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1、牛肠道疾病的一种新病原鉴定牛腹泻类疾病概述牛腹泻类疾病概述临床上牛肠道疾病包括传染性疾病和非传染性疾病，病因复临床上牛肠道疾病包括传染性疾病和非传染性疾病，病因复杂，是严重制约我国养牛业发展的一个重要的因素。杂，是严重制约我国养牛业发展的一个重要的因素。由传染性因素所致的牛肠道传染病由传染性因素所致的牛肠道传染病-腹泻，其病原多样，临床腹泻，其病原多样，临床上以严重腹泻、脱水和高度死亡为特征。上以严重腹泻、脱水和高度死亡为特征。常见腹泻类疾病主要有常见腹泻类疾病主要有沙门氏菌病、大肠杆菌病、牛副结核沙门氏菌病、大肠杆菌病、牛副结核病、牛弯曲菌病病、牛弯曲菌病、球虫病、隐孢子虫病、球虫病、隐孢子
2、虫病、牛病毒性腹泻、牛牛病毒性腹泻、牛细小病毒病、牛轮状病毒病、牛冠状病毒病等细小病毒病、牛轮状病毒病、牛冠状病毒病等。牛沙门氏菌病牛沙门氏菌病流行病学：各种年龄，但幼龄更易感，以26周龄犊牛易感性最高。妊娠可流产。患病动物和带菌者是主要传染源。一年四季均可发生。呈散发或地方流行性。临床症状急性型：突然发病、高热（4041）、精神沉郁、食欲废绝、产奶量下降。不久即开始下痢，粪便呈水样，恶臭，带血或含有纤维素絮片。下痢开始后体温降至正常或略高。病程持续47天。不经治疗或治疗不当死亡率可高达75%，而经治疗后，死亡率可降至10%。病牛表现毒血症症状，脱水、消瘦。持续1014天粪便稀软，一般需2个月
3、才能完全康复。妊娠母牛感染后可发生流产。犊牛 有些犊牛在生后48小时内开始拒食、卧地，并迅速出现衰竭等症状，常于35天内死亡。但多数犊牛则于1014日龄后发病，体温升高（4041），24小时后排出灰黄色液状粪便，并混有粘液和血丝，通常于发病后57天内死亡，病死率可达50%。病期延长时，腕和跗关节可能肿大，有的还有支气管炎和肺炎等症状。牛大肠杆菌病牛大肠杆菌病流行病学：病原存在于成年牛肠道和周围环境。消化道传染，也可经脐带感染。该病多见于初生犊牛，尤其23日龄犊牛最为易感，故又成为犊牛白痢。临床症状: 潜伏期短，一般为几小时至十几小时。败血症型 产后3天内犊牛。病初体温升高至40，食欲降低或废绝
4、，随后腹泻，很快脱水，数小时至1天内因急性败血症死亡。病死率可达80以上。病程稍长者，可能并发脐炎、关节炎或肺炎，幸存者生长发育受阻。肠毒血症型 生后7天内犊牛，通常不出现明显症状突然死亡。有症状者则为典型中毒症状，如体温正常或稍高，初期兴奋不安，随后转为沉郁甚至昏迷，然后进入濒死期。死前伴有剧烈腹泻，排出白色而充满气泡的稀粪。肠炎型 710日龄犊牛，体温升高、食欲减退、喜躺卧，下痢，粪便初呈黄色粥样，随后变为水样、呈灰白色，并混有未消化的凝乳块、血液、泡沫，有酸败气味。后期病犊排粪失禁，尾和后躯染有稀粪。病程长的，可能出现肺炎或关节炎。治疗及时，一般可以治愈。如不及时治疗，常因虚脱或继发肺炎
5、而死。个别病例也会自愈，但以后发育迟缓。 牛弯曲菌性腹泻牛弯曲菌性腹泻流行病学：又名牛冬痢或黑痢，秋冬季节，出血性下痢。各品种和年龄均可发病，一般成年牛发病较重，犊牛则较轻。地方流行性。病后可获得一定的免疫力。临床症状： 潜伏期为37天，突然发病，一夜间可蔓延20%牛群，23天可波及80%牛群。病牛排出恶臭水样稀粪，常带有血液。体温、脉搏、呼吸、食欲正常。病情严重者，表现精神萎顿，食欲不振，弓背寒战，虚弱无力。病程23天，治疗及时，很少发生死亡。 牛副结核牛副结核流行病学：副结核分枝杆菌主要感染牛，特别幼年牛更易感染发病。病牛和隐性感染牛是传染源，流行特点是发展缓慢，病程长、发病率不高、病死率
6、极高，一旦在牛群中出现则很难根除。怀孕、分娩、泌乳或营养缺乏等因素可促使发病。临床症状：潜伏期长达612个月，甚至更长。有的幼年牛感染，到5岁时才表现临床症状。病初往往无明显症状，以后症状逐渐明显，出现间歇性腹泻，逐渐变为经常性的顽固腹泻。粪便稀薄，恶臭，可带有气泡、粘液和血液凝块。早期食欲、精神都还正常，以后食欲减退，逐渐消瘦，眼窝下陷，经常躺卧，不愿走动。皮肤粗糙，被毛粗乱，下颌及垂皮水肿。体温常无明显变化。如给予多汁饲料可加重腹泻症状。如腹泻不止，一般经34个月，最后因腹泻衰竭而死。患病牛群因本病的死亡率可达10%。 牛球虫病牛球虫病流行病学：各品种，2岁以内犊牛发病率较高，死亡率20%
7、40%，而成年牛常呈隐性感染。一般多发生在4-9月份。潮湿多沼泽草场放牧牛群很易感染。冬季舍饲期间亦可能发病，主要由于饲料、垫草、母牛乳房被粪污染，使犊牛感染。牛群拥挤和圈舍卫生条件差时会增加发病机会。不同地区，不同牛群的球虫感染率及发病率不同。临床症状：多见于2岁内犊牛，多急性，但也有慢性。急性病期，通常为1015天，个别12天死亡。病初表现为精神沉郁，被毛松乱，粪便稀薄稍带血液且具恶臭味。一周后，症状加剧，食欲废绝，消瘦，精神萎靡，喜躺卧，体温上升到4042，瘤胃蠕动和反刍停止，排出带血的稀粪，其中混有纤维素性假膜，恶臭。病末期粪便呈黑色，几乎全是血液，体温下降，在恶病质状态下死亡。慢性病
8、例，病程长达数月，主要表现下痢和贫血，如不及时治疗，亦可发生死亡。牛隐孢子虫病牛隐孢子虫病流行病学：粪-口途径感染，宿主范围广泛；发病率很高但死亡率差别很大。100日龄以内幼畜尤其430日龄犊牛最易感染。国外报道犊牛(4-17日龄左右)发病率达50%以上，国内在北京、湖南、河南等省市调查的感染率为5.3%-40%，牛病程214天，死亡率16%40%。临床症状：食欲下降、腹泻、脱水是本病的主要特征。若单独感染腹泻可持续7天以上，继发感染或者混合感染则会出现脱水、酸碱失衡、腹泻等。犊牛感染最为严重，主要表现精神沉郁，厌食，腹泻，粪便带血和含大量纤维素；发育迟缓，进行性消瘦和减重甚至死亡。其中鼠隐孢
9、子虫可引起中等程度的腹泻，小隐孢子虫可引起水样腹泻。牛轮状病毒病牛轮状病毒病流行病学：17日龄内新生犊牛。患病动物和隐性感染者是主要传染源。污染的饲料、饮水、垫草及土壤等媒介经口传播。多发生在晚秋、冬季和早春。寒冷、潮湿、不良卫生条件、劣质饲料和其他疾病的等均对该病严重程度和病死率影响很大。临床症状：最早病例见于生后12小时，最迟也在数周以内终止。人工感染潜伏期是1824 小时。症状以突然腹泻开始，病犊精神萎顿，体温正常或略有升高。若体温降至常温以下则是死亡的征兆。厌食和腹泻，粪便黄白色液状，有时带有粘液和血液。腹泻时间延长，则脱水明显。病死率可达1050%，死亡的原因多是急性脱水或酸中毒。病
10、程18天。若继发感染大肠杆菌则预后不良，致死率增高。牛病毒性腹泻牛病毒性腹泻-黏膜病黏膜病流行病学：各种年龄都易感、以幼龄牛易感性最高。病牛分泌物、排泄物、血液和脾脏等都含有病毒，主要传播途径是消化道和呼吸道，也可经胎盘垂直传播。以冬春季节多发。新疫区急性病例多，病死率可达90%100%，老疫区急性病例少，但隐性感染高达50%以上。临床症状：潜伏期714天。临床上牛群多数表现为隐性感染，但小牛症状严重。急性型 常见于幼犊，死亡率很高，腹泻是特征性症状，可持续13周。稀粪呈水样初期淡黄色，后期常伴有肠粘膜和血液，水样、恶臭，有大量粘液和气泡。体温升高达4042，流鼻汁、咳嗽、呼吸急促、流泪、流涎
11、、精神萎顿等，以后口腔粘膜发生糜烂或溃疡持续47天，同时白血球减少。慢性型 出现间歇性腹泻，病程较长，一般25个月，病牛被毛粗乱、消瘦，生长发育受阻，有的出现跛行。妊娠母牛常发生流产，或产下有先天性缺陷犊牛。最常见的缺陷是小脑发育不全。患犊表现轻度的共济失调、完全不协调或不能站立。有些患牛失明。 牛冠状病毒病牛冠状病毒病流行病学：多见于19日龄乳用犊牛，肠炎严重程度与犊牛日龄、免疫状况、病毒毒株和感染剂量有关。常呈地方流行性，发病牛场常在几年内连续发生。消化道和呼吸道是主要传播途径。饲养管理差、寒冷、潮湿可促使本病发生。临床症状：潜伏期短，约为1d左右犊牛腹泻主要见于710日龄，吃过初乳或未吃
12、过初乳的犊牛均可发病，前者病情较轻。病初，患犊精神沉郁，吃奶减少或停止，排淡黄色的水样粪便、内含凝乳块和黏液，严重的可出现发热、脱水和血液浓缩。腹泻持续36d，大部分犊牛可康复，如腹泻严重、治疗不适当可能死亡。若继发细菌感染，死亡率可超过50。成年奶牛可发生血痢，特征为突然发病，表现腹泻，便如黑血样，产奶量急剧下降，同时出现流鼻涕、咳嗽、精神沉郁和食欲不振，发病率可达50100，但死亡率很低。牛肠道病毒感染流行病学：牛肠病毒广泛存在自然界，主要流行肠病毒1型和2型。BEV-1宿主范围包括人、马、狗、牛、猪、兔、禽类、鹿、非洲羚羊、水牛、绵羊和山羊；BEV-2的宿主只有家养牛。在国外牛群中，牛肠
13、病毒阳性率高达到17.6-80%。初生犊牛因饮用初乳导致抗体阳性率非常高。主要经过粪口途径传播。病毒在宿主的消化道中复制增殖。病毒对酸性环境耐受的特性使得病毒能在消化道中长期存活。感染动物粪便中存在相当高的滴度（105-1011/g）的病毒粒子。临床症状：一般为隐性感染，下痢、肺炎、呼吸道症状和乳房炎较为常见。此外，繁殖障碍表现明显，如子宫内膜炎、不孕、流产和死胎。但大多数情况下，BEV一般为无症状感染，不会导致患畜健康严重受损。试验感染时，动物表现为轻度下痢和轻微呼吸道症状。下痢表现为水样腹泻，有泡沫，少数严重的还有鲜血。体温变化不明显，食欲下降，基本没有死亡，但产奶量大幅下降。约两周后康复
14、，康复后大多数奶牛的产奶量不能恢复到病前的水平。牛肠病毒（Bovine Enterovirus）为小RNA病毒科成员。无囊膜，直径为27-30nm。复制部位在胞浆，往往可见晶格样排列的病毒颗粒。被黏膜或粪便包裹的病毒在通常的环境下对热稳定。对pH3及高盐环境耐受，对消毒剂不敏感。近年来北京部分牛场的产奶牛普遍（约80%）出现严重腹泻症状：水样腹泻，有泡沫，少数（10-15%）严重病牛粪便含有鲜血，体温变化不明显，食欲下降，基本没有死亡，但产奶量大幅下降（约30%）。病程两周左右，康复后大多数奶牛产奶量难以恢复到病前水平，特别是高产奶牛。据回顾性调查，该病两年发生一次。发病牛场采样分离到了一种牛
15、肠道病毒。目的意义目的意义本研究通过从临床上严重腹泻、血性下痢病牛直肠拭子中分离的一株牛肠道病毒2型分离株鉴定过程，介绍一种基于随机PCR 的未知病毒鉴定方法，为后期未知病原体分离鉴定奠定基础，同时也为牛肠病毒2型感染的诊断和控制提供了科学依据。病料采集和病毒分离采集病牛直肠拭子，按常规方法处理备用。培养MDBK细胞，待细胞单层生长至80%以上时，将处理后的病料接种到MDBK，37作用1h，弃病毒液，加含1%FBS的DMEM，于5%CO2培养箱培养观察记录细胞状况，当出现细胞病变（CPE）时收获病毒液，并连传3代制备毒种。正常细胞形态及感染后不同时间点的细胞病变正常细胞形态及感染后不同时间点的
16、细胞病变正正常常细细胞胞16h36h8h病毒分离结果病毒分离结果4001、蚀斑纯化和病毒增殖蚀斑纯化和病毒增殖利用利用MDBK细胞，按照蚀斑纯化常规方法，将分离物进行纯化。细胞，按照蚀斑纯化常规方法，将分离物进行纯化。将经过三次纯化的未知病毒再次接种细胞单层，将经过三次纯化的未知病毒再次接种细胞单层，37作用作用1h，弃病，弃病毒液，加含毒液，加含1%FBS的的DMEM，于，于5%CO2培养箱培养观察记录细胞病培养箱培养观察记录细胞病变（变（CPE）。至）。至CPE出现出现90%左右，收获病毒液。连续传毒左右，收获病毒液。连续传毒3代后大代后大规模增殖病毒。规模增殖病毒。2、牛肾细胞（、牛肾细
17、胞（MDBK）TCID50测定测定在在96孔细胞培养板上培养孔细胞培养板上培养BK细胞至单层后，吸弃培养液，分别接细胞至单层后，吸弃培养液，分别接种增殖后的原液细胞毒和种增殖后的原液细胞毒和10-110-7稀释病毒液，病毒稀释液为基础培稀释病毒液，病毒稀释液为基础培养基。对照组用基础培养基代替病毒液。每孔养基。对照组用基础培养基代替病毒液。每孔100l，每组，每组10孔，于孔，于CO2培养箱孵育培养箱孵育1h。吸弃接种液，每孔加。吸弃接种液，每孔加125lDMEM维持液，于维持液，于CO2培养箱培养培养箱培养3d，观察细胞病变情况。，观察细胞病变情况。 1、病毒浓缩在收集到的病毒上清中加入在收
18、集到的病毒上清中加入5的的PEG6000，4搅拌过夜（约搅拌过夜（约18h）。）。410000rpm离心离心1.5h，弃上清。沉淀用，弃上清。沉淀用TNMC缓冲液（缓冲液（50mMTris-HCl，pH7.5，100mMNaCl，10mMCaCl2，1mMMgCl2）悬浮，于）悬浮，于450000rpm离心离心1h，弃上清。沉淀用，弃上清。沉淀用TNMC缓冲液重新悬浮，使其终体积为缓冲液重新悬浮，使其终体积为浓缩前的浓缩前的1%。 2、病毒提纯在在25下将下将CsCl配制成配制成10%、20%、30%、40%、50%、60%密度梯度密度梯度的匀浆液，用注射器小心吸取浓度最小的溶液加入离心管底，
19、然后将注射器的匀浆液，用注射器小心吸取浓度最小的溶液加入离心管底，然后将注射器针头插入离心管底部依次加入较高的各个浓度（针头插入离心管底部依次加入较高的各个浓度（10%-60%），每个浓度），每个浓度500l。在离心管顶部加入。在离心管顶部加入1ml病毒液。水平转头病毒液。水平转头450000rpm，离心，离心24h。收。收集离心后形成的各区带，用集离心后形成的各区带，用TNMC缓冲液稀释缓冲液稀释10或或15倍，倍，450000rpm离离心心1.5h，以去除残余，以去除残余CsCl。病毒提纯结果病毒提纯结果未知病毒细胞毒TCID50=10-4.05/0.1ml。病毒液经过增殖、浓缩、氯化铯密
20、度梯度离心，获得4条区带。病毒的理化特性鉴定病毒的理化特性鉴定电镜照片电镜照片1病毒核酸型鉴定病毒核酸型鉴定2耐酸性试验耐酸性试验4胰蛋白酶敏感性试验胰蛋白酶敏感性试验5耐热性试验耐热性试验6脂溶剂敏感性试验脂溶剂敏感性试验3电镜样品制备方法电镜样品制备方法将未知病毒液接种已长成单层的将未知病毒液接种已长成单层的MDBK细胞，并以维持液维持；细胞，并以维持液维持；16h后将细胞培养基弃去，用后将细胞培养基弃去，用PBS（pH7.2，0.1M）轻轻洗涤一遍；）轻轻洗涤一遍；以以0.25的胰酶消化细胞，使之成为单细胞悬液；的胰酶消化细胞，使之成为单细胞悬液；1000-3000rpm离心离心10mi
21、n，弃去上清；以，弃去上清；以2.5的戊二醛的戊二醛(PH74)前固定。用刮匙将样品前固定。用刮匙将样品取出并割成小块，取出并割成小块，PBS（pH7.2，0.1M）洗涤）洗涤20min；1%锇酸固定；锇酸固定；PBS（pH7.2，0.1M）洗涤）洗涤20min；丙酮脱水（梯度；丙酮脱水（梯度30%，50%，70%，80%，90%，100%）每个梯度）每个梯度20min，脱三遍；环氧树脂包埋，脱三遍；环氧树脂包埋聚合；切片机超薄切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅双染色；透射电镜观聚合；切片机超薄切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅双染色；透射电镜观察病毒粒子形态察病毒粒子形态。电镜形态观察电镜形态观察电镜形态观
22、察结果电镜形态观察结果电电镜镜照照片片图图组组1电电镜镜照照片片图图组组2病毒核酸型鉴定病毒核酸型鉴定DNA抑制剂如抑制剂如5-5-氟尿嘧啶等进入细胞后发氟尿嘧啶等进入细胞后发生磷酸化，参与新合成的生磷酸化，参与新合成的DNADNA以代替胸腺嘧啶，以代替胸腺嘧啶，产生无功能的分子，从而抑制产生无功能的分子，从而抑制DNADNA的合成，将的合成，将此药物加于细胞培养物中，对此药物加于细胞培养物中，对DNADNA病毒有明显病毒有明显的抑制作用，而对的抑制作用，而对RNARNA病毒没有或仅有极低的病毒没有或仅有极低的抑制作用。抑制作用。病毒核酸型鉴定试验方法病毒核酸型鉴定试验方法在在6孔板内培养细胞
23、至单层，稀释病毒液，使其分别孔板内培养细胞至单层，稀释病毒液，使其分别为为10010-5六个稀释度。向六个稀释度。向1-6号板中分别加入号板中分别加入100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5六个滴度的病毒液，六个滴度的病毒液，7号板加入号板加入DMEM（病毒稀释液），每孔（病毒稀释液），每孔500l。在。在37CO2培养箱培养箱中孵育中孵育1h。用。用PBS洗涤洗涤6孔板，每块板的三个孔加入含孔板，每块板的三个孔加入含50g/ml5-氟尿嘧啶的氟尿嘧啶的1%FBSDMEM维持液，另三个孔加维持液，另三个孔加入不含入不含5-氟尿嘧啶的氟尿嘧啶的1%FBSDMEM维持液。置于维持液
24、。置于37CO2培养箱中孵育培养箱中孵育3d。按时观察细胞病变。按时观察细胞病变。病毒核酸型鉴定试验结果病毒核酸型鉴定试验结果接毒后随着时间的推移，接毒后随着时间的推移，1-6号板接毒孔相继出现细胞病号板接毒孔相继出现细胞病变，病变程度随着稀释倍数增大而减弱，变，病变程度随着稀释倍数增大而减弱，6号板细胞病变号板细胞病变不明显。每块不明显。每块6孔板（接种同一稀释度病毒液）中，添加孔板（接种同一稀释度病毒液）中，添加含含5-氟尿嘧啶的维持培养液孔与不添加氟尿嘧啶的维持培养液孔与不添加5-氟尿嘧啶的维持氟尿嘧啶的维持培养液孔相比，细胞病变出现时间及病变程度无显著差异。培养液孔相比，细胞病变出现时
25、间及病变程度无显著差异。7号板（不接病毒）中，所有培养孔均未出现细胞病变。号板（不接病毒）中，所有培养孔均未出现细胞病变。根据根据5-氟尿嘧啶对未知病毒的抑制滴度小于一个对数，可氟尿嘧啶对未知病毒的抑制滴度小于一个对数，可以判定未知病毒对以判定未知病毒对DNA抑制剂不敏感，为抑制剂不敏感，为RNA病毒病毒。脂溶剂敏感性试验脂溶剂敏感性试验某些病毒具有囊膜，脂质是其重要的结构成某些病毒具有囊膜，脂质是其重要的结构成分，应用乙醚等有机溶剂除去脂质，将使这类病分，应用乙醚等有机溶剂除去脂质，将使这类病毒灭活，例如疱疹病毒、正粘病毒、副粘病毒和毒灭活，例如疱疹病毒、正粘病毒、副粘病毒和批膜病毒等。故脂
26、溶剂敏感试验可检测出病毒是批膜病毒等。故脂溶剂敏感试验可检测出病毒是否具有囊膜否具有囊膜。脂溶剂敏感性试验方法脂溶剂敏感性试验方法于病毒液中加入于病毒液中加入AR级氯仿，使其终浓度为级氯仿，使其终浓度为4.8%，置，置4振荡混合振荡混合10min。500rpm离心沉淀离心沉淀5min，吸取上层，吸取上层液体，滴定病毒感染力。另外，以加入液体，滴定病毒感染力。另外，以加入4.8%量量PBS的病的病毒液作为对照，同样处理和滴定。氯仿处理病毒液的滴度毒液作为对照，同样处理和滴定。氯仿处理病毒液的滴度比对照病毒液下降比对照病毒液下降2个对数以上者，判断对氯仿敏感。滴个对数以上者，判断对氯仿敏感。滴度相
27、差小于度相差小于1个对数者，判为对氯仿不敏感。个对数者，判为对氯仿不敏感。脂溶剂敏感性试验结果脂溶剂敏感性试验结果将病毒经过氯仿处理后接种将病毒经过氯仿处理后接种MDBK细胞，细胞，细胞毒细胞毒TCID50=10-4.02/0.1ml。与未用氯仿处理的病毒的与未用氯仿处理的病毒的TCID50（10-4.05/0.1ml）相比，）相比，二者滴度相差小于一个对数，故判定未知病毒对氯仿不二者滴度相差小于一个对数，故判定未知病毒对氯仿不敏感，为无囊膜病毒。敏感，为无囊膜病毒。耐酸性试验耐酸性试验某些病毒耐酸，例如小某些病毒耐酸，例如小RNA病毒科中的肠道病毒科中的肠道病毒，但同科中鼻病毒和口蹄疫病毒却
28、对酸敏感。病毒，但同科中鼻病毒和口蹄疫病毒却对酸敏感。因此耐酸性试验也是病毒鉴定上一个比较重要的因此耐酸性试验也是病毒鉴定上一个比较重要的项目。项目。耐酸性试验方法耐酸性试验方法将病毒液等量分装于将病毒液等量分装于15ml离心管中。用离心管中。用0.1N的的HCl将将小瓶中的病毒液的小瓶中的病毒液的pH调至调至3.0，并向另，并向另1个离心管内的病个离心管内的病毒液加入相同于用酸量的灭菌的毒液加入相同于用酸量的灭菌的PBS做对照。置于做对照。置于37的恒温水浴锅或者室温感作的恒温水浴锅或者室温感作1h，再用，再用5.6%NaHCO3溶液溶液将将PH调回至调回至7.2左右。此后将两瓶病毒液分别用
29、敏感细胞左右。此后将两瓶病毒液分别用敏感细胞测定感染力。如果试验组感染力比对照组感染力降低测定感染力。如果试验组感染力比对照组感染力降低2个个对数以上乃至完全灭活者，则证明该病毒对酸敏感。滴度对数以上乃至完全灭活者，则证明该病毒对酸敏感。滴度相差小于相差小于1个对数者为耐酸。个对数者为耐酸。耐酸性试验结果耐酸性试验结果将病毒液经过将病毒液经过HCl处理，再用处理，再用NaCO3将将pH调回至调回至7.2后接种后接种MDBK细胞，细胞毒细胞，细胞毒TCID50=10-4.17/0.1ml。与用等量与用等量PBS处理的对照组处理的对照组TCID50（10-3.77/0.1ml）相比，）相比，二者滴
30、度相差小于一个对数，故判定未知病毒对二者滴度相差小于一个对数，故判定未知病毒对pH3环境耐环境耐受。受。胰蛋白酶敏感性试验胰蛋白酶敏感性试验灰质炎病毒、猪传染性胃肠炎冠状病毒等对胰蛋白酶灰质炎病毒、猪传染性胃肠炎冠状病毒等对胰蛋白酶具有较高的抵抗力。相反，某些病毒，例如痘病毒、呼肠具有较高的抵抗力。相反，某些病毒，例如痘病毒、呼肠孤病毒和疱疹病毒等却易被胰蛋白酶灭活。因此，胰蛋白孤病毒和疱疹病毒等却易被胰蛋白酶灭活。因此，胰蛋白酶试验也常用于一些病毒的鉴定。酶试验也常用于一些病毒的鉴定。胰蛋白酶敏感性试验方法胰蛋白酶敏感性试验方法于灭菌于灭菌15ml离心管内，加入病毒液离心管内，加入病毒液50
31、0l，再加入溶于，再加入溶于pH7.4PBS的的1%胰蛋白酶溶液胰蛋白酶溶液500l，使胰蛋白酶终浓度为，使胰蛋白酶终浓度为0.5%，充分混合。置充分混合。置37作用作用1h，随即加入灭活的犊牛血清，随即加入灭活的犊牛血清4ml，充分混合，充分混合，终止胰蛋白酶的作用。另取同样的病毒液终止胰蛋白酶的作用。另取同样的病毒液500l，加入，加入pH7.4PBS液液500l，混合和，混合和37放置放置1h后，加入灭活犊牛血清后，加入灭活犊牛血清4ml作为对照。最作为对照。最后将上述两份混合液分别在后将上述两份混合液分别在BK细胞测定感染力。感染力比对照组降细胞测定感染力。感染力比对照组降低低2个对数
32、以上，以至完全丧失感染力者，判为对胰蛋白酶敏感；滴个对数以上，以至完全丧失感染力者，判为对胰蛋白酶敏感；滴度相差小于度相差小于1个对数者，判为对胰蛋白酶抵抗。个对数者，判为对胰蛋白酶抵抗。胰蛋白酶敏感性试验结果胰蛋白酶敏感性试验结果将病毒经过胰蛋白酶处理后接种将病毒经过胰蛋白酶处理后接种MDBK细胞，细胞毒细胞，细胞毒TCID50=10-3.06/0.1ml。与用等量与用等量PBS处理的对照组处理的对照组TCID50（10-3.17/0.1ml）相比，）相比，二者滴度相差小于一个对数，故判定未知病毒对胰蛋白酶二者滴度相差小于一个对数，故判定未知病毒对胰蛋白酶不敏感。不敏感。耐热性试验耐热性试验
33、不同病毒对不同温度的敏感度以及耐受时间不同，故不同病毒对不同温度的敏感度以及耐受时间不同，故可以通过热敏感性试验及结合二价阳离子保护性试验（二可以通过热敏感性试验及结合二价阳离子保护性试验（二价阳离子例如价阳离子例如MgCl2，能够明显提高某些病毒对，能够明显提高某些病毒对50-55高温处理的抵抗力）对病毒进行鉴定。高温处理的抵抗力）对病毒进行鉴定。耐热性试验方法耐热性试验方法1、对不同温度的耐受、对不同温度的耐受将病毒悬液分为等量将病毒悬液分为等量4管，分别置于管，分别置于50、60、70、80水浴水浴1h，测定感染力。如果在某个温度下试验组感染力比对照组感染力，测定感染力。如果在某个温度下
34、试验组感染力比对照组感染力降低降低2个对数以上乃至完全灭活者，则证明该病毒对此温度敏感。滴个对数以上乃至完全灭活者，则证明该病毒对此温度敏感。滴度相差小于度相差小于1个对数者为耐受。个对数者为耐受。2、对、对50的耐受时间的耐受时间将病毒悬液分为等量将病毒悬液分为等量4管，置于管，置于50水浴分别感作水浴分别感作5、10、15和和30min，随后测定感染力。如果试验组感染力比对照组感染力降低，随后测定感染力。如果试验组感染力比对照组感染力降低2个对数以上乃至完全灭活者，则证明该病毒在此时间内对个对数以上乃至完全灭活者，则证明该病毒在此时间内对50敏感。敏感。滴度相差小于滴度相差小于1个对数者表
35、明病毒在此时间内对个对数者表明病毒在此时间内对50耐受。耐受。耐热性试验方法耐热性试验方法3、二价阳离子保护性试验、二价阳离子保护性试验将将MgCl2用蒸馏水配成用蒸馏水配成1.1M溶液。另将病毒液分成两份，分别用溶液。另将病毒液分成两份，分别用1.1MMgCl2溶液和生理盐水（对照）作溶液和生理盐水（对照）作10稀释，置稀释，置50水浴感作水浴感作1h后，在细胞培养物上滴定感染力，如果试验组感染力比对照组感后，在细胞培养物上滴定感染力，如果试验组感染力比对照组感染力提高染力提高2个对数以上，则证明个对数以上，则证明MgCl2对病毒具备保护性。滴度相差对病毒具备保护性。滴度相差小于小于1个对数
36、者为不具有保护性。个对数者为不具有保护性。耐热性试验结果耐热性试验结果1、对不同温度的耐受、对不同温度的耐受分别将经过分别将经过50、60、70、80处理处理1h的病毒，接种的病毒，接种BK细胞，细胞，3天后观察均不引起细胞病变，由此可知天后观察均不引起细胞病变，由此可知50作用作用1h便可灭活病毒。便可灭活病毒。2、对、对50的耐受时间的耐受时间分别将经过分别将经过50处理处理5min、15min、30min、1h的病毒，接种的病毒，接种BK细胞，细胞，3天后观察均不引起细胞病变。由此可知，天后观察均不引起细胞病变。由此可知，50作用作用5min便可便可灭活裸露状态的病毒。灭活裸露状态的病毒
37、。耐热性试验结果耐热性试验结果3、二价阳离子保护性试验、二价阳离子保护性试验将将MgCl2溶液处理的病毒液置于溶液处理的病毒液置于50水浴水浴1h后接种后接种MDBK细胞，细胞毒细胞，细胞毒TCID50=10-5.06/0.1ml。与未使用与未使用MgCl2溶液且经过同样高温处理的病毒（完全灭溶液且经过同样高温处理的病毒（完全灭活）相比较，可以判定活）相比较，可以判定MgCl2溶液对处于溶液对处于50高温环境中的高温环境中的未知病毒具有保护力。未知病毒具有保护力。理化特性鉴定总结理化特性鉴定总结病毒核酸型鉴定病毒核酸型鉴定RNA（抑制滴度小于一个对数（抑制滴度小于一个对数）脂溶剂敏感试验脂溶剂
38、敏感试验无囊膜无囊膜（TCID50：10-4.02/0.1mlVS10-4.05/0.1ml）胰酶敏感试验胰酶敏感试验不敏感不敏感（TCID50：10-3.06/0.1mlVS10-3.17/0.1ml）耐酸性试验耐酸性试验pH3耐受耐受（TCID50：10-4.17/0.1mlVS10-3.77/0.1ml）耐热性试验耐热性试验50作用作用5min灭活灭活（TCID50：100/0.1mlVS10-4.05/0.1ml）二价阳离子具有保护力二价阳离子具有保护力（TCID50：10-5.06/0.1mlVS100/0.1ml）排除可疑病毒排除可疑病毒结合病牛症状及病毒核酸型，对描述相符的一些常
39、见病毒进行检测排除。可以采用血清学试验、PCR检测等方法。可疑病毒排除试验方法可疑病毒排除试验方法根据病毒引起牛腹泻的临床症状及核酸型判定结果，怀疑其可能为BVDV（病毒性腹泻病毒）、BCV（牛冠状病毒）、BRV（牛轮状病毒）感染。故合成这三种病毒的特异性引物对病毒进行扩增。引物序列如下： （1）BVDV引物 FBVDV：5-CAT GCC CAT AGT AGG AC-3 RBVDV：5-CCA TGT GCC ATG TAC AG-3 （2）轮状病毒引物 FBCV：5-AgA ATT TCC gTT Tgg CTA-3 RBCV：5-Cgg TCA CAT CAT ACA ACT CT-3
40、 （3）冠状病毒引物 FBCV：5-gAg CgT CCT TTg gAA ATC gT-3 RBCV：5-gCT TAg TTA CTT gCT gTg gC-3 用用BVDVBVDV、BCVBCV、BRVBRV特异性引物对未知病毒特异性引物对未知病毒RT-PCRRT-PCR扩增结果扩增结果 1. 1. 用用BVDVBVDV特异性引物对特异性引物对BVDVBVDV病毒株扩增产物（阳性对照）病毒株扩增产物（阳性对照） 2. 2. 用用BVDVBVDV特异性引物对未知病毒扩增产物特异性引物对未知病毒扩增产物 3. 3. 用用BCVBCV特异性引物对未知病毒扩增产物特异性引物对未知病毒扩增产物 4
41、. 4. 用用BRVBRV特异性引物对未知病毒扩增产物特异性引物对未知病毒扩增产物 M. DNA M. DNA分子量标准分子量标准可疑病毒排除结果（可疑病毒排除结果（PCR检测）检测）扩增结果显示，扩增结果显示，可以排除此病毒可以排除此病毒为为BVDV、BCV及及BRV。分子生物学检测方法分子生物学检测方法提取RNA（据理化鉴定结果）使用随机引物进行PCR或者RT-PCR回收目的片段连接T载体转化感受态细胞蓝白斑筛选重组质粒测序序列比对分析随机引物选择随机引物选择随机引物随机引物PCR技术技术(randomampliedpolymorphicDNA，RAPD；arbitranlyprimedP
42、CR，APPCR)是由是由Welsh、Williams于于1990年几乎同时建立起来的一项年几乎同时建立起来的一项DNA多态检测技术。该技术以多态检测技术。该技术以PCR为基础，利用一系列为基础，利用一系列单一的人工合成的随机寡核苷酸链为引物，对所研究的基单一的人工合成的随机寡核苷酸链为引物，对所研究的基因组因组DNA进行进行PCR扩增。这一技术在物种鉴定、动植物扩增。这一技术在物种鉴定、动植物分类、群体遗传学调查、遗传性突变基因的筛查、新病毒分类、群体遗传学调查、遗传性突变基因的筛查、新病毒发现等方面得到广泛的应用。发现等方面得到广泛的应用。本次试验选择锚定随机引物序列如下：本次试验选择锚定
43、随机引物序列如下：RPAdP：5-ggACTggCTCgATggCTCNNNNNNN-3RPAP：5-ggACTggCTCgATggCTC-3分子生物学检测分子生物学检测1.用锚定随机引物对病毒提纯后区带用锚定随机引物对病毒提纯后区带1的扩增产物的扩增产物2.用锚定随机引物对病毒提纯后区带用锚定随机引物对病毒提纯后区带2的扩增产物的扩增产物3.用锚定随机引物对病毒提纯后区带用锚定随机引物对病毒提纯后区带3的扩增产物的扩增产物4.用锚定随机引物对病毒提纯后区带用锚定随机引物对病毒提纯后区带4的扩增产物的扩增产物M.DNA分子量标准分子量标准回收回收500bp以以上的条带上的条带锚锚定定随随机机引
44、引物物扩扩增增结结果果电泳图显示，模电泳图显示，模板经随机引物扩板经随机引物扩增后其片段大小增后其片段大小从几百至几千个从几百至几千个碱基对不等，产碱基对不等，产物呈彗尾样拖带物呈彗尾样拖带现象。现象。用锚定随机引物对重组质粒的用锚定随机引物对重组质粒的PCR鉴定结果鉴定结果回收目的片段回收目的片段连接连接T载体载体转化感受态细胞转化感受态细胞蓝白斑筛选重组质粒蓝白斑筛选重组质粒重组质粒的双酶切鉴定结果重组质粒的双酶切鉴定结果选择部分酶切鉴定为阳性的质粒送至公司测序，测序结果登陆选择部分酶切鉴定为阳性的质粒送至公司测序，测序结果登陆NCBI进行比对。结果表明，进行比对。结果表明，其与其与Bov
45、ineEnterovirus同源性为同源性为68%-78%。其中，与其中，与BovineEnterovirustype2strain3A（completegenome）同源性最高。）同源性最高。根据上述结果，怀疑此病毒可能为根据上述结果，怀疑此病毒可能为BEV-2，故设计合成特异性引物，故设计合成特异性引物对其进行扩增。对其进行扩增。引物序列如下：引物序列如下：BEV-2-F：5-ACggAgTAgAtggTATTCCC-3BEV-2-R：5-CgAgCCCCATCTTCCAgAg-3目的片段约目的片段约220bp左右。左右。序列比对结果序列比对结果1-4.用用BEV-2特异性引物对病毒提纯后
46、区带特异性引物对病毒提纯后区带1至区带至区带4的扩增产物的扩增产物5.用用BEV-2特异性引物对未提纯病毒的扩增产物特异性引物对未提纯病毒的扩增产物M.DNA分子量标准分子量标准特特异异性性引引物物扩扩增增结结果果用特异性引物扩增产物序列比对结果表明，其与用特异性引物扩增产物序列比对结果表明，其与BovineEnterovirustype2同源性为同源性为80%-93%。其中，。其中，与与Bovineenterovirustype2strainWye88445UTR同源性最高。同源性最高。序列比对结果序列比对结果结论结论病毒特性检测结果与牛肠病毒病毒特性检测结果与牛肠病毒2型的各项理化特性型的
47、各项理化特性相符。相符。分子生物学检测结果表明，该病毒与牛肠病毒分子生物学检测结果表明，该病毒与牛肠病毒2型型分离株同源性高达分离株同源性高达93%。结合以上二者判定未知病毒属于牛肠病毒结合以上二者判定未知病毒属于牛肠病毒2型。型。工作正在进行中工作正在进行中血清学检测方法建立血清流行病学调查动物回归试验全基因组序列测定防控措施制定和产品研制RjUmYp!t&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6
48、I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlX
49、o#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D
50、5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSj
51、VnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6dPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F
52、7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUm
53、Xp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgRjVm$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v(y0B3F6
54、I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNeQiTlX
55、o#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*w-A1D
56、5G8fRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZ
57、r$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8J
58、bNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq
59、!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmt*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaM
60、dPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6I9LdOgWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w
61、-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9Lc
62、OgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9PhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)
63、y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3ELdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!
