生殖细胞工程PPT课件

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1、第五章第五章 植物生殖细胞工程植物生殖细胞工程第一节第一节 花药与花粉培养花药与花粉培养第二节第二节 植物胚胎培养植物胚胎培养v 胚培养胚培养v 胚乳培养胚乳培养v 胚珠胚珠v 子房培养子房培养11 1、花药、花粉培养的花药、花粉培养的基本概念基本概念及意义及意义2 2、花药培养程序、花药培养程序3 3、花粉及小孢子培养程序、花粉及小孢子培养程序 4 4、花药和花粉培养中雄核发育的途径及影响因素、花药和花粉培养中雄核发育的途径及影响因素5 5、单倍体形成的途径、单倍体形成的途径 6 6、花药及花药及花粉植物的倍性及染色体加倍花粉植物的倍性及染色体加倍第一节第一节 花药与花粉培养花药与花粉培养2

2、Ovary花柱花柱柱头柱头 花丝花丝 胚珠胚珠 子房子房 花瓣花瓣 萼片萼片 34 花药是位于花丝顶端的结构花药是位于花丝顶端的结构, ,可以算做是器官；花粉是花药里的花粉母细胞可以算做是器官；花粉是花药里的花粉母细胞( (或小孢子母细胞或小孢子母细胞) )通过一次减数分裂产生四个花粉粒（也叫小孢子，其中三个退通过一次减数分裂产生四个花粉粒（也叫小孢子，其中三个退化，另一个再通过一次有丝分裂形成两个精细胞）。化，另一个再通过一次有丝分裂形成两个精细胞）。 油菜成熟花药的结构油菜成熟花药的结构花粉囊花粉囊花粉囊壁花粉囊壁成熟花粉粒成熟花粉粒花药裂口花药裂口花药花药&花粉花粉51)1)基本概念基本

3、概念 (1) (1) 花药培养（花药培养（anther cultureanther culture）: :指把发育到一定阶段的花药接种到人工培指把发育到一定阶段的花药接种到人工培养基上中，养基上中，以形成花粉胚或花粉愈伤组织进而分化成植株。以形成花粉胚或花粉愈伤组织进而分化成植株。由于使用的外植体是由于使用的外植体是植株的雄性器官，花药培养属于器官培养的范畴。植株的雄性器官，花药培养属于器官培养的范畴。 19641964年年GuhaGuha等首次报道从毛曼陀罗的花药培养获得了单倍体。目前，已有等首次报道从毛曼陀罗的花药培养获得了单倍体。目前，已有2323个科，个科，5252个属的个属的2502

4、50多种高等植物的花药培养获得了成功（胡道芬，多种高等植物的花药培养获得了成功（胡道芬，19961996）。）。 我国的我国的花花药培养处于世界前列至少有药培养处于世界前列至少有3232种谷类作、蔬菜和木本植物的花种谷类作、蔬菜和木本植物的花药培养再生植株由我国学者首先报道药培养再生植株由我国学者首先报道，如小麦、玉米、大豆、辣椒、白菜、柑橘如小麦、玉米、大豆、辣椒、白菜、柑橘等。等。 1、花药、花粉培养的基本概念及意义、花药、花粉培养的基本概念及意义花药培养花药培养&花粉培养花粉培养6 花粉粒花粉粒(n) 药隔组织药隔组织(2n) 药壁药壁(2n) 花丝花丝(2n)拟南芥花药拟南芥花药 7(

5、2) (2) 花粉培养花粉培养(pollen culture)(pollen culture)又叫小孢子培养又叫小孢子培养(microspore culture):(microspore culture):从花药中分离出花粉粒，使之成为分散的或游离的状态，通过培养使药粉从花药中分离出花粉粒，使之成为分散的或游离的状态，通过培养使药粉粒脱分化，进而发育成完整的植株的过程。粒脱分化，进而发育成完整的植株的过程。 花粉的发育期：花粉母细胞四分体期小孢子早期、中期和晚期有丝分花粉的发育期：花粉母细胞四分体期小孢子早期、中期和晚期有丝分裂期和双核花粉期（营养核和生殖核）裂期和双核花粉期（营养核和生殖核）

6、 一般将处于四分体到单核早期的花粉称一般将处于四分体到单核早期的花粉称小孢子小孢子； 进入单核以后则称为进入单核以后则称为花粉花粉。生殖核再次有丝分裂，形成两个精子生殖核再次有丝分裂，形成两个精子在花粉粒中进行，形成三细在花粉粒中进行，形成三细胞花粉，如白菜、小麦等胞花粉，如白菜、小麦等在花粉管中进行，形成二细在花粉管中进行，形成二细胞花粉，如烟草、棉花等胞花粉，如烟草、棉花等89 2 2）花药、花粉培养的意义）花药、花粉培养的意义 A. A. 缩短育种年限缩短育种年限 按照常规育种，杂种从按照常规育种，杂种从F F2 2代开始分离，继续自交，通过不断选代开始分离，继续自交，通过不断选择和淘汰

7、，一般需到择和淘汰，一般需到F F5 5-F-F6 6代才能得到基因型纯合的后代。代才能得到基因型纯合的后代。 用花药或花粉（用花药或花粉（n n）培养，先得到单倍体植株，再进行染色体培养，先得到单倍体植株，再进行染色体加倍，即可获得纯合二倍体（加倍，即可获得纯合二倍体（2n2n）。）。这样，从杂交到纯合株系，只这样，从杂交到纯合株系，只需需2 2个世代，即可缩短个世代，即可缩短3-43-4个育种世代。个育种世代。10B. B. 提高选择效率提高选择效率 F F1 1花粉母细胞减数分裂形成各种各样配子类型，进而发育成花花粉母细胞减数分裂形成各种各样配子类型，进而发育成花粉。用花粉培养获得单倍体

8、再生植株（粉。用花粉培养获得单倍体再生植株（n n），），配子基因型在再生植配子基因型在再生植物体中完全表达，即再生植物基因型也是多种多样的，这为选育种物体中完全表达，即再生植物基因型也是多种多样的，这为选育种提供了很广泛的变异类型。提供了很广泛的变异类型。特别是隐性基因也可以得到充分的表达。特别是隐性基因也可以得到充分的表达。因此，将花药花粉培养与常规育种相结合，就能大大提高育种因此，将花药花粉培养与常规育种相结合，就能大大提高育种选择的效率。选择的效率。 112 2、花药培养程序、花药培养程序外植体的选择外植体的选择材料的表面灭菌材料的表面灭菌接种接种培养与植物再生培养与植物再生生根与移栽

9、生根与移栽12 1 1）外植体的选择直接关系到培养能否成功。）外植体的选择直接关系到培养能否成功。 供试材料的遗传背景供试材料的遗传背景 供试材料的生理状态供试材料的生理状态 多年生植物中，幼年植株比老龄植物的花药诱导频率高；草本多年生植物中，幼年植株比老龄植物的花药诱导频率高；草本植物生长好、处于生殖生长高峰期的花药好，而徒长或营养不良的植物生长好、处于生殖生长高峰期的花药好，而徒长或营养不良的植物花药较差。植物花药较差。 13减数分裂过程图解示意减数分裂过程图解示意 1. 细线期期 2. 凝凝线期期 3. 染色体聚集染色体聚集成成“花花朵状状” 4. 偶偶线期期5. 粗粗线期期6. 双双线

10、期期 7. 终变期期8-9. 中期中期I 10. 后期后期I 11. 末期末期I 12. 二分体二分体(减数减数分裂分裂间期期) 13. 前期前期 14. 中期中期15. 后期后期 16. 末期末期17. 四分体四分体 18. 幼幼龄单核花核花粉粒粉粒花粉的发育时期花粉的发育时期大多数植物而言，当大多数植物而言，当花粉发育花粉发育处于处于单核中期到单核晚期单核中期到单核晚期的花药较好。的花药较好。花粉母细胞的减数分裂花粉母细胞的减数分裂 (引自李扬汉引自李扬汉)14 花粉发育时期的确定花粉发育时期的确定花粉发育时期与花药大小、花蕾大小、花冠花粉发育时期与花药大小、花蕾大小、花冠展开程度之间的关

11、系，判断花粉发育时期。（环境条件）展开程度之间的关系，判断花粉发育时期。（环境条件） 如如: :柑橘花冠露白时，大多数花药处于单核晚期；柑橘花冠露白时，大多数花药处于单核晚期； 马铃薯花冠露出萼片一半时，大多数花药处于单核晚期；马铃薯花冠露出萼片一半时，大多数花药处于单核晚期； 烟草则在花冠露出烟草则在花冠露出1/3-1/21/3-1/2时为花药的最佳培养时期。时为花药的最佳培养时期。 152）材料预处理和灭菌）材料预处理和灭菌- 材料预处理：材料预处理：不同的植物种类、品种和生理状态所要求的预处理不同。不同的植物种类、品种和生理状态所要求的预处理不同。 预处理方式：高温、低温、离心、预培养预

12、处理方式：高温、低温、离心、预培养 预处理的目的：从形态上改变其极性分布，从生理生化上改变其细胞生理状态，预处理的目的：从形态上改变其极性分布，从生理生化上改变其细胞生理状态，以改变其分列方式和发育途径。以改变其分列方式和发育途径。- 合适的灭菌方法：合适的灭菌方法：经过经过预处理的材料多采用预处理的材料多采用70乙醇浸泡花蕾或幼穗乙醇浸泡花蕾或幼穗1 min，然后在饱和漂白粉溶液中浸泡然后在饱和漂白粉溶液中浸泡10-15 min，无菌水冲洗，无菌水冲洗3-5次即可。次即可。163）接种）接种 操作操作：在超净工作台上剥取花药，避免：在超净工作台上剥取花药，避免损伤花药损伤花药，以免刺激花药壁

13、形成愈伤，以免刺激花药壁形成愈伤组织。应尽量减少花药在空气中暴露的时间。组织。应尽量减少花药在空气中暴露的时间。 接种密度接种密度：由培养方式而定。：由培养方式而定。 固体培养固体培养: 三角瓶三角瓶(50-100 ml)接种接种10-20个，培养皿个，培养皿(9 cm)接种接种20-40个；个； 液体培养液体培养: 每每10 ml液体培养基接种液体培养基接种50个左右。个左右。 培养基的选择培养基的选择：随植物种类不同而不同。：随植物种类不同而不同。 MS、Nitsch、N6茄属植物；茄属植物； B5芸苔属及豆科植物；芸苔属及豆科植物； B5、N6禾谷类植物。禾谷类植物。17 4）培养与植株

14、再生）培养与植株再生 培养条件培养条件：一般在：一般在25-28 、光照、光照1000-2000 Lx、光周期、光周期14 h的的条件下条件下进行培养。行培养。 植株再生植株再生：有两条途径，一是花粉：有两条途径，一是花粉诱导形成胚状体，二是花粉愈形成胚状体，二是花粉愈伤组织途径。途径。 培养培养3-8周后，可形成肉眼可周后，可形成肉眼可见的愈的愈伤，当愈，当愈伤长到到2-3 mm时，转移到分化培养基中，移到分化培养基中，约10-20 d即可出即可出现芽的分化。芽的分化。185) 生根与移栽生根与移栽 当花粉植株长到当花粉植株长到3-5 cm高时，转移至壮苗培养基上，促进根系高时，转移至壮苗培

15、养基上，促进根系的发育与壮苗。的发育与壮苗。 双子叶植物可转移至附加双子叶植物可转移至附加0.1-0.5 mg/L IBA的的MS培养基，而禾培养基，而禾谷类可转移到谷类可转移到N6培养基上，可形成大量不定根。培养基上，可形成大量不定根。193 3、花粉培养程序、花粉培养程序取材时期的确定取材时期的确定及预处理及预处理花粉的分离花粉的分离花粉培养方法花粉培养方法材料的灭菌材料的灭菌201 1）取材时期的确定及预处理取材时期的确定及预处理取材时期的确定取材时期的确定: 较花药培养的取材时期更早，大多在花粉处于较花药培养的取材时期更早，大多在花粉处于四四分体分体到到单核早期单核早期。 通过镜检观察

16、花粉的发育时期，根据发育时期与花蕾大小、外通过镜检观察花粉的发育时期，根据发育时期与花蕾大小、外观形态和颜色等指标的相关关系，选择适宜时期的花蕾。观形态和颜色等指标的相关关系，选择适宜时期的花蕾。21预处理预处理: 预处理可以提高获得再生植株的频率，可采用预处理可以提高获得再生植株的频率，可采用低温低温、高温高温或或预培养预培养等方式。一般低温处理是在等方式。一般低温处理是在3-5处理处理3-10天，高温处理天，高温处理则在则在35处理处理1-3天。为避免花蕾失水，可将花蕾置于装有浸湿滤天。为避免花蕾失水，可将花蕾置于装有浸湿滤纸的培养皿中，完成温度预处理。纸的培养皿中，完成温度预处理。222

17、）花粉的分离）花粉的分离 花药有药壁花药有药壁(2n)、药隔、药隔(2n)、花粉、花粉(n)等，因此，再生植株有可能来自药壁等，因此，再生植株有可能来自药壁(2n)、药隔、药隔(2n)、或起源于多个花粉、或起源于多个花粉(n)的嵌合体。如果采用游离花粉粒进行培的嵌合体。如果采用游离花粉粒进行培养，则再生植株一般为同质体。养，则再生植株一般为同质体。花粉分离的方法：花粉分离的方法：挤压法、自然释放法和器械法。挤压法、自然释放法和器械法。 花粉粒花粉粒(n) 药隔组织药隔组织(2n) 药壁药壁(2n) 花丝花丝(2n)23过滤（孔径比花粉直径大过滤（孔径比花粉直径大10 m）加入液体培养基悬浮，加

18、入液体培养基悬浮，100-1000 r/m离心离心1-5 min，弃上清。重复，弃上清。重复2-3次次计数确定接种密度，计数确定接种密度，104-105个个/mL将花药置于液体培养中或与培养基等渗的蔗糖溶液中，将花药置于液体培养中或与培养基等渗的蔗糖溶液中，用玻璃棒或注射器内管挤压花药，使其散出花粉用玻璃棒或注射器内管挤压花药，使其散出花粉特点：简单易行，但可能对花粉有一定的损伤。特点：简单易行，但可能对花粉有一定的损伤。 （1）挤压法挤压法24（2）自然释放法自然释放法 将花药接种于液体培养基中，将花药接种于液体培养基中，1-7 d后待花药自然开裂，释放出花粉。后待花药自然开裂，释放出花粉。

19、 特点：对花粉无损伤，但分离出花粉数量相对较少。特点：对花粉无损伤，但分离出花粉数量相对较少。（3）器械法器械法 将花药接种于液体培养基中，放入磁棒，在磁力搅拌器上，低速转至花将花药接种于液体培养基中，放入磁棒，在磁力搅拌器上，低速转至花药呈透明状。药呈透明状。 特点：分离较彻底，但对花粉有不同程度的机械损伤。特点：分离较彻底，但对花粉有不同程度的机械损伤。253 3）花粉培养方法花粉培养方法 看护培养、悬浮培养（微室培养）、液体浅层培养、双层培养看护培养、悬浮培养（微室培养）、液体浅层培养、双层培养（1）看护培养）看护培养26（2）微室培养）微室培养27（3）液体浅层培养与双层培养）液体浅层

20、培养与双层培养284 4、花药和花粉培养中雄核发育的途径及影响因素花药和花粉培养中雄核发育的途径及影响因素正正常常条条件件下下营养核营养核生殖核生殖核营养细胞萌发形成花粉管进行正常的受精营养细胞萌发形成花粉管进行正常的受精29花药、花粉培养中，花粉的发育可能出现的花药、花粉培养中，花粉的发育可能出现的5 5种情况：种情况： 败育败育变成肥大花粉变成肥大花粉花粉发芽花粉发芽经愈伤组织形成不定芽经愈伤组织形成不定芽直接分化产生胚状体直接分化产生胚状体30败育败育变成肥大花粉变成肥大花粉花粉发芽花粉发芽经愈伤组织形成不定芽经愈伤组织形成不定芽直接分化产生胚状体直接分化产生胚状体离体条件下花粉的发育形

21、态离体条件下花粉的发育形态312 2）影响）影响雄核发育的因素雄核发育的因素 （1 1）供体植株的基因型）供体植株的基因型 基因型基因型是影响花药和花粉培养形成单倍体最重要的因素之一。是影响花药和花粉培养形成单倍体最重要的因素之一。不同植物属间、种间或品种间均存在很大的差异。不同植物属间、种间或品种间均存在很大的差异。 茄科、十字花科作物花药和花粉培养较易培养成功。茄科、十字花科作物花药和花粉培养较易培养成功。 水稻中粳稻比籼稻容易培养，粳稻的花药愈伤诱导率平均可达水稻中粳稻比籼稻容易培养，粳稻的花药愈伤诱导率平均可达1010，而籼而籼稻只有稻只有1-21-2； 在在3131个大豆栽培种中，所

22、有的基因型都产生了愈伤组织，但诱导率的变异个大豆栽培种中，所有的基因型都产生了愈伤组织，但诱导率的变异范围为范围为2.2-36.62.2-36.632（2 2）供体植株的生理状态）供体植株的生理状态 供体植株的生理状态对花药培养效率有直接的影响（初花期至盛花期较好；供体植株的生理状态对花药培养效率有直接的影响（初花期至盛花期较好；花序年龄等）。特别是供体植株所处的环境条件会影响到花药对离体培养的反应，花序年龄等）。特别是供体植株所处的环境条件会影响到花药对离体培养的反应，这些环境因子有这些环境因子有光照强度、光周期、温度、营养条件光照强度、光周期、温度、营养条件等。等。 33（3 3）花粉发育

23、的时期）花粉发育的时期 选择合适的花粉发育时期是培养成功的关键因素之一。不同基因型，选择合适的花粉发育时期是培养成功的关键因素之一。不同基因型，最适宜培养的花粉发育时期有差别，总体上看，以单核早期到单核晚期较为最适宜培养的花粉发育时期有差别，总体上看，以单核早期到单核晚期较为适宜。适宜。 烟草花粉发育时期与胚状体诱导频率烟草花粉发育时期与胚状体诱导频率 花粉发育时期花粉发育时期 胚状体诱导频率胚状体诱导频率 减数分裂期减数分裂期 0 0 单核早期单核早期 1414 单核晚期单核晚期 4040 双核早期双核早期 5 5.5 5 34（4 4）预处理）预处理 将花粉或花药从植株上取下来直接培养，往

24、往诱导率很低。而采用低温、高将花粉或花药从植株上取下来直接培养，往往诱导率很低。而采用低温、高温、离心等预处理，则可以促进花粉细胞的启动，显著提高再生频率。温、离心等预处理，则可以促进花粉细胞的启动，显著提高再生频率。A.A.低温低温处理：一般将欲接种的材料置于处理：一般将欲接种的材料置于0-100-10的条件下处理的条件下处理3-10 d3-10 d。 低温预处理的作用机理：低温预处理的作用机理：a.a.引引起起花花药药花花粉粉中中内内源源激激素素发发生生变变化化，改改变变了了小小孢孢子子（花花粉粉粒粒）第第一一次次有有丝丝分分裂裂的的正正常常发发育育过过程程（正正常常发发育育时时，两两次次

25、有有丝丝分分裂裂形形成成三三核核花花粉粉粒粒），进进而而形成愈伤组织或胚状体。形成愈伤组织或胚状体。 b.b.提高了小孢子的生活力，延缓衰老速度，从而提高诱导率。提高了小孢子的生活力，延缓衰老速度，从而提高诱导率。 c.c.引引起起小小孢孢子子的的孤孤立立化化，即即小小孢孢子子从从花花药药中中分分离离出出来来。因因为为在在低低温温处处理理过过程程中，花药内薄壁细胞和绒毡层逐渐退化，从而切断了与小孢子之间的联系。中，花药内薄壁细胞和绒毡层逐渐退化，从而切断了与小孢子之间的联系。35B. 热处理：通常在热处理：通常在30-35 处理处理1-3 d。芸苔属中的某些植物，将。芸苔属中的某些植物，将花芽

26、或完整植株在花芽或完整植株在30下处理下处理24 h或或40 下处理下处理1 h，能够刺激花，能够刺激花粉胚胎的发生。马铃薯中也有类似的情况。粉胚胎的发生。马铃薯中也有类似的情况。36（5 5）培养条件）培养条件培养基成份和环境条件培养基成份和环境条件 培养基成份培养基成份 无机盐：特别是硝态氮和氨态氮的浓度和比值，是影响花药培养形成愈伤组无机盐：特别是硝态氮和氨态氮的浓度和比值，是影响花药培养形成愈伤组织的重要因素；如织的重要因素；如N N6 6培养基培养基( (高硝态氮高硝态氮) )。 碳源：蔗糖是较好的碳源，还起着调节渗透压的重要作用。不同的作物要求碳源：蔗糖是较好的碳源，还起着调节渗透

27、压的重要作用。不同的作物要求的蔗糖浓度不同，早期通常使用的蔗糖浓度不同，早期通常使用5-105-10。高浓度（高浓度（6-126-12）对禾谷类作物有利，）对禾谷类作物有利，十字花科芸薹属作物要求十字花科芸薹属作物要求13-13-16。 培养基形态：一般液体培养好于固体培养。培养基形态：一般液体培养好于固体培养。37激素：在花药的诱导培养期间，需要有较适宜的细胞分裂素和生长激素：在花药的诱导培养期间，需要有较适宜的细胞分裂素和生长素配比，从而有效地诱导细胞启动分裂。素配比，从而有效地诱导细胞启动分裂。但同时又要控制二倍体细但同时又要控制二倍体细胞的分裂（胞的分裂（要求较高浓度的激素要求较高浓度

28、的激素）。 激素种类及浓度对花药花粉培养起着决定作用，并且因植物不激素种类及浓度对花药花粉培养起着决定作用，并且因植物不同而不同。同而不同。 生长素类，生长素类，2,4-D最常用。最常用。2,4-D浓度较高时，诱导胚胎发生；浓度较高时，诱导胚胎发生；浓度较低时，诱导器官形成。浓度较低时，诱导器官形成。 除除2,4-D外，外，IAA、NAA也能诱导胚胎发生和器官形成。也能诱导胚胎发生和器官形成。 细胞分裂素类中，细胞分裂素类中，KT、BA比较常用。比较常用。38 活性炭：有利于花粉胚状体或愈伤组织的发生，从而提高花粉植物的诱导。活性炭：有利于花粉胚状体或愈伤组织的发生，从而提高花粉植物的诱导。在

29、烟草、马铃薯、玉米、小麦的花药培养中，加入在烟草、马铃薯、玉米、小麦的花药培养中，加入0.5-1.00.5-1.0的活性炭可以有效的活性炭可以有效提高花粉植株的数量。提高花粉植株的数量。环境条件环境条件 温度：对温度较为敏感。大多数植物而言，温度：对温度较为敏感。大多数植物而言，25-2825-28的温度下进行花药和花粉的温度下进行花药和花粉培养是适宜的。早期短时间的高温培养能提高某些植物胚和愈伤诱导率。培养是适宜的。早期短时间的高温培养能提高某些植物胚和愈伤诱导率。 光照：分阶段进行调控。如禾谷类作物，在愈伤诱导阶段以暗培养或弱光光照：分阶段进行调控。如禾谷类作物，在愈伤诱导阶段以暗培养或弱

30、光培养效果好，而分化培养阶段，光照则有利于绿苗的分化。培养效果好，而分化培养阶段，光照则有利于绿苗的分化。 培养密度：芸薹属和番茄培养密度：芸薹属和番茄1-101-10万粒万粒/ml/ml，苹果，苹果1-31-3万粒万粒/ml/ml。39(6) (6) 药壁因子药壁因子 小孢子的启动发育对药壁组织有相当大的依赖性。经许多试小孢子的启动发育对药壁组织有相当大的依赖性。经许多试验已证实，花药壁组织对诱导愈伤和胚状体的形成，甚至绿苗的验已证实，花药壁组织对诱导愈伤和胚状体的形成，甚至绿苗的分化起着重要作用（分化起着重要作用（看护培养看护培养） 。药壁的作用：药壁的作用：A.A.药壁组织组织可以向花粉

31、提供必要的营养物质药壁组织组织可以向花粉提供必要的营养物质B.B.通过药壁组织吸收、贮存和转化培养基中的外源物质，通过药壁组织吸收、贮存和转化培养基中的外源物质，药壁起着花粉代谢药壁起着花粉代谢库的作用。库的作用。405 5、单倍体形成的途径、单倍体形成的途径 不管发育初期花粉细胞通过何种途径发育，其结果均是形成一个细胞团，随后不管发育初期花粉细胞通过何种途径发育，其结果均是形成一个细胞团，随后这个细胞团撑破花药壁再继续发育，细胞团继续发育的方式决定了单倍体植株的这个细胞团撑破花药壁再继续发育，细胞团继续发育的方式决定了单倍体植株的形成途径。形成途径。 1) 1) 通过胚状体的途径形成单倍体植

32、株通过胚状体的途径形成单倍体植株 即细胞团从花药壁中释放出来之后，按照合子胚的途径发育，经过球形胚、即细胞团从花药壁中释放出来之后，按照合子胚的途径发育，经过球形胚、心形胚、鱼雷形胚和子叶形胚的发育过程。心形胚、鱼雷形胚和子叶形胚的发育过程。 一个花粉粒只形成一个胚状体，一个胚状体萌发出一个植株。一个花粉粒只形成一个胚状体，一个胚状体萌发出一个植株。 412）通过愈伤组织形成单倍体植株）通过愈伤组织形成单倍体植株 细胞团保持无序的分裂状态，就会形成多细胞的愈伤组织，愈伤再经细胞团保持无序的分裂状态，就会形成多细胞的愈伤组织，愈伤再经过分化形成完整的植株。过分化形成完整的植株。 通过愈伤得到植株

33、的倍性常不只是单倍体，也有二倍体，有时还有多通过愈伤得到植株的倍性常不只是单倍体，也有二倍体，有时还有多倍体、混倍体等。倍体、混倍体等。 形成原因：二倍体组织由单个花粉粒形成的细胞团发生融合。形成原因：二倍体组织由单个花粉粒形成的细胞团发生融合。42花药培养再生植株形成的途径花药培养再生植株形成的途径4344花粉与花药的培养花粉与花药的培养456、花药及花粉植物的倍性及染色体加倍、花药及花粉植物的倍性及染色体加倍 花粉植株的倍性复杂多变，影响因素也多。花粉植株的倍性复杂多变，影响因素也多。 通过花药、花粉培养获得的植株，常常有单倍体、二倍体、三通过花药、花粉培养获得的植株，常常有单倍体、二倍体

34、、三倍体、四倍体和非整倍体。倍体、四倍体和非整倍体。 再生植株的倍性鉴定再生植株的倍性鉴定:可用镜检检查根尖可用镜检检查根尖染色体数目染色体数目，或，或根据根据气孔周围保卫细胞的大小气孔周围保卫细胞的大小以及以及细胞中叶绿体数目细胞中叶绿体数目来初步鉴别。来初步鉴别。46染色体的加倍：染色体的加倍： 秋水仙素处理秋水仙素处理(0.02-0.4)：浸泡、涂抹或滴液法浸泡、涂抹或滴液法 ；处理部位处理部位因植物种类不同而不同，如双子叶植物多处理生长点、顶芽、腋芽因植物种类不同而不同，如双子叶植物多处理生长点、顶芽、腋芽等部位。等部位。用秋水仙素处理，可在培养阶段处理，也可在移栽后处理：用秋水仙素处

35、理，可在培养阶段处理，也可在移栽后处理： 培养阶段处理，在培养基中加入培养阶段处理，在培养基中加入50-250 mg/L秋水仙素。秋水仙素。 移栽后处理，用移栽后处理，用0.2%秋水仙素涂抹或浸泡生长点秋水仙素涂抹或浸泡生长点1-3天，或每日傍晚在生长点天，或每日傍晚在生长点处点滴数滴，连续进行处点滴数滴，连续进行5-6天。天。二甲基亚砜二甲基亚砜(DMSO)( 1-2 )：禾本科则多用含有禾本科则多用含有1-2DMSO的秋的秋水仙素浸泡分蘖节。水仙素浸泡分蘖节。47水稻单倍体植株的培育及加倍水稻单倍体植株的培育及加倍48愈伤组织加倍法：将单倍体的叶、茎、叶柄、和根等器官切成小块愈伤组织加倍法

36、：将单倍体的叶、茎、叶柄、和根等器官切成小块后置于合适的培养基上，诱导形成愈伤组织，经分化培养之后，能后置于合适的培养基上，诱导形成愈伤组织，经分化培养之后，能得到一定数量染色体加倍的植株。得到一定数量染色体加倍的植株。49花粉培养过程（油菜）花粉培养过程（油菜）50花粉培养及发育过程51白白菜菜花花粉粉分分化化不不定定芽芽52第二节第二节 植物胚胎培养植物胚胎培养 胚培养胚培养 胚乳培养胚乳培养 胚珠胚珠 子房培养子房培养535455一、胚胎培养一、胚胎培养 我们知道，植物的胚胎是从精卵结合形成合子开始的，合子经我们知道，植物的胚胎是从精卵结合形成合子开始的，合子经过分裂形成胚柄和胚体，胚体

37、进一步分裂和分化，逐渐形成具有一过分裂形成胚柄和胚体，胚体进一步分裂和分化，逐渐形成具有一定形态结构的胚。当种子发芽时，胚就长成植株。定形态结构的胚。当种子发芽时，胚就长成植株。 第二节第二节 植物胚胎培养植物胚胎培养胚胚的的发发育育种种子子的的结结构构56胚胎培养胚胎培养是指采用人工方法把植是指采用人工方法把植物的胚胎与母体分离，放在无物的胚胎与母体分离，放在无菌培养基上，让其继续生长发育，菌培养基上，让其继续生长发育，一直到形成完整植株的过程。包一直到形成完整植株的过程。包括幼胚培养、成熟胚培养、胚乳括幼胚培养、成熟胚培养、胚乳培养、胚珠培养以及子房培养。培养、胚珠培养以及子房培养。57

38、克服远缘杂种的不育性；克服远缘杂种的不育性； 使胚胎发育不完全的植株获得后代；使胚胎发育不完全的植株获得后代； 打破种子的休眠状态，缩短育种年限，提高育种效率；打破种子的休眠状态，缩短育种年限，提高育种效率； 克服种子生活力低下和自然不育等，对于植物界物种克服种子生活力低下和自然不育等，对于植物界物种的进化具有重要意义。的进化具有重要意义。二、胚胎培养的意义：二、胚胎培养的意义：58三、胚胎培养的类型三、胚胎培养的类型 胚胎培养的对象，可以是胚胎发育过程中不同阶段的胚体。根据胚胎发胚胎培养的对象，可以是胚胎发育过程中不同阶段的胚体。根据胚胎发育对营养的要求，可分为两个阶段：育对营养的要求，可分

39、为两个阶段： 异养期异养期，处于这一时期的幼小胚胎完全依赖周围组织提供的营养物质。，处于这一时期的幼小胚胎完全依赖周围组织提供的营养物质。 自养期自养期，在此时期，胚胎能吸收培养基中的营养物质，经过自身的代谢作用，在此时期，胚胎能吸收培养基中的营养物质，经过自身的代谢作用合成其生长所必需的物质。合成其生长所必需的物质。59v培养基培养基:v培养条件：培养条件：糖类、附加成分、糖类、附加成分、光照、光照、v培养方式：培养方式： A. A. 幼胚培养适于液体培养，幼胚培养适于液体培养， B. B. 成熟胚适于固体培养成熟胚适于固体培养 胚胎培养的基本技术胚胎培养的基本技术601、胚培养、胚培养胚培

40、养可以分为两大类型：胚培养可以分为两大类型：成熟胚培成熟胚培养养和幼胚培养和幼胚培养胚培养：胚培养：采用人工的方法将胚从种子、子房或胚珠中分离采用人工的方法将胚从种子、子房或胚珠中分离出来，再放在无菌的条件下，让其进一步生长发育，以出来，再放在无菌的条件下，让其进一步生长发育，以至形成幼苗的过程。至形成幼苗的过程。611）胚培养的意义）胚培养的意义(1)(1)在远缘杂交育种中在远缘杂交育种中: :克服杂种胚不能正常发育；克服杂种胚不能正常发育；(2)(2)克服珠心胚的干扰克服珠心胚的干扰, ,提高育种效率；提高育种效率；(3)(3)缩短育种周期；缩短育种周期；(4)(4)测定休眠种子的萌发率；

41、测定休眠种子的萌发率；(5)(5)用于快速繁殖：幼胚具有较高再生能力，可通过体细胞胚胎用于快速繁殖：幼胚具有较高再生能力，可通过体细胞胚胎发生的途径产生大量的体细胞胚；发生的途径产生大量的体细胞胚；(6)(6)利用幼胚培养诱发变异，选育新品种；利用幼胚培养诱发变异，选育新品种；(7)(7)为原生质体培养、细胞融合及遗传转化提供实验材料；为原生质体培养、细胞融合及遗传转化提供实验材料；(8)(8)理论研究中的应用。理论研究中的应用。62（1）成熟胚培养）成熟胚培养A. 成熟胚是指子叶已经成熟的种胚。培养时只需提供一定的温度和成熟胚是指子叶已经成熟的种胚。培养时只需提供一定的温度和湿度条件就可以萌

42、发并长成植株。湿度条件就可以萌发并长成植株。B. 培养方法：培养方法： 将接近成熟的果实或种子（带表皮）进行表面灭菌后，剥取种将接近成熟的果实或种子（带表皮）进行表面灭菌后，剥取种胚接种于培养基上，使裸露的胚在人工控制的条件下萌发和生长，胚接种于培养基上，使裸露的胚在人工控制的条件下萌发和生长，直接形成完整的植株。直接形成完整的植株。2）胚培养过程：）胚培养过程：63实例（玉米成熟胚培养）例（玉米成熟胚培养）a. 取玉米种子，放在取玉米种子，放在95的酒精中消毒的酒精中消毒10s，然后用蒸，然后用蒸馏水冲洗。水冲洗。检查果皮是否完整，若有水果皮是否完整，若有水进入果皮中而呈透明斑入果皮中而呈透

43、明斑块的种粒，的种粒，应丢弃。保留那些果皮完整、外貌无改弃。保留那些果皮完整、外貌无改变的种子。在无菌条件下，将的种子。在无菌条件下，将种子放入种子放入75乙醇中消毒乙醇中消毒15s，用无菌水冲洗，用无菌水冲洗3次，用次，用0.1%升汞浸升汞浸泡泡10-20分分钟，用无菌水冲洗，用无菌水冲洗3次；次；b. 把种子放置到有一把种子放置到有一张湿湿润的无菌的无菌滤纸的培养皿的培养皿 ,于于25的黑暗条的黑暗条件下培育件下培育6h,种子将吸水膨种子将吸水膨胀并并变软；64c.c.胚的剥离：取一粒种子放在无菌培养皿中，用镊子夹住，用另一胚的剥离：取一粒种子放在无菌培养皿中，用镊子夹住，用另一把镊子轻轻

44、剥去种皮，用解剖刀沿着胚胎的边缘小心切去胚乳，把镊子轻轻剥去种皮，用解剖刀沿着胚胎的边缘小心切去胚乳，暴露出位于其下方的种胚的一部分，即盾片。分离出胚胎后，用暴露出位于其下方的种胚的一部分，即盾片。分离出胚胎后，用无菌水冲洗无菌水冲洗3 3次，然后接种于次，然后接种于MSMS0.5mg/l0.5mg/l细胞分裂素培养基上；细胞分裂素培养基上；d.d.于于2525黑暗环境中培养；黑暗环境中培养；e.e.大约大约2 2天后出现胚根，天后出现胚根，3-43-4天后出现胚芽，天后出现胚芽，7-97-9天后出生根和生长，天后出生根和生长，并出现一些不定根，并出现一些不定根，1010天后即长成小苗。天后即

45、长成小苗。652) 幼胚培养幼胚培养v 幼胚培养：对胚龄处于原胚期（即多细胞原胚）、球形胚、心型幼胚培养：对胚龄处于原胚期（即多细胞原胚）、球形胚、心型胚、鱼雷型胚及早期子叶型胚的胚进行的培养。在这几个时期，幼胚、鱼雷型胚及早期子叶型胚的胚进行的培养。在这几个时期，幼胚在生理及形态上均还未发育成熟，仅仅提供温度和湿度条件并不胚在生理及形态上均还未发育成熟，仅仅提供温度和湿度条件并不能使其萌发成株。能使其萌发成株。高等植物的合子胚发育过程：高等植物的合子胚发育过程： 合子合子球状胚球状胚 心形胚心形胚 鱼雷胚鱼雷胚 子叶胚子叶胚 成熟胚（完整的成熟胚（完整的种子）种子）66671）幼胚培养过程：

46、）幼胚培养过程： 取子房取子房 常规表面消毒常规表面消毒 解剖镜下，取胚珠、去珠被、取出完整幼胚。解剖镜下，取胚珠、去珠被、取出完整幼胚。 固体培养固体培养2）幼胚的发育方式：）幼胚的发育方式： （1）胚性发育；胚性发育； （2）早熟发育；早熟发育； （3）产生愈伤组织产生愈伤组织683）幼胚培养的方法）幼胚培养的方法（1）远缘杂种的幼胚培养）远缘杂种的幼胚培养A. A. 杂交杂交B. B. 取材取材C. C. 消毒消毒D. D. 剥取幼胚及接种剥取幼胚及接种E. E. 培养培养F. F. 驯化移栽及染色体的加倍驯化移栽及染色体的加倍 69BACK远缘杂交培育杂种后代（白蓝）远缘杂交培育杂种后

47、代（白蓝）子房子房受精胚受精胚胚发育胚发育胚败育胚败育胚培养胚培养种间杂交种间杂交70A.A.杂交杂交 根据育种目标，选择亲本，人工授粉（包括：母本去雄、套根据育种目标，选择亲本，人工授粉（包括：母本去雄、套袋、授粉）袋、授粉）切断花柱后在断面进行授粉百合切断花柱后在断面进行授粉百合71B. 取材取材 在远缘杂种幼胚败育前，将其从母体取下进行培养。在远缘杂种幼胚败育前，将其从母体取下进行培养。注意注意：不同的植：不同的植物幼胚败育的时间往往不相同。物幼胚败育的时间往往不相同。C. 消毒消毒 由于幼胚包被在子房或种子内，消毒时间可以比其它组织稍长一些。由于幼胚包被在子房或种子内，消毒时间可以比其

48、它组织稍长一些。 D. 剥取幼胚及接种剥取幼胚及接种 在超净工作台内，用解剖针或解剖刀将幼胚从液体胚乳中挑出，接种在超净工作台内，用解剖针或解剖刀将幼胚从液体胚乳中挑出，接种于培养基上。如果幼胚太小，则需要在解剖镜下操作。于培养基上。如果幼胚太小，则需要在解剖镜下操作。 72E. 培养培养 如果杂种胚败育较晚，胚已经发育得比较大，则往往不进入脱分化就如果杂种胚败育较晚，胚已经发育得比较大，则往往不进入脱分化就直接发育长成幼苗。此种情况称为直接发育长成幼苗。此种情况称为“早熟萌发早熟萌发”，小苗的质量往往不佳。，小苗的质量往往不佳。 如果杂种胚败育较早，胚还相当幼小，就需要在培养基中添加各种激如

49、果杂种胚败育较早，胚还相当幼小，就需要在培养基中添加各种激素和丰富的营养物质。素和丰富的营养物质。 根据植物种类和再生途径的不同，添加的物质也有所不同。如果是通根据植物种类和再生途径的不同，添加的物质也有所不同。如果是通过胚状体发生再生植株，一般会使用过胚状体发生再生植株，一般会使用2,4-D，如果是通过不定芽再分化，如果是通过不定芽再分化，则可使用生长素和分裂素。则可使用生长素和分裂素。F. 驯化移栽与染色体加倍驯化移栽与染色体加倍 染色体加倍，如白菜染色体加倍，如白菜2n=20，甘蓝，甘蓝2n=18，二者杂交杂种为，二者杂交杂种为19，不能，不能进行正常减数分裂，必须进行染色体加倍才能产生

50、种子。进行正常减数分裂，必须进行染色体加倍才能产生种子。73应用应用 利用幼胚培养克服远缘杂种不育性已在许多植物上成功，如西红柿、茄子、辣椒、油利用幼胚培养克服远缘杂种不育性已在许多植物上成功，如西红柿、茄子、辣椒、油菜、南瓜、大豆、花生、水稻、小麦、大麦、大葱、萝卜等与其近缘野生种，白菜菜、南瓜、大豆、花生、水稻、小麦、大麦、大葱、萝卜等与其近缘野生种，白菜甘甘蓝，以及百合等花卉。蓝，以及百合等花卉。通过通过“芥菜芥菜甘蓝甘蓝”的杂种胚培养，育成了的杂种胚培养，育成了“千宝菜千宝菜1号号”和和“千宝菜千宝菜2号号”。74白蓝白蓝75梨和苹果的杂种植株梨和苹果的杂种植株76(2)(2)非远缘杂

51、交情况下的幼胚培养非远缘杂交情况下的幼胚培养 用于加快繁殖、诱导胚性愈伤组织及诱发突变等。用于加快繁殖、诱导胚性愈伤组织及诱发突变等。A. A. 取材：取材时间因植物种类不同而异，一般在开花授粉后取材：取材时间因植物种类不同而异，一般在开花授粉后12-5012-50天取幼胚。过天取幼胚。过早，幼胚太小，不容易操作；过晚，幼胚发育太大，不容易脱分化。下图示早，幼胚太小，不容易操作；过晚，幼胚发育太大，不容易脱分化。下图示白蓝作父本时白菜和甘蓝杂种胚的发育时期和胚胎大小的关系。白蓝作父本时白菜和甘蓝杂种胚的发育时期和胚胎大小的关系。7778B. 消毒、剥取幼胚及接种（方法同前）消毒、剥取幼胚及接种

52、（方法同前）C. 培养培养 幼胚培养时，一般通过诱导胚性愈伤组织或胚状体再生植株，幼胚培养时，一般通过诱导胚性愈伤组织或胚状体再生植株，因为幼胚比较容易形成胚性愈伤组织或胚状体。可用培养基因为幼胚比较容易形成胚性愈伤组织或胚状体。可用培养基MS附附加适量生长素（如加适量生长素（如2,4-D），其浓度因植物不同而不同，一般用），其浓度因植物不同而不同，一般用0.1-2.0 mg/L左右。左右。7980如果为了大量增殖，可在胚状体形成之前，将胚性愈伤如果为了大量增殖，可在胚状体形成之前，将胚性愈伤组织悬浮培养。即将胚性愈伤组织切碎，在含有同样成组织悬浮培养。即将胚性愈伤组织切碎，在含有同样成分的液

53、体培养基中振荡培养，胚性愈伤组织长大后，再分的液体培养基中振荡培养，胚性愈伤组织长大后，再切碎培养，可以达到大量增殖的目的。切碎培养，可以达到大量增殖的目的。将增殖的胚性愈伤组织转移到固体培养基上后，形成将增殖的胚性愈伤组织转移到固体培养基上后，形成体胚，再生植株。体胚，再生植株。81振荡培养振荡培养旋转培养旋转培养82胚乳培养胚乳培养是指将胚乳从母体上分离是指将胚乳从母体上分离出来，在无菌的环境条件下培养，出来，在无菌的环境条件下培养，使其生长发育形成幼苗的过程。使其生长发育形成幼苗的过程。二、二、 胚乳培养胚乳培养831、胚乳培养的意义、胚乳培养的意义1 1）胚乳培养胚乳培养可得到三倍体植

54、株，产生无籽果实。或加倍可得到三倍体植株，产生无籽果实。或加倍形成六倍体植株进行育种。形成六倍体植株进行育种。2 2）胚乳培养胚乳培养可得到倍性不同的愈伤组织，可分离和筛选可得到倍性不同的愈伤组织，可分离和筛选各种类型的非整倍体植株。各种类型的非整倍体植株。84n胚乳外植体制备胚乳外植体制备: :种子消毒种子消毒-取出胚乳取出胚乳n培养培养: :WhiteWhite或或MSMS诱导培养基诱导培养基-25-27-25-27-暗或弱光暗或弱光n发育发育: :诱导形成愈伤组织诱导形成愈伤组织-再分化形成胚状体或不定芽再分化形成胚状体或不定芽-生根培养生根培养-植株。植株。2、胚乳培养过程、胚乳培养过

55、程85胚乳培养过程胚乳培养过程胚乳胚乳胚状体胚状体发育成苗发育成苗不定芽苗不定芽苗愈伤愈伤组织组织形态发生形态发生863、胚乳植株染色体数目的检查胚乳植株染色体数目的检查v取根尖、幼叶或愈伤组织取根尖、幼叶或愈伤组织v0.2-0.5%秋水仙素碱溶液在秋水仙素碱溶液在25浸泡浸泡4-8 hv流水冲洗流水冲洗5-10 minv卡诺氏液或卡诺氏液或FAA液固定液固定v1 M盐酸，盐酸，60 水浴水浴8-10 minv染色、压片、镜检、计数染色、压片、镜检、计数874、培养基与培养条件、培养基与培养条件培养基培养基培养条件培养条件885、胚乳再生植株的染色体倍数、胚乳再生植株的染色体倍数v稳定型：稳定

56、型：三倍体三倍体v畸变型：畸变型：除少数是三倍体，多数是由多种倍性细胞组成的嵌合体除少数是三倍体，多数是由多种倍性细胞组成的嵌合体891、胚珠培养、胚珠培养胚珠培养胚珠培养是指将胚珠从母体上分离出来，是指将胚珠从母体上分离出来，在无菌的人工环境条件下培养，使其生在无菌的人工环境条件下培养，使其生长发育形成幼苗的过程。长发育形成幼苗的过程。倒生胚珠倒生胚珠三、胚珠和子房培养三、胚珠和子房培养901 1）胚珠培养的应用）胚珠培养的应用 (1)(1)受精胚珠培养目的受精胚珠培养目的： 一是打破种子的休眠；一是打破种子的休眠； 二是挽救胚的发育，以获得杂交种。二是挽救胚的发育，以获得杂交种。 (2)(

57、2)未受精胚珠培养目的未受精胚珠培养目的：获得单倍体植株。：获得单倍体植株。912) 胚珠培养类型胚珠培养类型(1) 受精胚珠的培养受精胚珠的培养(2) 未受精胚珠的培养未受精胚珠的培养示胚珠的位置示胚珠的位置92v培养基培养基：White, Nitsch, MS 胚珠的发育：胚珠的发育：A. 受精胚珠：一是形成种子；二是形成愈伤组织受精胚珠：一是形成种子；二是形成愈伤组织B. 未受精胚珠：形成单倍体植株。未受精胚珠：形成单倍体植株。 胚珠培养的基本过程：胚珠培养的基本过程：从花中取出子房从花中取出子房表面消毒表面消毒取出胚珠取出胚珠培养基上培养培养基上培养93雌蕊与子房的类型雌蕊与子房的类型

58、942、子房培养、子房培养 子房培养子房培养是指将子房从母体上分离是指将子房从母体上分离出来，在无菌的人工环境条件下培出来，在无菌的人工环境条件下培养，使其生长发育形成幼苗的过程。养，使其生长发育形成幼苗的过程。类型类型授粉子房的培养授粉子房的培养未授粉子房的培养未授粉子房的培养951)1)子房培养的意义子房培养的意义A. A. 授粉子房培养目的授粉子房培养目的：挽救杂种胚：挽救杂种胚B. B. 未授粉子房培养目的未授粉子房培养目的：获得单倍体植株。：获得单倍体植株。962）子房培养的子房培养的培养过程培养过程A. A. 制备外植体制备外植体：在开花前后适宜时期取子房或幼花，消毒在开花前后适宜

59、时期取子房或幼花，消毒B. B. 子房培养子房培养：固体或液体培养均可固体或液体培养均可3）培养基）培养基: N6, MS97p 性细胞（卵细胞、助细胞、极核、反足细胞）性细胞（卵细胞、助细胞、极核、反足细胞）-胚胚状体或愈伤组织状体或愈伤组织-单倍体植株；单倍体植株；p 体细胞（珠被、子房壁）体细胞（珠被、子房壁）-胚状体或愈伤组织胚状体或愈伤组织-二倍体植株；二倍体植株；4）培养子房的发育）培养子房的发育98植物生殖细胞工程的问题与展望植物生殖细胞工程的问题与展望v在短短的十多年中，植物生殖工程的研究无疑已取得巨在短短的十多年中，植物生殖工程的研究无疑已取得巨大成就。雄性生殖系统的再生成功

60、，胚珠再生的初步实大成就。雄性生殖系统的再生成功，胚珠再生的初步实现，为深入进行花粉和胚囊的形成和分化的离体研究奠现，为深入进行花粉和胚囊的形成和分化的离体研究奠定了基础。定了基础。 99v 植物生殖细胞工程研究所面临的问题有以下植物生殖细胞工程研究所面临的问题有以下几个方面几个方面(1) 再生整个雌性生殖系统尚未成功；再生整个雌性生殖系统尚未成功； (2) 合子至原胚的离体培养困难；合子至原胚的离体培养困难；(3) 基因型的局限；基因型的局限；(4) 植物激素的作用机制；植物激素的作用机制； (5) 活胚囊、生殖细胞、精子的大量分离和培养技术。活胚囊、生殖细胞、精子的大量分离和培养技术。 100五一快乐！五一快乐！101