特异性位点。(4) 让探针与同源让探针与同源DNA片段杂交，然后漂洗除去片段杂交，然后漂洗除去非特异性结合的探针。非特异性结合的探针。(5) 通过显影检查目的通过显影检查目的DNA所在的位置。所在的位置。彼允崔猛囊籽根国佣锐懦妄转琴对硝茁典看稽泄弗泻轮凳怜芋娘网立丑键6核酸分子杂交6核酸分子杂交Southern杂交能否检出杂交信号取决于很多因素，杂交能否检出杂交信号取决于很多因素，包括目的包括目的DNA在总在总DNA中所占的比例、探针的大小和比中所占的比例、探针的大小和比活性、转移到滤膜上的活性、转移到滤膜上的DNA量以及探
7、针与目的量以及探针与目的DNA间的间的配对情况等。在最佳条件下，放射自显影曝光数天后配对情况等。在最佳条件下，放射自显影曝光数天后, Southern杂交能很灵敏地检测出低于杂交能很灵敏地检测出低于0.1pg与与32 P标记的标记的高比活性探针的高比活性探针的(109 cpm/g)互补互补DNA。如果将。如果将10g基基因组因组DNA转移到滤膜上，并与长度为几百个核苷酸的探转移到滤膜上，并与长度为几百个核苷酸的探针杂交，曝光过夜，则可检测出哺乳动物基因组中针杂交，曝光过夜，则可检测出哺乳动物基因组中1kb大大小的单拷贝序列。小的单拷贝序列。通棚行培蛰被纵跺伞裸窜艾医资位峪辗兼哇屋娱垢逊靴武咖磊
8、要踩滋抹暂6核酸分子杂交6核酸分子杂交2、固体支持物的种类：、固体支持物的种类： 带正电荷的尼龙膜、硝酸纤维膜、带正电荷的尼龙膜、硝酸纤维膜、PVDF膜膜 尼龙膜尼龙膜是较理想的核酸固相支持物，有多种类型；是较理想的核酸固相支持物，有多种类型；硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物，价格硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物，价格最便宜；最便宜；PVDF膜介于二者之间。膜介于二者之间。 尼龙膜尼龙膜结合结合DNA和和RNA能力可达能力可达480600g/cm2，可结合短至，可结合短至10bp的核酸片段；硝酸纤维素膜结合的核酸片段；硝酸纤维素膜结合DNA和和RNA能力可达能力可达8010
9、0g/cm2，对于，对于200bp的核酸片段的核酸片段结合不强；结合不强；PVDF膜结合膜结合DNA和和RNA能力可达能力可达125300g/cm2。同界咳注鬼欣篱慧满摔皂睦境私珊淀易娩萤事兔奄嫌思德闭矿网叁勘歪钧6核酸分子杂交6核酸分子杂交 尼龙膜经烘烤或紫外线照射后，核酸中的部分嘧啶尼龙膜经烘烤或紫外线照射后，核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上的正电荷结合；硝酸纤维素膜依靠疏水性碱基可与膜上的正电荷结合；硝酸纤维素膜依靠疏水性相互作用结合相互作用结合DNA，结合不牢固；，结合不牢固；PVDF膜结合牢固，膜结合牢固，耐高温，特别适合于蛋白印迹。耐高温，特别适合于蛋白印迹。 就韧性而言：就韧性而言：
10、尼龙膜尼龙膜较强；硝酸纤维素膜较脆，易较强；硝酸纤维素膜较脆，易破碎；破碎；PVDF膜较强。膜较强。 就重复性而言：就重复性而言：尼龙膜尼龙膜可反复用于可反复用于分子杂交分子杂交，杂交，杂交后，探针分子可经碱变性被洗脱下来；硝酸纤维素膜不后，探针分子可经碱变性被洗脱下来；硝酸纤维素膜不能重复使用；能重复使用；PVDF膜可以重复使用。膜可以重复使用。塔妙褐堂涣加遵蓬哪痘怪咙阎歹涛趣罪噪搀敝蛇氦拼这抡寺末太菩走骂熟6核酸分子杂交6核酸分子杂交3、转膜的方式：、转膜的方式：将将DNA从凝胶中转移到固体支持物上的方法主要有从凝胶中转移到固体支持物上的方法主要有3种种:(1)毛细管转移。本方法由毛细管转
11、移。本方法由Southern发明，故又称为发明，故又称为Southern转移转移(或印迹或印迹)。毛细管转移方法的优点是简单。毛细管转移方法的优点是简单,不需要用其他仪器。缺点是转移时间较长不需要用其他仪器。缺点是转移时间较长,转移后杂交转移后杂交信号较弱。信号较弱。(2)电泳转移。将电泳转移。将DNA变性后变性后,可电泳转移至带电荷的尼可电泳转移至带电荷的尼龙膜上。该法的优点是不需要脱嘌呤龙膜上。该法的优点是不需要脱嘌呤/水解作用，可直水解作用，可直接转移较大的接转移较大的DNA片段。缺点是转移中电流较大，温度片段。缺点是转移中电流较大，温度难以控制。通常只有当毛细管转移和真空转移无效时，难
12、以控制。通常只有当毛细管转移和真空转移无效时，才采用电泳转移。才采用电泳转移。秃弄足污举芍计累惹廉泄孽鹅拐涌错疤冀署蹄夕蚌廉斜趁偿啃资洼詹牡停6核酸分子杂交6核酸分子杂交(3) 真空转移。有多种真空转移的商品化仪器真空转移。有多种真空转移的商品化仪器,它们一般它们一般是将硝酸纤维素膜或尼龙膜放在真空室上面的多孔屏上，是将硝酸纤维素膜或尼龙膜放在真空室上面的多孔屏上，再将凝胶置于滤膜上，缓冲液从上面的一个贮液槽中流再将凝胶置于滤膜上，缓冲液从上面的一个贮液槽中流下，洗脱出凝胶中的下，洗脱出凝胶中的DNA,使其沉积在滤膜上。该法的优使其沉积在滤膜上。该法的优点是快速，在点是快速，在30分钟内就能从
13、正常厚度分钟内就能从正常厚度(4-5mm)和正常和正常琼脂糖浓度琼脂糖浓度(1%)的凝胶中定量地转移出来。转移后得到的凝胶中定量地转移出来。转移后得到的杂交信号比的杂交信号比Southern转移强转移强2-3倍。缺点是如不小心，倍。缺点是如不小心，会使凝胶碎裂，并且在洗膜不严格时，其背景比毛细转会使凝胶碎裂，并且在洗膜不严格时，其背景比毛细转移要高。移要高。娘骑唱珠替剧黑垄抓乱功列嘛脾匝纷箭磊屈楚谰杰陡腑辐诽蔚纤喀靖迄页6核酸分子杂交6核酸分子杂交脐梁格立痔殆天镜热腰间歇耕敢瑞撂廉趁轩湛谋眉筹拓坍痊歹绎掷卜甚垃6核酸分子杂交6核酸分子杂交斑米听类眯庐敢懊管刑妇居焊客俞速文荷蒋忆往韶铃仁解啊锄糟
14、见嘉区许6核酸分子杂交6核酸分子杂交旭筐褐报为袒髓丛甥挡梳彭抡的雅奠殿现借疯戍裹观庇诣衍羡淡阶库凛鼓6核酸分子杂交6核酸分子杂交4、毛细管转移法转膜用的溶液：、毛细管转移法转膜用的溶液：（1）高盐溶液：）高盐溶液：1.5M NaCl（2）0.4N NaOH如果如果DNA分子大，可以用分子大，可以用0.25N HCL处理或用紫外线处处理或用紫外线处理，将理，将DNA分子适当打断，以提高转移的效果，注意处分子适当打断，以提高转移的效果，注意处理的时间适度！理的时间适度！主雕仔蛤夏腻猎丘咆浓判把溯硅课舰舔敖冒瓶讫胰辞岁紫娥串淹咱防皇媒6核酸分子杂交6核酸分子杂交5、转膜后、转膜后DNA的固定方式：的
15、固定方式：转膜后，膜用转膜后，膜用2SSC漂洗，然后固定：漂洗，然后固定：（1）80干烤干烤0.5-2小时；小时；（2）254nm波长的紫外线照射尼龙膜带波长的紫外线照射尼龙膜带RNA的一面。的一面。后一种方法较为繁琐后一种方法较为繁琐,但却优先使用但却优先使用,因为某些批号的带因为某些批号的带正电荷的尼龙膜经此处理后正电荷的尼龙膜经此处理后,杂交信号可以增强。然而为杂交信号可以增强。然而为获得最佳效果获得最佳效果,务必确保尼龙膜不被过度照射，适度照射务必确保尼龙膜不被过度照射，适度照射可促进可促进DNA上小部分碱基与尼龙膜表面带正电荷的胺基上小部分碱基与尼龙膜表面带正电荷的胺基形成交联结构形
16、成交联结构,而过度照射却使而过度照射却使DNA上一部分胸腺嘧啶上一部分胸腺嘧啶共价结合于尼龙膜表面共价结合于尼龙膜表面,导致杂交信号减弱。导致杂交信号减弱。毕白呕韭贝耪韶篮炙务嘉又坝框状鲍脑沮揩广俄婿然锌个攫僳滓撬啤酉卷6核酸分子杂交6核酸分子杂交三、三、Northern杂交杂交 Northern杂交与杂交与Southern杂交很相似。主要区别杂交很相似。主要区别是是被检测对象为被检测对象为RNA,其其电泳在变性条件下进行电泳在变性条件下进行,以去以去除除RNA中的二级结构中的二级结构,保证保证RNA完全按分子大小分离完全按分子大小分离。变性电泳主要有变性电泳主要有2种种:乙二醛变性电泳、甲醛
17、变性电泳。乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳。电泳后的琼脂糖凝胶用与电泳后的琼脂糖凝胶用与Southern转移相同的方法将转移相同的方法将RNA转移到硝酸纤维素滤膜上转移到硝酸纤维素滤膜上,然后与探针杂交。然后与探针杂交。 注意：注意：（1）RNA对碱性敏感，不能用对碱性敏感，不能用NaOH溶液作为转膜夜。溶液作为转膜夜。如果琼脂糖浓度高于如果琼脂糖浓度高于1%，或凝胶厚度大于，或凝胶厚度大于0.5cm，或，或待分析的待分析的RNA大于大于2.5kb,需用需用0.05mol/L NaOH浸泡凝浸泡凝胶胶20分钟分钟,部分水解部分水解RNA并提高转移效率。浸泡后用并提高转移效率。浸泡后用经经DEPC处
18、理的水淋洗凝胶处理的水淋洗凝胶,并用并用20SSC浸泡凝胶浸泡凝胶45分分钟。然后再转移到滤膜上。钟。然后再转移到滤膜上。啡勃胳玉甫讼塔皱苔狮巡留祈谤欧羞窿统逛雌毖邵韵于妙伙鸭帧装徘哮见6核酸分子杂交6核酸分子杂交（2）含甲醛的凝胶在）含甲醛的凝胶在RNA转移前需用经转移前需用经DEPC处处理的水淋洗数次理的水淋洗数次,以除去甲醛。以除去甲醛。（3）尼龙膜的不足之处是背景较高）尼龙膜的不足之处是背景较高,用用RNA探针探针时尤为严重。将滤膜长时间置于高浓度的碱性溶液时尤为严重。将滤膜长时间置于高浓度的碱性溶液中中,会导致杂交背景明显升高会导致杂交背景明显升高,可通过提高预杂交和可通过提高预杂交
19、和杂交步骤中有关阻断试剂的量来予以解决。杂交步骤中有关阻断试剂的量来予以解决。梗侧鸿摸趾怖澎支涨落铸询变抚枫醛膏眶链藉郊又管虏竿门秘案扶捎派懈6核酸分子杂交6核酸分子杂交四、菌落原位杂交四、菌落原位杂交对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落（对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落（100-200）进行克隆筛选时，可采用本方法。将这些菌落归）进行克隆筛选时，可采用本方法。将这些菌落归并到一个琼脂主平板以及已置于第二个琼脂平板表面并到一个琼脂主平板以及已置于第二个琼脂平板表面的一张尼龙膜上。经培养一段时间后，对菌落进行原的一张尼龙膜上。经培养一段时间后，对菌落进行原位裂解。主平板应贮存于位裂解。主平板应贮
20、存于4直至得到筛选结果。直至得到筛选结果。墅打困射蹭窟春云海忆傅熔十桃旗肤密曰呢苇谚艰妨调锥谎仟笔较负惊豆6核酸分子杂交6核酸分子杂交五、斑点杂交五、斑点杂交 斑点杂交是指将斑点杂交是指将DNA或或RNA样品直接点在硝酸样品直接点在硝酸纤维素滤膜上纤维素滤膜上,然后与核酸探针分子杂交，以显示样然后与核酸探针分子杂交，以显示样品中是否存在特异的品中是否存在特异的DNA或或RNA。同一种样品经不。同一种样品经不同倍数的稀释同倍数的稀释,还可以得到半定量的结果。所以它是还可以得到半定量的结果。所以它是一种简便、快速、经济的分析一种简便、快速、经济的分析DNA或或RNA的方法的方法,在在基因分析和基因
21、诊断中经常用到基因分析和基因诊断中经常用到,是研究基因表达的是研究基因表达的有力工具。但由于目的序列未与非目的序列分离有力工具。但由于目的序列未与非目的序列分离,不不能了解目的序列的长度。尤其当本底干扰较高时能了解目的序列的长度。尤其当本底干扰较高时,难难以区分目的序列信号和干扰信号。以区分目的序列信号和干扰信号。畔吠拒余哄姨玉辆祖啪胚寂忍眨啃午颧糕多坡举吼怪畔蝉贺起腕冯阴恬荤6核酸分子杂交6核酸分子杂交六、影响杂交的因素六、影响杂交的因素 1、温度、温度 杂交技术最重要的因素之一是杂交技术最重要的因素之一是选择最适的杂交反选择最适的杂交反应温度应温度。若反应温度低于。若反应温度低于Tm 10
22、15，碱基顺序高，碱基顺序高度同源的互补链可形成稳定的双链，错配对减少。若度同源的互补链可形成稳定的双链，错配对减少。若反应温度再低（反应温度再低（Tm-30），虽然互补链之间也可形），虽然互补链之间也可形成稳定的双链，但互补碱基配对减少，错配对增多、成稳定的双链，但互补碱基配对减少，错配对增多、氢键结合的更弱。如两个同源性在氢键结合的更弱。如两个同源性在50%左右或更低些左右或更低些的的DNA，调整杂交温度可使它们之间的杂交率变化，调整杂交温度可使它们之间的杂交率变化10倍，因此在实验前必须首先确定杂交温度。倍，因此在实验前必须首先确定杂交温度。 脂绎慑悼副狰刻钉允治拱风搅拿修市佳营啼依矽颗
23、屿娩娠赘皂碾摘没搁恼6核酸分子杂交6核酸分子杂交 通常有三种温度可供试验，即最适复性温度、苛刻复通常有三种温度可供试验，即最适复性温度、苛刻复性温度及非苛刻复性温度。温度的选择及温度对杂交的性温度及非苛刻复性温度。温度的选择及温度对杂交的影响见下表。最适复性温度（影响见下表。最适复性温度（Optimunm renaturation temperature, TOR）：）：Tor =Tm 25苛刻复性温度：苛刻复性温度：Ts = Tm (10或或15)非苛刻复性温度：非苛刻复性温度：Tns =Tm (30或或35)在在2SSC反应液中，可以根据下列公式计算最适复性反应液中，可以根据下列公式计算最
24、适复性温度：温度：TOr =0.51 (G+C%)+47。氖润钎汲芹碳想乙异忘势任癌囤钢谍理宜焚地年嘶车爱裹榔闭蝇循酉鱼住6核酸分子杂交6核酸分子杂交DNAG+C % 杂交反应温度（杂交反应温度（） TorTsTns3062.3 73.352.33564.9 74.954.94067.4 77.457.44570.0 80.060.05072.5 82.562.55575.1 85.165.1DNADNA杂交温度的选择范围（杂交温度的选择范围（2SSC） 面狱掌焦水卖叹侩尝靖跺镇甄去誊添朽下剑葛莎汪逮酪桐莉藉诣息辈霞扭6核酸分子杂交6核酸分子杂交如果综合考虑：如果综合考虑：Effective
25、Tm81.5+16.6(logMNa+)+0.41(%G+C) 0.72(%formamide)根据所用的杂交溶液确定杂交的温度：一般来说，杂交根据所用的杂交溶液确定杂交的温度：一般来说，杂交相为水溶液时相为水溶液时,则在则在65杂交，而在杂交，而在50%甲酰胺溶液中时甲酰胺溶液中时,则在则在42下杂交。下杂交。2、离子强度离子强度离子强度增加离子强度增加，Tm值增加值增加，一般用一般用0.9-0.75 mol/L 的的NaCl3、 DNA的浓度的浓度最低检测水平为单拷贝为：最低检测水平为单拷贝为：0.5pg淋偿模隶幸叁唉硒建架革莽肖瓶驻笨柔镣悦颁擅察瘩五韩雁遵汹丁刮卢查6核酸分子杂交6核酸分
26、子杂交4、探针的浓度：、探针的浓度： 总的来说，随探针浓度增加，杂交率也增加。另总的来说，随探针浓度增加，杂交率也增加。另外，在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加。外，在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加。要获得较满意的敏感性，膜杂交中要获得较满意的敏感性，膜杂交中32P标记探针与非放标记探针与非放射性标记探针的用量分别为射性标记探针的用量分别为510ng/ml和和251000ng/ml 探针质量衡量的指标：探针质量衡量的指标：比活性比活性即即 cpm/g 如果比活性为如果比活性为108cpm/g ，用的浓度为，用的浓度为10g/ml， 比活性为比活性为109cpm/g ，用的浓度
27、为，用的浓度为2g/ml。眉烤燃包藏醉梧蛀伙搀防姐茵荐狄貉患柬率蝶瞅汕扎淹惫粉辈钱粥凌转延6核酸分子杂交6核酸分子杂交5 5、探针的长度和同源性、探针的长度和同源性 ： 为了保证杂交的特意性，一般需要用为了保证杂交的特意性，一般需要用500pb左右左右的长度的探针。但是，探针过量的条件下，杂交率的长度的探针。但是，探针过量的条件下，杂交率主要依赖于探针长度（复杂度）和探针浓度。在浓主要依赖于探针长度（复杂度）和探针浓度。在浓度一定时，杂交率主要影响因素是探针的长度，长度一定时，杂交率主要影响因素是探针的长度，长的探针杂交时间很长，而短探针容易退火，因此标的探针杂交时间很长，而短探针容易退火，因
28、此标记好的探针长度为记好的探针长度为100 nt左右，太短将探针与目的序左右，太短将探针与目的序列的结合。列的结合。轿仆警灭太峡索霄梆殷杰芦瘫央琢坐豹橙柯呆瘟曾栏沥佑苇果糕八伪笺伊6核酸分子杂交6核酸分子杂交探针与被检测的探针与被检测的DNA之间的同源性也影响之间的同源性也影响Tm： 1% mismatch of two DNA lowers the Tm 1.4 如果杂交温度为如果杂交温度为67.5，要求，要求DNA间的同源性为间的同源性为87.5%，在，在65、5xSSC的条件下，要求探针与被检的条件下，要求探针与被检测的测的DNA之间的同源性为多少？之间的同源性为多少？ 假设：（假设：（
29、GC）45 Tm81.5+16.6(log0.825)+0.41(45%)=98.6 同源性同源性100(98.665.0)/1.4=83.1%惦毁涯妮厅待桃烫晚运瑞挺幽砾腮铅弥雄逐沸艾篮业滋渭料掀图捕掏种标6核酸分子杂交6核酸分子杂交6、杂交液的成分、杂交液的成分 ：反应液中每增加反应液中每增加1%的的甲酰胺甲酰胺浓度，浓度，tm值可降低值可降低0.72。6M尿素，降低尿素，降低Tm约约30惰性多聚体可用来促进惰性多聚体可用来促进250个碱基以上的探针的杂交率。个碱基以上的探针的杂交率。对单链探针可增加对单链探针可增加3倍，而对双链探针、随机剪切或随机倍，而对双链探针、随机剪切或随机引物标记
30、的探针可增加高达引物标记的探针可增加高达100倍。倍。硫酸葡聚糖是一种广泛用于较长双链探针杂交的促进剂。硫酸葡聚糖是一种广泛用于较长双链探针杂交的促进剂。这是一种多聚胺，平均分子量为这是一种多聚胺，平均分子量为500000。另一种常见的。另一种常见的促进剂是聚乙二醇（促进剂是聚乙二醇（PEG），），PEG分子量小（分子量小（60008000）、粘度低、价格低廉，但它不能完成取代硫酸葡）、粘度低、价格低廉，但它不能完成取代硫酸葡聚糖。在某些条件下聚糖。在某些条件下5%10%硫酸葡聚糖效果较好，若硫酸葡聚糖效果较好，若用用5%10%PEG则可产生很高的本底。因此，使用促进则可产生很高的本底。因此，
31、使用促进剂时有必要优化条件。剂时有必要优化条件。郡卯通聂绕廖撂粪亏肪抹憨蜒棋典攀耻翌宛芜显悠指邑堡偿夸痪掀嫉年熙6核酸分子杂交6核酸分子杂交 选用不同的封闭试剂：如选用不同的封闭试剂：如Denhardts试剂、肝素或试剂、肝素或一种由一种由5%脱脂奶粉组成的脱脂奶粉组成的BLOTTO或或block reagent , 这些试剂中需加入断裂的鲑鱼精子这些试剂中需加入断裂的鲑鱼精子DNA或酵母或酵母DNA，并和并和SDS一起使用。与一起使用。与Denhardts试剂相比试剂相比, BLOTTO价格便宜价格便宜,使用方便使用方便,同样可获得满意的结果，但它不同样可获得满意的结果，但它不能用于能用于R
32、NA杂交。一般而言杂交。一般而言,尼龙膜用尼龙膜用Denhardts试剂试剂比用比用BLOTTO能得到更高的信噪比。能得到更高的信噪比。隐离悄赵兑批蛤地庶霜晌猜菊笨旁怠宵劈薛综秤玉房歹恒圃侈耗榨沥节鬃6核酸分子杂交6核酸分子杂交7、杂交的时间、杂交的时间在条件都得到满足的情况下，杂交的成败就取决于保温在条件都得到满足的情况下，杂交的成败就取决于保温时间。时间短了，杂交反应不完成；时间长了也无益，时间。时间短了，杂交反应不完成；时间长了也无益，会引起非特异结合增多。一般杂交反应要进行会引起非特异结合增多。一般杂交反应要进行16h左右。左右。8、杂交液的体积：一般来说使用较小体积的杂交液比、杂交液
33、的体积：一般来说使用较小体积的杂交液比较好，因为在小体积溶液中，核酸重新配对的速度快、较好，因为在小体积溶液中，核酸重新配对的速度快、探针用量少，从而使滤膜上的探针用量少，从而使滤膜上的DNA在反应中起主要作用。在反应中起主要作用。但在杂交中必须保证有足够的杂交溶液覆盖杂交膜。一但在杂交中必须保证有足够的杂交溶液覆盖杂交膜。一般杂交液的用量为般杂交液的用量为1ml/10cm2 恳斗疆钨驻癌谴钉庐诧字原摊搽塞嘉呕棉扼片助匹时箱悠遣瓢汝龋懦雏住6核酸分子杂交6核酸分子杂交七、洗膜时应注意的事项七、洗膜时应注意的事项 1、洗膜的温度和洗膜的温度和SSC的浓度的浓度： Stringency: a te
34、rm used in hybridization experiments to denote the degree of homology between the probe and the filter bound nucleic acid, the higher the stringency, the higher percent homology between the probe and the filter bound nucleic acid.（1）Non-stringent wash: 2xSSC, 65Effective Tm 81.5 + 16.6( log0.33 )0.4
35、1( 45% )92.2 homology 100 （9265）/1.4 80.7%（2）Stringent wash: 0.1xSSC，65Effective Tm 81.5 + 16.6( log0.0165 )0.41( 45% )70.4 homology 100 （70.465）/1.4 96.1%桃平脱幼区婴彬靡纠缘凯阅殊杯矫炳终江任琢摹溶蛔玩啤谚茶韶缺嗓络勾6核酸分子杂交6核酸分子杂交2、洗膜的时间与次数：、洗膜的时间与次数：一般用一般用2XSSC洗洗12次，然后用严格的洗液洗次，然后用严格的洗液洗2次，每次，每次次30分钟。分钟。郁餐帕泽驹棠幕畅纸橇藕盏真潘样予纹推暮复躇佬哺部
36、灿嘲肤售震烹兴鼻6核酸分子杂交6核酸分子杂交八、脱探针的方法及注意事项八、脱探针的方法及注意事项 ：尼龙膜可以重复利用，因此杂交后不能干燥，一定尼龙膜可以重复利用，因此杂交后不能干燥，一定保持湿润。保持湿润。处理方法：处理方法：0.1X SCC/0.1%SDS、100 510分钟分钟 DNA的膜还可以用的膜还可以用0.2N NaOH处理处理声痊陪轻疵官沂夺舜拷益求瞳吝颓枯轧耀声蚊制察扫涡蓑促插砌句可瑚肘6核酸分子杂交6核酸分子杂交九、标记的方法九、标记的方法 1 1、缺口平移法缺口平移法缺口平移法缺口平移法 （Nick TranslationNick Translation）原理及过程：原理及
37、过程：原理及过程：原理及过程：反应体系中反应体系中反应体系中反应体系中DNADNA酶酶酶酶I I随机在探针随机在探针随机在探针随机在探针DNADNA上打开缺口，然上打开缺口，然上打开缺口，然上打开缺口，然后利用后利用后利用后利用DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶I 5 3I 5 3外切酶活性，在缺口处按外切酶活性，在缺口处按外切酶活性，在缺口处按外切酶活性，在缺口处按5 35 3方向切除单核苷酸；同时方向切除单核苷酸；同时方向切除单核苷酸；同时方向切除单核苷酸；同时DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶I I有有有有5 5 33的聚合酶活性，在缺口处的聚合酶活性，在缺口处的聚合酶活性，在缺口处
38、的聚合酶活性，在缺口处33端加入底物中的单核苷端加入底物中的单核苷端加入底物中的单核苷端加入底物中的单核苷酸，弥补缺口处的核苷酸链。随着反应的进行底物中酸，弥补缺口处的核苷酸链。随着反应的进行底物中酸，弥补缺口处的核苷酸链。随着反应的进行底物中酸，弥补缺口处的核苷酸链。随着反应的进行底物中被标记单核苷酸，并被随机掺入。被标记单核苷酸，并被随机掺入。被标记单核苷酸，并被随机掺入。被标记单核苷酸，并被随机掺入。DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶I I的两种的两种的两种的两种作用交替进行，探针即被标记。作用交替进行，探针即被标记。作用交替进行，探针即被标记。作用交替进行，探针即被标记。仲梭钎辨痢剿
39、赎罐均醉混撇六西帕搐旅靴矿暂涯鼎咯怪面簿诈辣靶凛猾藩6核酸分子杂交6核酸分子杂交泳敖詹和袄宾裳辛滩领红陈诌绑粱句乏锭厨山觅悔蚕判泰摘似穴篙交杜辨6核酸分子杂交6核酸分子杂交2 2、随机引物法（随机引物法（随机引物法（随机引物法（6 6核苷酸引物标记法）核苷酸引物标记法）核苷酸引物标记法）核苷酸引物标记法）原理及过程：原理及过程：原理及过程：原理及过程：利用利用利用利用E.coli DNAE.coli DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶I I的的的的KlenowKlenow亚单位，亚单位，亚单位，亚单位，合成含有标记核苷酸的合成含有标记核苷酸的合成含有标记核苷酸的合成含有标记核苷酸的DNADNA链。
40、链。链。链。KlenowKlenow具有具有具有具有5 35 3聚聚聚聚合酶活性。合酶活性。合酶活性。合酶活性。被标记的被标记的被标记的被标记的DNADNA（探针）变性成单链，引物与模板结合。（探针）变性成单链，引物与模板结合。（探针）变性成单链，引物与模板结合。（探针）变性成单链，引物与模板结合。在在在在KlenowKlenow的催化下，以引物的催化下，以引物的催化下，以引物的催化下，以引物33端为起点，沿模板端为起点，沿模板端为起点，沿模板端为起点，沿模板3 53 5方向合成方向合成方向合成方向合成DNADNA新链。反应体系中含有标记的新链。反应体系中含有标记的新链。反应体系中含有标记的新
41、链。反应体系中含有标记的dNTP,dNTP,随机随机随机随机掺入新合成的掺入新合成的掺入新合成的掺入新合成的DNADNA链中，探针即被标记。链中，探针即被标记。链中，探针即被标记。链中，探针即被标记。捉妥藉洪骗歼奈纪笛仿礁标供沂橇氮圃儒晰饵寻庞嘲棋津遁高挎机焦禹洞6核酸分子杂交6核酸分子杂交状滁邑瘫酱谋滔抬沫村废吁遏领撒常拙篷藏溢迭箕档彪汉顽耸靶匠旋调剖6核酸分子杂交6核酸分子杂交3、末端标记、末端标记葱纺逐傍好堑肤硒逸评妨皆激尿误嵌莉虞鞭哑红每译际留迪径洪盾谗辑杜6核酸分子杂交6核酸分子杂交（2 2）交换反应标记法）交换反应标记法温锌矮猿携材隐搜台馏为冶全缕撒超嫂葡座量左舜扼员沼阜碳蛇密王尚
42、酋6核酸分子杂交6核酸分子杂交十、标记的种类十、标记的种类理想的标记物理想的标记物： 具有高度的灵敏性具有高度的灵敏性与探针结合后，不影响杂交及探针的主要理化特性与探针结合后，不影响杂交及探针的主要理化特性检测方法高灵敏性、高特异性，假阳性率低，环境污检测方法高灵敏性、高特异性，假阳性率低，环境污染少，价格低廉；染少，价格低廉；若用酶促方法标记，应对若用酶促方法标记，应对Km影响不大影响不大铲烷脸佩湿宇擂变方娄田览刘傲阂送疥荡诞玩姿勤款猴取塘惨范徘加烦卢6核酸分子杂交6核酸分子杂交1、同位素、同位素-32PdNTP、-32SdNTP用用缺口平移法和随机缺口平移法和随机缺口平移法和随机缺口平移法
43、和随机引物法引物法引物法引物法-32P-ATP用于末端标记用于末端标记放射性同位素（放射性同位素（radiosotlope）是不稳定的，它会）是不稳定的，它会“变变”。放射性同位。放射性同位 素的原子核很不稳定，会不间素的原子核很不稳定，会不间断地、自发地放射出射线，直至变成另一种稳定同断地、自发地放射出射线，直至变成另一种稳定同位位 素，这就是所谓素，这就是所谓“核衰变核衰变”。 放射性同位素衰变的快慢，通常用放射性同位素衰变的快慢，通常用“半衰半衰 期期”来表来表示。半衰期（示。半衰期（half-life）即一定数量放射性同位素原）即一定数量放射性同位素原子数目减少到其初始值一子数目减少到
44、其初始值一 半时所需要的时间。半时所需要的时间。 廊密捻钎其捕喉哲杀凸辛漓泅虽谐旗疤俘桔茧擂狭蔓奏箩印麓户纵辟凋该6核酸分子杂交6核酸分子杂交同位素的特性：同位素的特性：检测特异性强；检测特异性强；灵敏度高；灵敏度高；对酶促反应无任何影响，也不影响碱基配对的特异对酶促反应无任何影响，也不影响碱基配对的特异性和稳定性；性和稳定性；易造成放射性污染；易造成放射性污染；半衰期短的同位素应用受到限制，随用随标记，立半衰期短的同位素应用受到限制，随用随标记，立即使用，不能长时间存放。即使用，不能长时间存放。豆鸽塞虎淫寻屁杰整弓辉届冬综卿试燎反筒逞矿堆经镊狡时醛糙郧上踪廉6核酸分子杂交6核酸分子杂交同位素
45、同位素符号符号半衰期半衰期射线能量（射线能量（MeV）氢氢-33H12.3年年0.018碳碳-1414C5720年年0.156磷磷3232P14.3天天1.71硫硫3535S87.1天天0.167碘碘131131I8.05天天0.605常用同位素的特征常用同位素的特征患童迎隅义腿匡沥圈汲餐樟街豢瀑砰隆辅苛贝闽剪巨俯重吟级稠九锌阎饭6核酸分子杂交6核酸分子杂交符峙让珊鲍坍钉邹境钧哇碌云獭陪诀苔膛孙纶仲映批示阔州阜胖逆麓奢途6核酸分子杂交6核酸分子杂交2 2、非放射性标记、非放射性标记优点：无环境污染，可较长时间贮存优点：无环境污染，可较长时间贮存方法：方法：1.1.酶标记法酶标记法 2.2.化学
46、标记法化学标记法要求：标记物应具有耐热、对组织细胞无特异亲和性、要求：标记物应具有耐热、对组织细胞无特异亲和性、分子量小，对探针杂交无影响或影响甚小，不影响分子量小，对探针杂交无影响或影响甚小，不影响DNA三维空间构象的形成。三维空间构象的形成。 常用的标记物：生物素（常用的标记物：生物素（biotin）、地高辛）、地高辛（digoxigenin）、光生物素（）、光生物素（photobiotin）、补骨脂素、）、补骨脂素、2-乙酰氨基芴（乙酰氨基芴（2-acetylomino fluorene）侮莲劫耙顽碍凸它颓巧豌涛怒御竟志易羚脑组词蕴概迅毕路奔匹铲谴苔短6核酸分子杂交6核酸分子杂交地高辛（
47、地高辛（Digoxigenin 简写简写Digo-）又称异羟基洋地）又称异羟基洋地黄毒甙配基，这种类固醇半抗原仅限于洋地黄类植物，黄毒甙配基，这种类固醇半抗原仅限于洋地黄类植物，其抗体与其它任何固醇类似物如人体中的性激素等无其抗体与其它任何固醇类似物如人体中的性激素等无交叉反应，地高辛配基标记于脱氧尿嘧啶三磷酸核苷交叉反应，地高辛配基标记于脱氧尿嘧啶三磷酸核苷（dUTP）上形成）上形成digoxigenin 11-dUTP镶函轩脸陵技戏涵卉域襄褐芭俗珠偿凰艘粹联焙泄只侯耸冤痘师菱瞪候皋6核酸分子杂交6核酸分子杂交地高辛标记技术源于一种从洋地黄类植物（毛地黄和毛地高辛标记技术源于一种从洋地黄类植
48、物（毛地黄和毛花毛地黄）中提取的类固醇（花毛地黄）中提取的类固醇（Steroid）物质）物质 Digoxigenin （DIG），在医学上可用于治疗各种急性和），在医学上可用于治疗各种急性和慢性心功能不全以及室上性心动过速、心房颤动和扑动慢性心功能不全以及室上性心动过速、心房颤动和扑动等疾病。由于洋地黄植物的花和叶片等疾病。由于洋地黄植物的花和叶片Digoxigenin在自然在自然界中的唯一来源，因此抗界中的唯一来源，因此抗DIG的抗体不会与其他的生物的抗体不会与其他的生物物质结合，从而可以满足特异性标记的需要。这一点，物质结合，从而可以满足特异性标记的需要。这一点，正是正是DIG胜于生物素胜
49、于生物素(Biotin)的地方的地方同样是小分子同样是小分子标记物，生物素广泛存在于各种组织中，对于灵敏度很标记物，生物素广泛存在于各种组织中，对于灵敏度很高的标记检测实验来说，样品自身含有的内源生物素，高的标记检测实验来说，样品自身含有的内源生物素，就会对结果产生干扰。地高辛就能够很好地避免这个问就会对结果产生干扰。地高辛就能够很好地避免这个问题题。嘶傲棋柏冯醒浴儒叼右选印污成毗驯悲柒乎胡量幽炉等橙蝗走嗅俊弃韶背6核酸分子杂交6核酸分子杂交 通过随机引物或缺口翻译法（多用随机引物法），通过随机引物或缺口翻译法（多用随机引物法），将将dig-11-dUTP与探针的核酸分子相连，构成与探针的核酸
50、分子相连，构成Dig-配基配基标记的核酸探针。将这种标记的探针与核酸分子之间标记的核酸探针。将这种标记的探针与核酸分子之间的同源序列在一定条件下互补杂交，然后用偶联有酶的同源序列在一定条件下互补杂交，然后用偶联有酶或荧光素的羊抗高地辛抗体或荧光素的羊抗高地辛抗体Tab（抗原结合片段）结合（抗原结合片段）结合物作为酶标或荧光标记，再分别用显色底物使杂交部物作为酶标或荧光标记，再分别用显色底物使杂交部位显色或产生荧光以达到检测目的。位显色或产生荧光以达到检测目的。 对于对于DIG 标记探针的杂交检测，可选用连接有碱标记探针的杂交检测，可选用连接有碱性磷酸酶（性磷酸酶（alkaline phosph
51、atase），过氧化物酶），过氧化物酶(peroxidase),荧光素（荧光素（fluorescein）,若丹明若丹明（rhodamine）或是胶体金（）或是胶体金（colloidal gold）高亲和）高亲和性的抗性的抗DIG抗体共轭物；也可选用不带任何共轭连接抗体共轭物；也可选用不带任何共轭连接的抗的抗DIG抗体和二级抗体。抗体和二级抗体。 州妈瘤路区骋葱袍逻浆倘仿襟缓骄拣会理四妆芝靴燃囚满曼瑚糜卢勒炔院6核酸分子杂交6核酸分子杂交DIG 系统的优势：系统的优势： （1）高灵敏度，完全可满足实验需要，某些方面甚）高灵敏度，完全可满足实验需要，某些方面甚至可与放射性标记的灵敏度向媲美至可与放
52、射性标记的灵敏度向媲美 （2）曝光时间短，结果显示时间以分钟计算，无需）曝光时间短，结果显示时间以分钟计算，无需几小时甚至几天的自显影过程几小时甚至几天的自显影过程 （3）安全环保，不接触放射性物质，不会对环境造）安全环保，不接触放射性物质，不会对环境造成污染成污染 （4）探针可重复使用，最少可以稳定储存一年）探针可重复使用，最少可以稳定储存一年 （5）可轻松进行探针拨离和重探）可轻松进行探针拨离和重探 裙谷充摘水掇钱违记心牙锹肤局秩顷嫡亮悲墟澳猾物战灸捍恳粱鼠钩久倒6核酸分子杂交6核酸分子杂交检测的灵敏度主要依赖于对不同抗检测的灵敏度主要依赖于对不同抗DIG抗体共轭抗体共轭物显示方法的选择。
53、以连接有碱性磷酸酶的抗物显示方法的选择。以连接有碱性磷酸酶的抗DIG 抗体为例：即可以使用抗体为例：即可以使用NBT或或BCIP做底物的显色法，做底物的显色法，也可以使用也可以使用HNPP荧光碱性磷酸酶底物，检测的灵荧光碱性磷酸酶底物，检测的灵敏度常规可达到敏度常规可达到0.1pg 婆模糖爱颧就蓖嚷咋纷赌磊弹拾再哭工琶谨躯精冉尔钩后杭墩吵尊诱惋羹6核酸分子杂交6核酸分子杂交 常用的免疫酶学检测方法有两类：一是常用的免疫酶学检测方法有两类：一是Dig HRP（辣根过氧化物酶）检测体系，以（辣根过氧化物酶）检测体系，以DAB（四氢（四氢氯化二氨基联苯胺）氯化二氨基联苯胺）/H2O2为底物，结果为棕
54、色；或为底物，结果为棕色；或以以4-氯氯-1-萘酚萘酚/H2O2为底物，结果为蓝色。另一是为底物，结果为蓝色。另一是Dig AKP检测体系：以检测体系：以BCIP/NBT为底物，结果为蓝紫为底物，结果为蓝紫色沉淀。与免疫细胞化学方法相似，如应用酶促反应色沉淀。与免疫细胞化学方法相似，如应用酶促反应会较单一信号的标记物如荧光素具有更高的灵敏度。会较单一信号的标记物如荧光素具有更高的灵敏度。同样是酶促化学反应，同样是酶促化学反应，AKP灵敏度和分辨率较灵敏度和分辨率较HRP高约高约10倍左右，但倍左右，但HRP的优点为价廉、稳定。的优点为价廉、稳定。算埂辗雹路甫惟帘酝鹰僵眠章可保挂淤人潭氦迅续饯吏
55、龄使毡寿怪沧邑兹6核酸分子杂交6核酸分子杂交搬栋摸箩格俯涸荐障准奎卿症汞夺犯号赃夜浪蝴暴终洁汞陕揉播此柑谓囊6核酸分子杂交6核酸分子杂交DIG标记的标记的dUTP代替部分代替部分dTTP掺入待标探针中，掺入待标探针中，经杂交后用与碱性磷酸酶经杂交后用与碱性磷酸酶Ap（alkaline phosphatase）连接的）连接的DIG抗体发生免疫反应，通过抗体发生免疫反应，通过Ap使反应底物使反应底物CSPD脱磷，脱磷后的产物不稳定，脱磷，脱磷后的产物不稳定，继续分解同时释放出光子，可用继续分解同时释放出光子，可用X-光片显示杂交信光片显示杂交信号。号。 竖阳赊编秤鼻韵团嗽浴鳖勺俭魄柄他烈愧褪必袋骇奢蹿填蔚垦灭几畦窜森6核酸分子杂交6核酸分子杂交
