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1、第八章第八章微生物遗传微生物遗传ChaptereightMicrobialG内容引言引言微生物的遗传微生物的遗传微生物的变异微生物的变异微生物遗传变异知识的应用微生物遗传变异知识的应用微生物遗传的重要性：微生物是研究遗传的好材料1、个体简单，一般为单倍体，使结果容易分析。2、繁殖速度快，易于积累不同的代谢物，能无性繁殖。3、菌落形态多样，观察方便。4、环境对其作用直接而均匀。5、能在简单的合成培养基上生长，培养方便。第一节第一节微生物的遗传微生物的遗传遗传的物质基础遗传的物质基础核酸是遗传物质的证据核酸是遗传物质的证据原核微生物原核微生物真核微生物真核微生物细胞水平细胞水平99%的遗传物质在拟
2、核中的遗传物质在拟核中1%的遗传物质在质粒中的遗传物质在质粒中99%的遗传物质在核中的遗传物质在核中1%的遗传物质在细胞器中的遗传物质在细胞器中细胞核水平细胞核水平单一的环状染色质体单一的环状染色质体多条染色体构成多条染色体构成染色体水平染色体水平染色体为一裸露染色体为一裸露DNA，无组无组蛋白蛋白染色体由染色体由DNA和组蛋白构成和组蛋白构成核酸水平核酸水平多为双链多为双链NDA（病毒例外），由许多基因构成。基因是具病毒例外），由许多基因构成。基因是具有自我复制能力的遗传功能单位，为特定顺序的核酸结构有自我复制能力的遗传功能单位，为特定顺序的核酸结构基因水平基因水平有许多三联体密码构成，原核
3、生物基因数目少，真核生物有许多三联体密码构成，原核生物基因数目少，真核生物数目多数目多密码子水平密码子水平三个核苷酸构成一个密码子，编码一个三个核苷酸构成一个密码子，编码一个aa核苷酸水平核苷酸水平是最低的突变单位或交换单位，有是最低的突变单位或交换单位，有ATGC四种碱基组成，四种碱基组成，RNA中是中是AUGC一、遗传的物质基础二、核酸是遗传物质的证据转化实验转化实验噬菌体的感染实验噬菌体的感染实验病毒的拆开重建实验病毒的拆开重建实验第二节第二节微生物的变异微生物的变异突变（mutation）基因重组（generecombination）变异突变突变基因重组基因重组基因突变基因突变染色体畸
4、变染色体畸变碱基碱基置换置换移码移码突变突变转换转换颠换颠换添加添加接合接合溶原转变溶原转变转化转化转导转导缺失、重复、缺失、重复、倒位、易位倒位、易位缺失缺失一、突变（mutation）突变就是遗传物质突变就是遗传物质核酸中的核苷酸核酸中的核苷酸顺序突然发生了稳定的，可遗传的变化，顺序突然发生了稳定的，可遗传的变化，是基因结构上的改变，包括基因突变和是基因结构上的改变，包括基因突变和染色体畸变。染色体畸变。（一）基因突变（一）基因突变（genemutation）（二）染色体畸变二）染色体畸变（chromosomalaberration)（一）基因突变（genemutation）DNA分子上一
5、对或少数几对碱基发分子上一对或少数几对碱基发生改变而引起的遗传变异生改变而引起的遗传变异1、基因突变的类型2、基因突变的特点3、基因突变自发性和不对应性的证明4、突变的机制5、突变的修复1、基因突变的类型按突变体的表型特征不同可分为：（1）形态突变型形态突变型：个体形态、菌落形态的变化（2）生化突变型生化突变型：代谢途径发生变异：有几类a营养缺陷型b抗性突变型c抗原突变型（3）致死突变型与条件致死突变型致死突变型与条件致死突变型（4）其他突变型：其他突变型：如毒力，发酵能力，产量等2、基因突变的特点（1）不对应性不对应性：突变的性状与引起突变的原因间无直接的对应关系（2）自发性自发性（3）诱变
6、性诱变性（4）稀有性稀有性：突变率低而稳定10-610-9（5）独立性独立性：突变是独立的、随机的。不影响其他基因的突变。（6）稳定性稳定性：突变是可遗传的。（7）可逆性可逆性：可发生回复突变。由原始的野生型基因变异为突变型基因的过程称为正向突变，相反的过程成为回复突变3、基因突变自发性和不对应性的证明（1）变量实验（变量实验（fluctuationtest):大肠杆菌抗phage突变株不是由phage诱导出来的（2）涂布实验涂布实验(Newcombexperiment)：大肠杆菌抗phage突变株不是由phage诱导出来的（3）影印培养实验影印培养实验(replicaplating)：大肠杆
7、菌链霉素抗性突变株不是由链霉素诱导出来的大肠杆菌稀释培养物10ml10ml(培养前先分成50小管)(在同一个大管中作整体培养)23070154435变量试验大肠杆菌抗phage突变株不是由phage诱导出来的涂布试验涂布敏感菌5104个共12个平板5104个菌落5000个细菌/菌落喷入T1保温重新涂布后喷入T1保温6个平板共353个菌落6个平板共28个菌落大肠杆菌抗phage突变株不是由phage诱导出来的5h5h影印培养无药培养基含药培养基影印培养试验原始敏感菌种大肠杆菌链霉素抗性突变株不是由链霉素诱导出来的4、突变的机制突变具有自发性和诱变性，就是说突变能够自发产生，也可以由理化因子诱发产
8、生。凡能显著提高突变频率的理化因子都可凡能显著提高突变频率的理化因子都可称为诱变剂称为诱变剂。自发突变是这样产生的？诱变因子怎样促使诱变的？(1)诱变机制诱变的种类很多，作用方式各异，但诱诱变的种类很多，作用方式各异，但诱变都是使遗传物质的结构发生变化。因变都是使遗传物质的结构发生变化。因为基因突变分碱基对的置换与移码突变，为基因突变分碱基对的置换与移码突变，所以机制也分为二部分来讲所以机制也分为二部分来讲:、碱基对的置换、碱基对的置换Subsititution、移码突变移码突变frame-shiftmutationorphase-shiftmutation、碱基对的置换Subsitituti
9、on转换转换(transition):嘌呤嘌呤嘌呤嘌呤or嘧啶嘧啶嘧嘧啶啶颠换颠换(transversion):嘌呤嘌呤嘧啶嘧啶or嘧啶嘧啶嘌嘌呤呤a a 、直接引起置换的诱变剂直接引起置换的诱变剂b、 间接引起置换的诱变剂间接引起置换的诱变剂a、直接引起置换的诱变剂特点：特点：能直接与碱基发生化学反应，在体内和离体能直接与碱基发生化学反应，在体内和离体下均有作用下均有作用种类：种类：HNO2，羟胺（羟胺（NH2OH），），及各种烷化剂及各种烷化剂（如：硫酸二乙酯（如：硫酸二乙酯DSE，甲基磺酸乙酯甲基磺酸乙酯EMS，亚硝基亚硝基胍，环氧乙酸，氮芥等）胍，环氧乙酸，氮芥等）分子机制：分子机制：
10、以以HNO2为例：为例：亚硝酸使碱基氧化脱氨亚硝酸使碱基氧化脱氨成次黄嘌呤成次黄嘌呤碱基的置换直接引起置换的诱变剂直接引起置换的诱变剂HNO2CNH2腺嘌呤CO次黄嘌呤(Hk)A.THe.THk.THk.CA.THk.CG.CCOH次黄嘌呤(He)互变异构b、间接引起置换的诱变剂特点特点：分子结构与某些碱基类似，在复制时因错配而掺入到DNA分子中而引起的。种类种类：如5-BU（5-溴尿嘧啶），5-AU（5-氨基尿嘧啶），8-NG（8-氮鸟嘌呤），2-AP（2-氨基嘌呤）机制机制（以5-BU为例）：5-溴尿嘧啶是胸腺嘧啶的类似物，在DNA复制时能掺入到DNA链中与A配对。COBr5-BU:酮式C
11、 OHBr5-BU:烯醇式碱基的置换间接引起置换的诱变剂间接引起置换的诱变剂间接引起置换的诱变剂间接引起置换的诱变剂C OHT：烯醇式CT：酮式OG.CA.BUG.BUA.BUG.CA.TA.TA.TA.TG.CA.BU酮式G.BU烯醇式烯醇式碱基的置换移码突变phase-shiftmutation是指DNA分子中多了或少了一个或几个核苷酸，从而使该部分后面的遗传密码发生转录或转译错误的一类突变。引起这类突变的主要是吖啶类染料（原黄素，吖啶黄，吖啶橙等）和一系列ICR类化合物（InstituteforCancerResearch，是一些由烷化剂与吖啶类化合物相结合的化合物）。它们的诱变机制还不
12、很清楚，但因它们是一种平面型三环分子结构与一个嘌呤和嘧啶对十分相似，故能嵌入两个相邻的NDA碱基对之间，造成双螺旋的部分解开，从而DNA复制过程中会使链上增添或缺失一个碱基，结果引起了移码突变。缺失或添加3、6、9个碱基时，后面的读码不变。移码突变分子中缺失或增加少数几个碱基对而引起分子中缺失或增加少数几个碱基对而引起造成突变点以后全部遗传密码转录与转释发生错误造成突变点以后全部遗传密码转录与转释发生错误ABC ABCABCABCABCABCABCABCAB+ABC ABCCBA CBA CBA CBA CBAABC BCA BCA BCABCABCABCABCA增添一个碱基增添一个碱基缺少一
13、个碱基缺少一个碱基基因突变之后是否一定能引起性状的改变呢？a、同义突变同义突变：突变的结果不改变aa的编码，如：ATGATAATT（DNA）GCAGCGGCC（RNA）都编码精氨酸b、无义突变无义突变：突变的结果产生终止密码，形成不完整的肽链。色氨酸终止c、错义突变错义突变：突变的结果引起了性状的改变如：TGCTACTTC（DNA）ACGATGAAG（mRNA）|半胱氨酸酪氨酸苯丙氨酸（2）自发突变的机制自发突变没有人工参与所发生的突变，并非是没有原因的突变只是了解不深，可能的机制有：背景辐射和环境因素的诱变背景辐射和环境因素的诱变：如宇宙中的各种射线，uv，高温等自身代谢产物的诱变自身代谢产
14、物的诱变：如H2O2具有诱变作用互变异构效应互变异构效应：T和G会以酮式或稀醇式两种互变异构状态出现；A和C可以氨基或亚氨基式两种状态出现；T酮式与A配对，T稀醇式与G配对，C氨基式与G配对，C亚氨式与A配对环出效应环出效应：在DNA的复制过程中，如果某一单链上偶尔产生小环，则在复制时易发生缺失而造成突变5、突变的修复突变对微生物往往是有害的，但并不是说所有的突变都能保留下去，微生物也能对突变造成的损伤进行修复，如紫外线能造成DNA形成T=T，但微生物也能以多种方式进行修复经紫外线照射后的微生物暴露于可见光下时，可明显降低其死亡率的现象称为光复活作用主要是由于T=T在黑暗时能与一种光激活酶结合
15、，当这种复合物暴露于300-500nm的可见光时，吸收光能使T=T重新解离成单体，所以紫外诱变时必须在红光下操作光复活作用光复活作用：photoreactivation暗修复作用暗修复作用（切除修复作用）darkrepair由内切核酸酶切开缺口，外切核苷酸酶切除二聚体，DNA聚合酶修补连接，酶连接（p173）其他还有重组修复，重组修复，SOS修复修复等。详见盛祖嘉微生物遗传（二）染色体畸变（略）二、基因重组（generecombination）凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子的重新组合后形成新遗传型个体的方式称为基因重组。（一）真核微生物的基因重组（二）原核生物的基因重
16、组anastomosis（一）真核微生物的基因重组方式方式有性繁殖过程中进行，有性繁殖过程中进行，半知菌类不进行典型的有性繁殖而进行半知菌类不进行典型的有性繁殖而进行准性生殖（准性生殖（parasexuality）：其基因重组靠其基因重组靠两个不同来源的体细胞之间的融合，通过少数两个不同来源的体细胞之间的融合，通过少数核中染色体的交换和单倍体化，形成极个别的核中染色体的交换和单倍体化，形成极个别的具有新性状的单倍体杂合子具有新性状的单倍体杂合子过程：菌丝联结过程：菌丝联结形成异核体（质配）形成异核体（质配）核融核融合或核配合或核配体细胞交换和单倍体化体细胞交换和单倍体化（不进行减（不进行减数分
17、裂）数分裂）（二）原核生物的基因重组1、转化转化transformation2 2、转导转导transduction3 3、接合接合 conjugation1、转化transformation（1）发现肺炎链球菌（2）、定义受体菌直接吸收来自供体菌的受体菌直接吸收来自供体菌的NDA片段，片段，通过交换，把它整合到自己的基因组中，通过交换，把它整合到自己的基因组中，从而获得了供体菌部分遗传性状的现象，从而获得了供体菌部分遗传性状的现象，称为转化，转化后的受体菌就称为转化子。称为转化，转化后的受体菌就称为转化子。转化是游离转化是游离DNA片段的转移和重组片段的转移和重组游离质粒的转移也称转化游离质
18、粒的转移也称转化（3）转化的决定因素a、受体与供体的受体与供体的DNA片段的亲缘关系。片段的亲缘关系。一般亲缘关系越近转化效率越高。b、受体菌所处的生理状态。受体菌所处的生理状态。受体菌最易接受外源DNA片段并实现转化的生理状态称为感受态感受态。感受态受该菌的遗传性、菌龄（一般对数生长期及稳定期初期易出现）、生理状态和培养条件等的影响c、环境条件环境条件cAMP和CaCl2能提高感受态水平d、有足够浓度的双有足够浓度的双链链DNA片段作为供体，片段作为供体，但转化时进入受体细胞的往往只是供体的一条链。（4）转化过程（以G的肺炎链球菌为例a、双链双链DNA片段与感受态细菌细胞表面的特片段与感受态
19、细菌细胞表面的特定位点结合定位点结合b、在特点位点上的在特点位点上的DNA片段发生酶解，形成片段发生酶解，形成平均分子量平均分子量45106的的DNA片段片段c、DNA双链中的一条链逐步降解，另一条链双链中的一条链逐步降解，另一条链进入细胞进入细胞d、转化转化DNA单链与受体菌染色体上的同源区单链与受体菌染色体上的同源区段配对，经取代后形成杂种段配对，经取代后形成杂种DNA区段区段e e 、受体菌染色体组复制，染色体分离，形成受体菌染色体组复制，染色体分离，形成一个转化子一个转化子（G+菌中双链同时进入但整合时以单链整合）转化转化过程过程2、转导transduction发现发现：1951年年Z
20、inderandLederberg鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌LA-2 His-LA-2 His-LA-22 try-LA-22 try-LA-2(his-)LA-22(try-)PumpPumpMMMMMM超微烧结玻超微烧结玻璃过滤板璃过滤板用泵抽后用泵抽后（2）定义以缺陷噬菌体为媒介，将供体细胞的以缺陷噬菌体为媒介，将供体细胞的DNA片段携带到受体细胞中，从而使受体细胞片段携带到受体细胞中，从而使受体细胞获得了供体细胞部分遗传性状的现象获得了供体细胞部分遗传性状的现象分为两种类型分为两种类型A：普遍性转导（普遍性转导（generalizedtransduction）B：局限性转导（局限性转
21、导（restricted或或specializedtransduction）A、普遍性转导（generalizedtransduction）烈性噬菌体能把供体菌中的任一基因（包烈性噬菌体能把供体菌中的任一基因（包括质括质粒）转接到受体菌中。粒）转接到受体菌中。完全转导（完全转导（completetransduction)流产转导流产转导(abortivetransduction):供体A-B+普遍性转导普遍性转导(complete transduction) A-B+A+B-少数受体A+B+经重组形成转导子鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌A+B-多数受体A-B+色氨酸缺陷型A+B-组氨酸缺陷型机制
22、：烈性噬菌体感染供体后在供体内复制，机制：烈性噬菌体感染供体后在供体内复制，在包装时误把供体的在包装时误把供体的DNA片段（任一片段）片段（任一片段）包在衣壳内，待供体裂解后，这种缺陷型包在衣壳内，待供体裂解后，这种缺陷型phage再去感染受体菌，并与受体菌同源染再去感染受体菌，并与受体菌同源染色体配对，双交换后形成稳定的转导子。色体配对，双交换后形成稳定的转导子。所以，这种所以，这种phage必须对供体是烈性必须对供体是烈性phage，对受体由于是缺陷型对受体由于是缺陷型phage，故不裂解故不裂解。流产转导流产转导(abortivetransduction)导入的基因没有整合到受体菌染色体
23、上，导入的基因没有整合到受体菌染色体上，因而不能传给后代，但因母细胞细胞质因而不能传给后代，但因母细胞细胞质中含有的酶有一半传给子代，因此还能中含有的酶有一半传给子代，因此还能继续分裂几代，形成小菌落。继续分裂几代，形成小菌落。B：局限性转导（restricted或specializedtransduction）温和噬菌体只能把供体少数特定的基因温和噬菌体只能把供体少数特定的基因转移到受体菌中转移到受体菌中以温和噬菌体为媒介，把供体菌的少数以温和噬菌体为媒介，把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中特定基因转移到受体菌中的转导现象叫的转导现象叫局限性转导。局限性转导。galbiogalbio宿主基
24、因组整合不正常切离（10-410-6）正常切离正常dgaldbio局限局限转导转导溶原转变（Lysogenicconversion）温和噬菌体感染宿主而使之发生溶原化温和噬菌体感染宿主而使之发生溶原化时，因噬菌体的基因整合到宿主的基因时，因噬菌体的基因整合到宿主的基因组上，使后者除获得免疫性外，还获得组上，使后者除获得免疫性外，还获得了其它新性状的现象。了其它新性状的现象。3、接合conjugation（1）发现发现1946年年Lederberg和和Tatum的的试验试验用用大肠杆菌的多重营养缺陷型菌株进行大肠杆菌的多重营养缺陷型菌株进行杂交实验杂交实验用用U型管实验发现不能得到重组子，说明型
25、管实验发现不能得到重组子，说明需要细胞之间的直接接触需要细胞之间的直接接触+A+B+C-D-维甲缺陷型A-B-C+D+苏赖缺陷型接合及其发现A+B+C+D+通通过过细细胞胞间间的的直直接接接接触触能能进进行行大大段段的的转转移移的的过过程程，叫叫接接合合（2）定义指遗传物质通过细胞与细胞的直接接触指遗传物质通过细胞与细胞的直接接触而进行转移和重组的过程。而进行转移和重组的过程。所以要有细菌的直接接触才能转移物质，所以要有细菌的直接接触才能转移物质，后来随着电镜的广泛应用，发现大肠杆后来随着电镜的广泛应用，发现大肠杆菌的接合与性纤毛有关，性纤毛是中空菌的接合与性纤毛有关，性纤毛是中空的，遗传物质
26、可通过性纤毛进行转移。的，遗传物质可通过性纤毛进行转移。（3）F因子和接合根据对接合行为的研究，发现大肠杆菌是根据对接合行为的研究，发现大肠杆菌是有性别分化的，决定其性别分化的是一致有性别分化的，决定其性别分化的是一致育因子（育因子（fertilityfactor）简称简称F因子，因子，是一种性质粒。是一种性质粒。F因子是一种附加体质粒。因子是一种附加体质粒。（既可脱离染既可脱离染色体而独立存在，也可整合到染色体上色体而独立存在，也可整合到染色体上）根据根据F因子在细菌中的存在方式把细菌分四类：因子在细菌中的存在方式把细菌分四类：F+F-HfrFF+：具有游离的具有游离的F因子因子,在细胞表面
27、有性纤毛。F-：无：无F因子，能与因子，能与F+细菌结合也能与细菌结合也能与Hfr结结合得到部分或全部染色体信息。合得到部分或全部染色体信息。F+F-F+F+HfrF-Hfr+F-（绝大多数情况）绝大多数情况）HfrF-Hfr+F+（全部转移时才发生）全部转移时才发生）根据根据Hfr与与F-结合的不同时间终止接合，可结合的不同时间终止接合，可画出细菌的环状染色体图。画出细菌的环状染色体图。雄性菌株Hfr菌株F菌株菌株（雌株）因子和接合因子和接合F+菌株FF+F+F+F+FFF+FHfrHfrF（多数情况下）F+HfrHfrHfr（少数情况下）雄性菌株与雌性菌株接合结果第三节第三节微生物遗传变异
28、知识微生物遗传变异知识的应用的应用一、突变与育种二、杂交育种（略）三、基因工程geneengineering四、原生质体融合protoplastfusion五、菌种保藏preservation六、突变与致癌物监测Amestest一、突变与育种（一）、自发突变与育种（二）、诱变育种（一）、自发突变与育种1、从生产中选育：在日常生产过程中，、从生产中选育：在日常生产过程中，筛选好的优良菌种筛选好的优良菌种.例如：在发酵生产中，筛选发酵特别旺盛的进行纯种分离2、定向培育优良菌种、定向培育优良菌种定向培育是指用某一特定环境长期处理某定向培育是指用某一特定环境长期处理某一微生物培养物，同时不断对它们进行
29、移一微生物培养物，同时不断对它们进行移种传代以达到积累和选择合适的自发突变种传代以达到积累和选择合适的自发突变体的一种古老的育种方法体的一种古老的育种方法。例如：要选育抗青霉素的菌株，可在青霉素的梯度平板上进行长期移种传代但是，由于自发突变体往往比较低，因此此种方法效率低，需要长期的艰苦耐心的工作才能完成。如：卡介苗的获得用了13年时间，法国的Calmette和Guerin将结核分枝杆菌移种230多代。（二）诱变育种1 1、定义：用物理或化学诱变剂处理均匀分散、定义：用物理或化学诱变剂处理均匀分散的细胞群，促使其突变频率大幅度提高，然后的细胞群，促使其突变频率大幅度提高，然后采用简便、快速和高
30、效的筛选方法从中挑选少采用简便、快速和高效的筛选方法从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学实验之用。学实验之用。意义：青霉素1943年发酵效价20单位/ml1977年5万单位/ml现在10万单位/ml；链霉素1949年50单位/ml1977年3万单位/ml。2、诱变育种的基本环节大多死亡少数存活存活率多数未变少数突变突变率多数负变少数正变正变率多数幅度小少数幅度大高产率出发菌株计算出诱变投产率多数不宜投产少数适宜投产3、诱变育种工作中应考虑的几个原则选择优良的出发菌株选择简便有效的诱变剂处理单孢子（或单细胞）悬液选用最适剂量利用复合处理的协
31、同效应利用和创造形态，生理与产量间的相关指标设计或采用高效筛选方案或方法4、营养缺陷型菌株的筛选营养缺陷型是指一些营养物质的合成能营养缺陷型是指一些营养物质的合成能力上出现缺陷，因此必须在基本培养基力上出现缺陷，因此必须在基本培养基中加入相应的有机营养成分才能正常生中加入相应的有机营养成分才能正常生长的变异菌株。其变异前的原始菌株称长的变异菌株。其变异前的原始菌株称为野生型。为野生型。筛选一般步骤（1）诱变剂处理）诱变剂处理（2）淘汰野生型）淘汰野生型（3）检出缺陷型）检出缺陷型（4 4）鉴定缺陷型）鉴定缺陷型（2）淘汰野生型用抗生素法：如青霉素杀死繁殖着的用抗生素法：如青霉素杀死繁殖着的G+
32、菌菌菌丝过滤法：适于丝状真菌。基本培养基菌丝过滤法：适于丝状真菌。基本培养基中野生型长成菌丝而缺陷型的不长。中野生型长成菌丝而缺陷型的不长。差别杀菌法：野生型的芽孢能发育成营养差别杀菌法：野生型的芽孢能发育成营养体，加热杀死。体，加热杀死。青霉素抗性含青霉素之液体基本培养基缺陷型菌落培养离心去除青霉素或高倍稀释加完全培养基菌丝 过滤法筛选营养突变株基本培养基中培养完全培养基中长出菌丝体（缺陷型）菌丝过滤得营养突变株（3）检出缺陷型a夹层培养法夹层培养法培养后就出现的菌落多为营养缺陷型培养后就出现的菌落多为营养缺陷型b限量补充培养法限量补充培养法在基本培养基中加微量（在基本培养基中加微量（0.0
33、1%以下）的相应物质以下）的相应物质（或蛋白胨）进行培养。缺陷型生长缓慢，菌落小（或蛋白胨）进行培养。缺陷型生长缓慢，菌落小。c逐个检出法逐个检出法d影印培养法影印培养法夹层培养法及结果小菌落是第二次长起来的（营养缺陷型）上层：CM中层：MM下层：琼脂限量补充培养法 微量蛋白质的完全培养基上 小菌落是营养缺陷型突变株涂布培养基本培养基上不长菌落完全培养基上长出菌落含诱变剂的液体培养基菌种营养缺陷型 逐个检出法影印接种法影印接种法完全培养基完全培养基影印接种基本培养基基本培养基营养缺陷型（4）鉴定缺陷型在基本培养基上不长在基本培养基上不长基本培养基基本培养基+相应成分（相应成分（aa、vitam
34、in，碱基等）上能长碱基等）上能长用生长谱法来确定是哪一种缺陷型。用生长谱法来确定是哪一种缺陷型。二、杂交育种（略）三、基因工程geneengineering1 1、定义：用人为的方法将所需要的供体、定义：用人为的方法将所需要的供体遗传物质（遗传物质（DNA）提取出来，在离体的提取出来，在离体的条件下切刻后，把它和载体条件下切刻后，把它和载体DNA分子连分子连接起来。然后导入某一受体细胞中，以接起来。然后导入某一受体细胞中，以让外来的遗传物质在受体细胞内进行正让外来的遗传物质在受体细胞内进行正常的复制和表达。所以，常的复制和表达。所以，是人工的、离体的、分子水平上的一种是人工的、离体的、分子水
35、平上的一种遗传重组新技术。遗传重组新技术。2、主要步骤供体系统：动物、植物、微生物供体系统：动物、植物、微生物载体系统：质粒、噬菌体等载体系统：质粒、噬菌体等受体系统：大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌受体系统：大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌要处于感受态要处于感受态工具酶：限制性内切酶，连接酶等工具酶：限制性内切酶，连接酶等基因工程示意图3、应用a工业上工业上胰岛素，生长激素胰岛素，生长激素b农业上农业上固氮基因固氮基因至禾木科作物至禾木科作物上上纤维素分解基因纤维素分解基因至酿酒酵母中至酿酒酵母中c医药保健上医药保健上治疗遗传病（人类半乳糖血治疗遗传病（人类半乳糖血症不能利用半乳糖，把症不能利用半乳糖，
36、把E.coli的半乳糖基因离的半乳糖基因离体转到人身上的成纤维细胞得到治疗）体转到人身上的成纤维细胞得到治疗）d环保上环保上降解酶降解酶四、原生质体融合protoplastfusion1 1、定义：通过人为方法使遗传性状不同、定义：通过人为方法使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合并产生重的两细胞的原生质体发生融合并产生重组子的过程。组子的过程。2、主要步骤：亲本菌株的标记亲本菌株的标记原生质体的制备原生质体的制备原生质体融合原生质体融合融合子选出（细胞壁再生）融合子选出（细胞壁再生）遗传稳定性测定遗传稳定性测定形状测定形状测定啤酒酵母亲本糖化酵母诱变Arg-His-制备原生质体融合Arg+
37、,His+在基本培养基上选出融合子高渗培养基细胞壁再生五、菌种保藏preservation1 1、原因：菌种的衰退、原因：菌种的衰退degeneration变异性是绝对的，稳定性是相对的。在变异性是绝对的，稳定性是相对的。在变异的种中，退化性的变异是大量的，变异的种中，退化性的变异是大量的，进化性的变异却是个别的。菌种的衰退进化性的变异却是个别的。菌种的衰退是发生在细胞群体中的一个从量变到质是发生在细胞群体中的一个从量变到质变的逐步演变过程。如果不采取措施，变的逐步演变过程。如果不采取措施，则负变的个体会变得越来越多，形成了则负变的个体会变得越来越多，形成了一个不纯的群体。一个不纯的群体。2、
38、衰退的防止（1）控制传代次数）控制传代次数微生物的突变都是在繁殖过程中发生或表现出来的（2）创造良好的培养条件。）创造良好的培养条件。如：在赤霉素生产菌的培养基中加入蜜糖，天冬酰胺等可防止菌种衰退，山西土曲霉在33摄氏度培养可防止产孢能力的衰退。（3）利用不同类型的菌种进行接种传代）利用不同类型的菌种进行接种传代用单核的孢子移种较好，用多核菌丝或异核体不好（4 4）采用有效的菌种保藏方法）采用有效的菌种保藏方法3、复壮rejuvenation发生了衰退该怎么办呢，这就需要复壮了发生了衰退该怎么办呢，这就需要复壮了复壮（狭义）：对已发生衰退的菌种，通过纯种复壮（狭义）：对已发生衰退的菌种，通过纯
39、种分离和性能测定等方法，从衰退的群体中找出少分离和性能测定等方法，从衰退的群体中找出少数尚未衰退的个体，以达到恢复该菌种原有典型数尚未衰退的个体，以达到恢复该菌种原有典型性状的一种措施。性状的一种措施。复壮（广义）：在菌种的生产性能上未衰退之前复壮（广义）：在菌种的生产性能上未衰退之前就经常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定就经常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，以使菌种的生产性能有所提高。实际上是工作，以使菌种的生产性能有所提高。实际上是一种用自发突变不断从生产从进行选种的工作。一种用自发突变不断从生产从进行选种的工作。4、复壮的方法纯种分离纯种分离通过寄主体进行复制（对寄生性微生
40、通过寄主体进行复制（对寄生性微生物而言）物而言）淘汰已衰退的个体淘汰已衰退的个体-10度度-30度度如：如：5406的分生孢子的分生孢子死死亡率亡率80%。在抗低温的存活个体中，留。在抗低温的存活个体中，留下的是未退化的健壮个体下的是未退化的健壮个体。5、菌种保藏preservation（1 1）定义：选择优良的纯种（最好是休）定义：选择优良的纯种（最好是休眠体），创造一定条件，尽可能降低微眠体），创造一定条件，尽可能降低微生物的代谢活动强度，生物的代谢活动强度，使之基本上处于使之基本上处于休眠状态，以避免菌种死亡和防止菌种休眠状态，以避免菌种死亡和防止菌种优良性状的丧失。优良性状的丧失。（2
41、）方法主要是用低温、干燥、缺氧气、缺养料等方法使微主要是用低温、干燥、缺氧气、缺养料等方法使微生物处于休眠状态生物处于休眠状态A低温保藏法：低温保藏法：45摄氏度冰箱可保藏摄氏度冰箱可保藏3个月个月B隔绝空气保藏法：缺氧（用石蜡油或橡皮塞封口）隔绝空气保藏法：缺氧（用石蜡油或橡皮塞封口）C砂土管保藏法（孢子、芽孢）砂土管保藏法（孢子、芽孢）缺养料，干燥缺养料，干燥D真空冷冻干燥包藏法真空冷冻干燥包藏法缺氧、低温、干燥缺氧、低温、干燥六、突变与致癌物监测Amestest用于环境、食品、药物等的三致监测用于环境、食品、药物等的三致监测（致突变，致畸，致癌）（致突变，致畸，致癌）鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒
42、沙门氏菌His-His+基本原理鼠伤寒沙门氏菌（鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphimurium）的组氨酸的组氨酸缺陷型（缺陷型（his-）菌菌株在基本培养基中不能生长，若将它培养在株在基本培养基中不能生长，若将它培养在含突变物的平板上则可能发生回复突变，使含突变物的平板上则可能发生回复突变，使之在基本培养基中能够生长。之在基本培养基中能够生长。但某些物质本身不是诱变剂，但进入动物体但某些物质本身不是诱变剂，但进入动物体后经生化修饰可能变成诱变剂，因此监测物后经生化修饰可能变成诱变剂，因此监测物质应先与鼠肝匀浆保温，让它发生生化修饰质应先与鼠肝匀浆保温，让它发生生化修饰后，再置于后，
43、再置于MM平板上平板上S.t.his回变S.t.his吸入滤纸片保温可疑“三致”试样鼠肝匀浆（含羟化酶）阳性阴性利用回变检测致癌剂利用回变检测致癌剂艾姆斯试验法艾姆斯试验法复习题：遗传性、变异性、基因型、表型、饰变遗传性、变异性、基因型、表型、饰变怎样证明核酸是遗传变异物质基础怎样证明核酸是遗传变异物质基础基因突变、转换、颠换、碱基置换、移码突基因突变、转换、颠换、碱基置换、移码突变、基因重组、接合、转化、转导、性导、转变、基因重组、接合、转化、转导、性导、转化子、普遍性转导与局限性转导化子、普遍性转导与局限性转导基因突变的特点，怎样证明基因突变是自发基因突变的特点，怎样证明基因突变是自发性和不对应性的（三个经典实验）性和不对应性的（三个经典实验）F+、F-、Hfr、F之间的相互关系之间的相互关系诱变育种工作中应遵循的原则诱变育种工作中应遵循的原则营养缺陷型筛选的一般方法营养缺陷型筛选的一般方法菌种保藏方法菌种保藏方法
