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1、第十三章第十三章 高效液相色谱法高效液相色谱法一、一、HPLC与经典与经典LC区别区别主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段1 1经典经典LCLC：仅做为一种分离手段：仅做为一种分离手段 柱内径柱内径13cm13cm，固定相粒径，固定相粒径100m 100m 且不均匀且不均匀 常压输送流动相常压输送流动相 柱效低（柱效低（HH，nn） 分析周期长分析周期长 无法在线检测无法在线检测2 2HPLCHPLC：分离和分析：分离和分析 柱内径柱内径26mm26mm，固定相粒径，固定相粒径10m10m（球形，匀浆装柱）（球形，匀浆装柱） 高压输送流动相高压输送流
2、动相 柱效高（柱效高（HH，nn） 分析时间大大缩短分析时间大大缩短 可以在线检测可以在线检测二、二、HPLC与与GC差别差别相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别主要差别：分析对象的差别和流动相的差别1 1分析对象分析对象分析对象分析对象 GCGC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品， 高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及 高聚物的样品不可检测高聚物的样品不可检测 占有机物的占有机物的20%20% HPLCHPLC：溶解后能制成溶
3、液的样品，：溶解后能制成溶液的样品， 不受样品挥发性和热稳定性的限制不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、热稳定性差及高分子分子量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的用途广泛，占有机物的80%80%续前2 2流动相差别流动相差别流动相差别流动相差别vvGCGC：流动相为惰性气体：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 vvHPLCHPLC：流动相为液体流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、 改善分离度增
4、加了因素，对分离起很大作用改善分离度增加了因素，对分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动相种类较多，选择余地广流动相极性和流动相极性和pHpH值的选择也对分离起到重要作用值的选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性可以增大分离选择性3 3操作条件差别操作条件差别操作条件差别操作条件差别 GCGC：加温操作：加温操作 HPLCHPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）三、高效液相色谱仪流程图三、高效液相色谱仪流程图1 1贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）贮液罐（滤棒
5、，可滤去颗粒状物质）贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）2 2高压泵（输液泵）高压泵（输液泵）高压泵（输液泵）高压泵（输液泵）3 3进样装置进样装置进样装置进样装置4 4色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱分离分离分离分离5 5检测器检测器检测器检测器分析分析分析分析6 6废液出口或组分收集器废液出口或组分收集器废液出口或组分收集器废液出口或组分收集器 7 7记录装置记录装置记录装置记录装置续前续前四、四、HPLC的特点和应用的特点和应用 “ “三高三高” “” “一快一快” “” “一广一广” ” 高柱效高柱效n=10n=104 4片片/ /米，柱效高（远高于一般米，柱效高（
6、远高于一般LCLC）高灵敏度高灵敏度高选择性高选择性分析速度快分析速度快应用范围广泛（可分析应用范围广泛（可分析80%80%有机化合物）有机化合物）第二节第二节 基本理论和条件选择基本理论和条件选择热力学理论：塔板理论热力学理论：塔板理论平衡理论平衡理论 基础基础动力学理论：速率理论动力学理论：速率理论VanderVander方程方程 一、塔板理论一、塔板理论二、速率理论二、速率理论 三、三、HPLCHPLC法中分离条件的选择法中分离条件的选择一、塔板理论一、塔板理论二、速率理论（与二、速率理论（与GCGC对比）对比） 1. 1.续前2 2）涡流扩散项及其影响）涡流扩散项及其影响 next n
7、ext2. 2.讨论：讨论：讨论：讨论： 1 1）流动相流速对）流动相流速对HPLCHPLC板高的影响（与板高的影响（与GCGC对比）对比）nextnext图示backback续前3 3）传质阻抗项及其影响）传质阻抗项及其影响 图示三、三、HPLC法中分离条件的选择法中分离条件的选择1. 1. 固定相与装柱方法的选择：固定相与装柱方法的选择： 选粒径小的、分布均匀的球形固定相（选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp10mdp10m） 首选化学键合相，匀浆法装柱首选化学键合相，匀浆法装柱2. 2. 流动相及其流速的选择：流动相及其流速的选择： 选粘度小、低流速的流动相选粘度小、低流速的流动相甲醇
8、，甲醇，1ml/min1ml/min 3. 3. 柱温的选择：柱温的选择： 选室温选室温25250 0C C左右左右第三节第三节 各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法 一、液固吸附色谱法（一、液固吸附色谱法（LSCLSC） 二、液液分配色谱法（二、液液分配色谱法（LLCLLC）三、化学键合相色谱法（三、化学键合相色谱法（BPCBPC）一、液固吸附色谱法（一、液固吸附色谱法（LSC） 流动相为液体，固定相为固体吸附剂流动相为液体，固定相为固体吸附剂 1 1分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性 中心能力的差异中心能力的差异 分离前提：分离前提：K
9、 K不等或不等或k k不等不等续前2 2固定相：与固定相：与LCLC比，固定相粒径不同（比，固定相粒径不同（1017% 17% 分配色谱分配色谱 硅胶失活硅胶失活载体载体 吸附的水吸附的水固定液固定液二、液液分配色谱法（二、液液分配色谱法（LLC）1 1分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异2 2固定相：载体固定相：载体+ +固定液（物理或机械涂渍法）固定液（物理或机械涂渍法） 缺点：系统内部压力大，易流失，不实用缺点：系统内部压力大，易流失，不实用 固定液固定液极性极性NLLCNLLC 固定液固定液非极性非极性RLLCRLLC3 3正相色谱正相色谱固定液
10、极性固定液极性 流动相极性流动相极性（NLLCNLLC） 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱 适于分离极性组分适于分离极性组分 反相色谱反相色谱固定液极性固定液极性 固定相极性固定相极性 底剂底剂 + + 有机调节剂（极性调节剂）有机调节剂（极性调节剂） 例：水例：水 + + 甲醇，乙腈，甲醇，乙腈，THFTHF续前4 4流动相极性与流动相极性与k k的关系：的关系： 流动相极性流动相极性 ，洗脱能力，洗脱能力 ，kk，组分，组分t tR R 5 5出柱顺序：极性大的组分先出柱出柱顺序：极性大的组分先出柱 极性小的组分后出柱极性小的组分后出柱6 6适用
11、：非极性适用：非极性 中等极性组分（中等极性组分（HPLC80%HPLC80%问题）问题）（三）正相键合相色谱（三）正相键合相色谱1 1分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、 诱导力、或氢键作用力诱导力、或氢键作用力2 2固定相：极性大的氰基或氨基键合相固定相：极性大的氰基或氨基键合相3 3流动相：极性小（同流动相：极性小（同LSCLSC） 底剂底剂 + + 有机极性调节剂有机极性调节剂 例：正己烷例：正己烷 + + 氯仿氯仿- -甲醇，氯仿甲醇，氯仿- -乙醇乙醇续前4 4流动相极性与流动相极性与k k的关系：的关系： 流动相极性流动相极性 ，洗
12、脱能力，洗脱能力 ，组分，组分t tR R ，kk5 5出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱 极性大的组分后出柱极性大的组分后出柱6 6适用：适用： 氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小）氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小） 分离物质也相似分离物质也相似 氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性 分析极性大物质、糖类等分析极性大物质、糖类等（四）离子对色谱和离子抑制色谱（四）离子对色谱和离子抑制色谱1 1反相离子对色谱法反相离子对色谱法 2 2反相离子抑制色谱反相离子抑制色谱 1反相离子对色谱法（反相离子对色谱法
13、（IPC或或PIC） 反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分与其中的反离子形成中性离子对，增加与其中的反离子形成中性离子对，增加k k和和t tR R，以改善分离，以改善分离1 1）离子对试剂：烷基磺酸钠）离子对试剂：烷基磺酸钠分析碱分析碱 四丁基季胺盐四丁基季胺盐分析酸分析酸2 2）影响影响k k的因素的因素a a与与mm的极性有关（同反相色谱）的极性有关（同反相色谱）b b与与R R的链长有关：的链长有关：RR长，极性长，极性 小，小，t tR R ，k k 3 3）适用：较强的有机酸、碱）适用：较强的有机酸、碱2反相离子抑
14、制色谱反相离子抑制色谱在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相pHpH值，抑制值，抑制组分解离，增加其组分解离，增加其k k和和t tR R，以达到改善分离的目的，以达到改善分离的目的1 1）离子抑制剂：弱酸、弱碱性物质）离子抑制剂：弱酸、弱碱性物质 pH pH一定的缓冲溶液一定的缓冲溶液2 2）k k的影响因素：的影响因素：与流动相极性有关，还与与流动相极性有关，还与pHpH值有关值有关选择流动相：应同时考虑极性及选择流动相：应同时考虑极性及pHpH值值 酸性物质酸性物质加入酸加入酸HAc tHAc tR R ，k k 碱性物质碱性物质加入碱加入碱NH
15、NH3 3HH2 2O tO tR R ，k k 调节调节pHpH范围：范围：3.08.03.08.0 pH8.0 pH8.0 破坏键合相与载体的结合破坏键合相与载体的结合 pH3.0 pH3.0 腐蚀柱子腐蚀柱子3 3）适用：极弱酸碱物质）适用：极弱酸碱物质 pH=37 pH=37弱酸；弱酸；pH=78pH=78弱碱；两性化合物弱碱；两性化合物第四节第四节 影响分离的因素影响分离的因素1 1续前2 2对流动相的要求：对流动相的要求：1 1）与固定液不反应）与固定液不反应2 2）对样品有良好溶解度）对样品有良好溶解度 k=110 k=110 k=25 k=25 最理想的最理想的3 3）与检测器
16、匹配：）与检测器匹配： UV UV（常用，测定波长应大于溶剂的截止波长）（常用，测定波长应大于溶剂的截止波长） 荧光，电化学荧光，电化学4 4）使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈）使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈） 使用前过滤、脱气使用前过滤、脱气续前 3 3洗脱方式洗脱方式 1 1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱） 以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵）以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵） 类似类似GCGC的等温度洗脱的等温度洗脱2 2）梯度洗脱：）梯度洗脱： 在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例 即不断改变其极
17、性（两个泵）即不断改变其极性（两个泵） 适于分析极性差别较大的复杂组分适于分析极性差别较大的复杂组分 类似类似GCGC的程序升温（沸程较长样品）的程序升温（沸程较长样品）图示第五节第五节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪1 1泵：泵： 恒压泵：流量精度不稳恒压泵：流量精度不稳 恒流泵：常用恒流泵：常用2 2进样装置进样装置 1 1）隔膜进样（高分子有机硅胶垫）隔膜进样（高分子有机硅胶垫进样室）进样室） GC GC系统压力较小，可以系统压力较小，可以 HPLC HPLC系统压力太大，必须停泵进样（早期）系统压力太大，必须停泵进样（早期） 2 2）阀进样：不必停泵，六通阀）阀进样：不必停泵，六通阀续前
18、3 3色谱柱：直径色谱柱：直径46mm,46mm,柱长柱长1030cm1030cm 柱效评价：色谱系统适应性试验柱效评价：色谱系统适应性试验 R R，n n，f fs s（拖尾因子）（拖尾因子） 柱再生：维护、保养、柱子的冲洗柱再生：维护、保养、柱子的冲洗4 4检测器检测器 1 1）紫外检测器：适于吸收紫外光的物质）紫外检测器：适于吸收紫外光的物质 2 2）荧光检测器：只能分析自身发光的物质）荧光检测器：只能分析自身发光的物质 灵敏度高灵敏度高 3 3）示差折光检测器：利用折光率的差别）示差折光检测器：利用折光率的差别 灵敏度低，温度要求严格灵敏度低，温度要求严格 4 4）电化学检测器）电化学检测器 5 5）化学发光）化学发光
