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1、CRISPR/cas9基因编辑基因编辑技术及应用技术及应用 一种来源于细菌获得性免疫由RNA指导Cas蛋白对靶向基因获得性修饰的技术1. CRISPR-Cas系统简介系统简介1987 年年，日日本本课课题题组组在在K12 大大肠肠杆杆菌菌的的碱碱性性磷磷酸酸酶酶基基因因附附近近发发现现串串联联间间隔隔重重复复序序列列，随随后后发发现现其其广广泛泛存存在在于于细细菌菌和和古古细细菌菌的的基基因因组组中中，2002 年年，正正式将其命名为式将其命名为成簇的规律间隔的成簇的规律间隔的短回文短回文重复序列重复序列(CRISPR)2005 年年发发现现CRISPR 的的间间隔隔序序列列(spacer)与
2、与宿宿主主菌菌的的染染色色体体外外的的遗遗传传物物质质高高度度同同源源，推推测测细细菌菌可可能能通通过过CRISPR 系系统统可可能能以以类类似似于于真真核核生生物物的的RNAi 方方式抵抗外源遗传物质的入侵。式抵抗外源遗传物质的入侵。2013 年年初初，MIT 的的研研究究组组首首次次利利用用CRISPR/Cas9 系系统统对对人人293T 细细胞胞EMX1 和和PVALB 基因以及小鼠基因以及小鼠Nero2A 细胞细胞Th 基因实现了定点突变。基因实现了定点突变。1.2 .CRISPR/Cas9作用机理作用机理CRISPR-Cas系统的结构：系统的结构：CRISPR-CAS 系统的组成主要
3、包括: 由不连续的重复序列R( repeat) 与长度相似的间区序列S( spacers) 间隔排列而成的CRISPR 簇，前导序列L( leader) 以及一系列CRISPR 相关蛋白基因cas。CasCas蛋白是一种双链蛋白是一种双链DNADNA核酸酶，能在核酸酶，能在guide RNAguide RNA引引导下对靶位点进行切割。它与导下对靶位点进行切割。它与folkfolk酶功能类似，酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。CRISPR/cas9作用机理1.CRISPR 的高度可变的间隔区的获得首先识别入侵的核酸和扫描外源 DNA 潜在的
4、PAM（NGG序列），将临近 PAM 的序列作为候选protospacer；然后在 CRISPR 基因座的5端合成重复序列；最后新的间隔序列整合到两个重复序列之间2.CRIPSR 基因座的表达(包括转录和转录后的成熟加工)3.CRISPR/Cas 系统活性的发挥或者是对外源遗传物质的干扰2.CRISPR/cas9技术的应用技术的应用CRISPR-CasCRISPR-Cas9 9介导的基因组精确编辑技术介导的基因组精确编辑技术CRISPRs技术是一种由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术。通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将其连接在一起得到sgRNA（singleg
5、uideRNA）。融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力，但因为结构得到了简化更方便研究者使用。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作Cas9技术介导单基因细胞系敲除的实验流程（Cas9质粒建立knock-out细胞系）1、设计识别靶位点的一对DNA Oligos 选择PAM（NGG）5端的一段碱基序列20nt作为原间隔序列，即敲除的靶位点。 确定待敲除位点后，选择23-至250bp的外显子序列输入到在线免费设计sgRNA的软件Input框中，然后进行设计运算，软件会自动输出sgRNA序列。利用在线软件可以选择
6、脱靶机会小的序列作为sgRNA模板序列。 2.构建可表达sgRNA的质粒3.sgRNA活性检测4.利用Cas9质粒建立knock-out细胞系CRISPR/Cas9技术基因敲除实例流程技术基因敲除实例流程CRISPR/技术的前景及优缺点技术的前景及优缺点1CRISPR-Cas91CRISPR-Cas9技术的优势技术的优势p而且从实际应用的角度来说，CRISPRs比TALENs更容易操作，因为每一对TALENs都需要重新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要替换20个核苷酸就行。p只需合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰，Cas蛋白不具特异性。p编码sgRNA的序列不超过100bp，因此比构TALENs和ZFNs更简单方便。p较短的sgRNA序列也避免了超长、高度重复TALENs编码载体带来的并发症。2.CRISPR/Cas9技术的缺点1.脱靶效应CRISPR/技术的前景及优缺点技术的前景及优缺点3.2 CRISPR-Cas93.2 CRISPR-Cas9系统的应用前景系统的应用前景1.在基因敲除方面具有绝对的优势2.可以用于因单基因突变造成的遗传病治疗3.在家畜及农业育种方面带来新的基因编辑技术
