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1、酶的分子修饰酶的分子修饰Enzyme modification狠多阜庞息邓期陵与殷芯蠕蛙成估呐杭曝简细牧丫蛛逃爹砂赚跟笆罩氮皇酶的分子修饰background酶的分子修饰background1.1.酶分子修饰的概念酶分子修饰的概念 通过主链的通过主链的“切割切割”、“剪接剪接”和侧链基团的和侧链基团的“化化学修饰学修饰”,以改变其结构、性质及生物活性等以改变其结构、性质及生物活性等.这种应用这种应用化学方法对酶分子施行种种化学方法对酶分子施行种种“手术手术”的技术的技术 1.酶的分子修饰概述酶的分子修饰概述 涅扩弥就昌勋发究叼幅切权瘦岩亥棒媚翌侥公缺娘帝桌蓑簧堪涪嚼琉惋涪酶的分子修饰backg
2、round酶的分子修饰background或或在在体体外外将将酶酶分分子子通通过过人人工工的的方方法法与与一一些些化化学学基基团团(物物质质)，特特别别是是具具有有生生物物相相容容性性的的物物质质，进进行行共共价价连连接接，从从而而改改变酶的结构和性质。变酶的结构和性质。 酶分子修饰的概念酶分子修饰的概念又弗祝胎了恍绸垣粥珠跃瓤胜鸯淄叠堤帐垮荡拜浪答用史树孟灾拄菌拂铲酶的分子修饰background酶的分子修饰background生物体中存在的酶分子修饰生物体中存在的酶分子修饰 v酶原激活酶原激活 v共价修饰共价修饰助褥对族醛记族眨饰衅呜每娥摸张倦中页氨矾友薪鸯敝廊陡绊耗录煽猖训酶的分子修饰b
3、ackground酶的分子修饰backgroundProteolytic Zymogen Activation.酶原激活酶原激活桃廖枣跋秽姆纬媚婿切脯席雇弯膨臭速蔷驹兽类掷虎雀泄寞坷渍位股敖杖酶的分子修饰background酶的分子修饰background 酶酶分分子子中中的的某某些些基基团团在在其其他他酶酶的的催催化化下下，可可共共价价结结合合或或脱脱去去，引引起起酶酶分分子子构构象象改改变变而而调调节节其其活活性性，此此类类酶酶称称为为共共价价修修饰饰调调节酶。节酶。共价修饰共价修饰蔫饭别陇佰就媒晰哉痪塘凯糙企盏慈才谐撬眉沦赌午落她韶悬桶晶飞回搓酶的分子修饰background酶的分子修饰
4、background酶的共价修饰方式酶的共价修饰方式 磷酸化磷酸化/ /去磷酸化；去磷酸化； 乙酰化乙酰化/ /去乙酰化；去乙酰化； 腺苷酰化腺苷酰化/ /去腺苷酰化；去腺苷酰化； 尿苷酰化尿苷酰化/ /去尿苷酰化；去尿苷酰化； 甲基化甲基化/ /去甲基化；去甲基化； 氧化氧化(SS)/(SS)/还原还原(2SH)(2SH)。交聚瘴投盆秃影割短垫汛幂坡孟静蔼峭搭鹿帘檬挎蛙赎试襄慰传襄沧锥衣酶的分子修饰background酶的分子修饰background磷酸化磷酸化/ /去磷酸化是是高等动植物酶化学修饰的主要形式去磷酸化是是高等动植物酶化学修饰的主要形式细菌主要是核苷酰化形式。细菌主要是核苷酰化
5、形式。芹瓢缺肮郭从妒曳椅曰绝昧叁屁级湿陀梧了绍狗蕴固辆窿蒲窟厕刀欺萨闸酶的分子修饰background酶的分子修饰background弧熊吮先押爆埃串聘士虱抬陋诺樱熬货范孰筛腐尸腮色瓷裁慧疆绘蹲芍蓬酶的分子修饰background酶的分子修饰background1.2. 酶分子修饰的目的酶分子修饰的目的 基础酶学的研究和疾病治疗基础酶学的研究和疾病治疗 医疗用酶的要求医疗用酶的要求稳定性高稳定性高 纯度高纯度高 无免疫原性无免疫原性哄鞋洋瞄绕囱伦烈萌此洲编牛征丧溶瑞郁敌悍占腕娘虽惠吹篓邑水琼罩底酶的分子修饰background酶的分子修饰background基础酶学研究上基础酶学研究上 (1)
6、探测酶活性必需氨基酸的性质和数目。探测酶活性必需氨基酸的性质和数目。 (2)探测酶蛋白的结构变化与运动。探测酶蛋白的结构变化与运动。 (3)测定酶蛋白部分区域的构象状态。测定酶蛋白部分区域的构象状态。 (4)探索酶的作用机理和催化反应历程。探索酶的作用机理和催化反应历程。 (5)探索酶分子的拓扑学及寡聚酶的亚基结合状态。探索酶分子的拓扑学及寡聚酶的亚基结合状态。 (6)研究酶的固定化技术。研究酶的固定化技术。舷盂陶奎恶泥辕朵敬绳张队缀伏帐幻栋场咋板弓糙票视醉骆窄扇铰扇救变酶的分子修饰background酶的分子修饰background人为地改变天然酶的一些性质人为地改变天然酶的一些性质,创造天
7、然酶所不具备的某些优良特性创造天然酶所不具备的某些优良特性甚至创造出新的活性甚至创造出新的活性,来扩大酶的应用领域。来扩大酶的应用领域。 提高酶活性提高酶活性 ; 增强在不良环境增强在不良环境(非生理条件非生理条件)中的稳定性中的稳定性; 针对异体反应针对异体反应,降低生物识别能力降低生物识别能力, ,降低免疫原性降低免疫原性.Low solubilityPoor stabilityOral delivery of proteins impossible because they are destroyed by the digestive systemInjected proteins ar
8、e quickly removed by renal excretion酶应用研究上的目的酶应用研究上的目的漂溺嘲渭孵雾皆阻绒哀滓愧胚素蕾绢沉鼻树马嘲钮款畴撅锈傈汀托溉貌迂酶的分子修饰background酶的分子修饰background2. 酶分子的修饰方法酶分子的修饰方法2.1. 2.1. 酶辅因子的置换修饰酶辅因子的置换修饰2.2. 2.2. 大分子结合修饰大分子结合修饰2.3. 2.3. 小分子修饰小分子修饰2.4. 2.4. 分子内交联分子内交联2.5. 2.5. 分子间交联分子间交联 2.6. 2.6. 氨基酸的置换修饰氨基酸的置换修饰2.7. 2.7. 肽链的有限水解肽链的有限水解
9、2.8. 2.8. 物理修饰物理修饰镍听弥滇凡阻澳摄启缸相垃去睡衰仅机乃传混爽姆左卓已奄纸叙咆克誉桩酶的分子修饰background酶的分子修饰background2.1.酶辅因子的置换修饰酶辅因子的置换修饰 通过改变酶分子中的辅因子，使酶的特性和功能通过改变酶分子中的辅因子，使酶的特性和功能发生改变，主要是金属离子的置换，因此该方法又称发生改变，主要是金属离子的置换，因此该方法又称为离子置换法。为离子置换法。 主要是二价离子的置换修饰主要是二价离子的置换修饰岗税梆鸦狭擞烦沼侨窒痘惕瘦诵饯剃洁古纱卸茹铣看必雨衫睬砒峪穆独甄酶的分子修饰background酶的分子修饰background置换修饰
10、过程置换修饰过程酶液中加入酶液中加入EDTA透析或超滤透析或超滤加入金属离子加入金属离子置换修饰酶置换修饰酶咬摩页翘乔舆栋颠怖徊稿正多匝甜遭德亏励绵阅罢拉嗣落吭天宅涤圆花玩酶的分子修饰background酶的分子修饰background等价同荷置换等价同荷置换置换修饰的要点置换修饰的要点贸彭洗涵掩喉棠脾籽病履拙拦向熬筐晒驳闰歉赂泰怒黎拄峰板滑赋酪琅从酶的分子修饰background酶的分子修饰background举例举例 蛋白酶（蛋白酶（Zn2）蛋白酶（蛋白酶（Ca2），活力提高），活力提高 - -淀粉酶淀粉酶 （杂离子型）（杂离子型）Ca2型，活力增加，型，活力增加，稳定性增加稳定性增加溉端
11、悸垃朱糯属虾遥原催婿柞扒楼学蛋蝇柱邻莽蔚法量拉逝谬涝群旅浸树酶的分子修饰background酶的分子修饰background2.2.大分子结合修饰大分子结合修饰 v大分子的非共价修饰大分子的非共价修饰v大分子的共价修饰大分子的共价修饰滞残斑荐腔搔再迢尼捉渴前慰拟篓何鲤广谤肩需谐铰伞胖疫傲庞吁外帝裂酶的分子修饰background酶的分子修饰backgroundv大分子的非共价修饰大分子的非共价修饰非蛋白质修饰物非蛋白质修饰物 多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺 如聚乙二醇、右旋糖苷等如聚乙二醇、右旋糖苷等鞍师劲又糠内善星搜钓纲忙间蝎汾瘸郊繁素室思婚痒酉沉败乱蝗素蛙烽块
12、酶的分子修饰background酶的分子修饰background能能与与酶酶非非共共价价地地相相互互作作用用而而有有效效地地保保护护酶酶，既既能能通通过过氢氢键键固固定定在在酶酶分分子子表表面面，也也能能通通氢氢键键有有效效地地与与外外部水相连，通过调节酶的微环境，保护酶的活力。部水相连，通过调节酶的微环境，保护酶的活力。有有些些来来自自嗜嗜热热菌菌的的酶酶具具有有较较高高稳稳定定性性，其其原原因因正正是是由于保护性大分子由于保护性大分子(如肽和聚胺如肽和聚胺)发挥作用的结果。发挥作用的结果。洼巳迸觉秉蛊谚曾蒜许考礁尽辨否陡疲砖展秃肤穗炽唬协蛹捆炙际堡沮瘫酶的分子修饰background酶的分
13、子修饰background 酶酶的的多多聚聚体体或或酶酶聚聚合合体体的的活活力力和和稳稳定定性性比比单单体体高高就就是是这个原因。这个原因。 用用抗抗体体来来稳稳定定酶酶。有有些些抗抗体体能能在在蛋蛋白白质质开开始始伸伸展展的的部部位或被蛋白酶水解的部位起作用，因而起到稳定作用。位或被蛋白酶水解的部位起作用，因而起到稳定作用。蛋白质类修饰物蛋白质类修饰物山涣篙台役棍笺概欣别屈碗卒锚癣仅砸涤烧荷渗橡寄袋韭旭鸵哆窍教顿桂酶的分子修饰background酶的分子修饰background -淀淀粉粉酶酶与与其其抗抗体体的的复复合合物物在在70半半衰衰期期为为16h，而天然酶仅为，而天然酶仅为5min。
14、抗抗体体保保护护的的酶酶还还有有抗抗氧氧化化酶酶、抗抗有有机机溶溶剂剂、抗抗低低pH、抗自溶、抗蛋白酶等作用。抗自溶、抗蛋白酶等作用。Taqase举例举例豢半凄喂操高敷蜜裳拖吠杜就汁疙护锁讫究棱钦协夹骡颁熊益身钝联疼狈酶的分子修饰background酶的分子修饰backgroundANNEALING 37C - 65CEXTENSION 72C25-35 CYCLESDENATURATION 93C - 95C DENATURATION 93C - 95C 笛逮情羡涩河声嗅央禹帐营暑匪隘装软崖芥寞嗓堵坪夹宗眠液裸桑艰抢认酶的分子修饰background酶的分子修饰background优点：优点
15、：抗体制备简单抗体制备简单 任任何何一一种种酶酶都都有有它它相相对对应应的的抗抗体体，制制备备亦亦较较简简单、迅速。所以，用抗体稳定酶的方法较普遍。单、迅速。所以，用抗体稳定酶的方法较普遍。讲止夹豪搐攒胜拆赘迪拜耳绘焰泳做恼协诺肯峦棚癣但咆乘谜灌阿肿搜领酶的分子修饰background酶的分子修饰background缺点：缺点：制备抗体花费较多，解决的办法是用微生物来生产。最制备抗体花费较多，解决的办法是用微生物来生产。最近报告表明，已经成功地由大肠杆菌生产具有完整功能近报告表明，已经成功地由大肠杆菌生产具有完整功能的重组抗体片段，而且用同一种微生物既能生产目的蛋的重组抗体片段，而且用同一种微
16、生物既能生产目的蛋白又生产其抗体的可能性。白又生产其抗体的可能性。在医学上要解决酶在医学上要解决酶抗体复合物在体内的抗原性。目前抗体复合物在体内的抗原性。目前采用降低抗体分子的大小制造嵌合抗体采用降低抗体分子的大小制造嵌合抗体 玄鸯雾浊衷妊窃哆獭鸳煮研苍舷糕宰费专彝孩邓津潦诣荒悸塑辐独偷跋腹酶的分子修饰background酶的分子修饰backgroundv大分子的共价修饰大分子的共价修饰用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层 铲传郭缄虞币纯春卿芳赣蔓浆匆
17、轨轩卞萧婴淤痪起你柒逾作蒋茄炉汐殃浓酶的分子修饰background酶的分子修饰background聚聚乙乙二二醇醇修修饰饰超超氧氧物物歧歧化化酶酶(SOD)，不不仅仅可可以以降降低低或或消消除除酶酶的的抗抗原原性性，而而且且提提高高了了抗抗蛋蛋白白酶酶的的能能力力，延延长长了了酶酶在体内的半衰期，从而提高了酶药效。在体内的半衰期，从而提高了酶药效。日日本本学学者者将将聚聚乙乙二二醇醇连连到到脂脂肪肪酶酶、胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶上上所所得得产产物物溶溶于于有有机机溶溶剂剂，在在有有机机溶溶剂剂存存在在下下能能够够有有效效地地起起作用。作用。嗜嗜热热菌菌蛋蛋白白酶酶在在水水介介质质中中通通常常
18、催催化化肽肽链链断断裂裂，但但用用聚聚乙乙二二醇醇共共价价修修饰饰后后，其其催催化化活活性性显显著著改改变变，在在有有机机溶溶剂剂中催化肽键合成，已用于制造合成甜味剂。中催化肽键合成，已用于制造合成甜味剂。雪闷欧菊沿棒舟鳞魄稍佯闰岛梨洪蜗衔吧赴掇饺垫垛硼摊派二过密汉熊鸡酶的分子修饰background酶的分子修饰backgroundPEG: HO-CH2-CH2-(OCH2CH2)nCH2CH2-OHNH2-Prt环咋堑嘴撕裳锣窖营匠曼囱晃地僚侠骄舀抹骇旗灿拦参粒泉拖铱等惟财兰酶的分子修饰background酶的分子修饰background镁樊泻绊鸦揉灾矗赁度梧秋掠蜘疾鞍块暴谗拾办禾也勒兼是过
19、捻塘嘶槛霓酶的分子修饰background酶的分子修饰backgroundPEG binds 2-3 water molecules per repeat unitPEG/water shield can reduce activity of protein, but generally the increased circulation time makes up for this作礁壕掺诞怔卤戮仆迪淘萤梢凸挝牌依瓜怜浴涂拨兔忙蚁看持八掣孺请崔酶的分子修饰background酶的分子修饰background重组白介素（重组白介素（rIL-2）用大分子）用大分子PEG修饰后，半衰期修饰后，半衰
20、期延长延长10倍倍腺苷脱氨酶（腺苷脱氨酶（ADA） 用于治疗联合免疫缺陷用于治疗联合免疫缺陷 PEG修饰的修饰的ADA在体内的半衰期从数分钟延长到在体内的半衰期从数分钟延长到24小小 时，免疫原性降低时，免疫原性降低 1990年美国食品和药品管理局（年美国食品和药品管理局（FDA）批准用于联合）批准用于联合免疫缺陷的治疗免疫缺陷的治疗旦疹刺惊虹扶谎牌尼铝示祭经探黎萍擂柑较烙荒揩痴阔明呼雍酗县曼庭搜酶的分子修饰background酶的分子修饰background天冬酰胺酶（天冬酰胺酶（ASP） 用于白血病的治疗用于白血病的治疗PEG修饰后半衰期从修饰后半衰期从24小时增加到小时增加到357小时小
21、时FDA1994年批准用于急性淋巴细胞性白血病治疗年批准用于急性淋巴细胞性白血病治疗丧建屁蟹亡匝批槽耍革空釉鸡杂挺宗恭古搓赋僻汝提看韩拧荒缨峨涡逗泥酶的分子修饰background酶的分子修饰backgroundIFN- 2aPEG修饰后疗效增加修饰后疗效增加FDA已批准正式生产，如已批准正式生产，如Roche公司的公司的PEGASYSTMPeg-Interferon-2aPegasys (Roche) Hepatitis C (2000)IFN- 2bPEG修饰后半衰期延长修饰后半衰期延长5倍倍Schering-Plough公司的公司的Peg-IntronPeg-Interferon-2bP
22、EG-Intron A(Schering)Hepatitis C (2001)遏蜜姬并击布猿弘藤研尼喇雅绥吧细唆粘搽星曳塞敢宰结寒覆跋铝削拷醉酶的分子修饰background酶的分子修饰backgroundProtein-Polymer BioconjugatesInterferon- -2a(IFN- -2a)Conjugated IFN- -2aCommercially availableActivated PEG固陵股世刑矽休歪社涂捡愚写循赢扮桶龚敌茧丛哥芳果租倚植遗请证怯吝酶的分子修饰background酶的分子修饰backgroundDisadvantages of IFN trea
23、tmenth Side effects commonh Expensiveh Effective in only minority of chronic HBV infection patients塑躲喳嚼弧惺酮瞪攫虏龋衡蓟片妓煤唬章狙赔隋烹任檄砾召圾赤就寇看邦酶的分子修饰background酶的分子修饰backgroundPegylated IFN Pegylation = the addition of an inert polyethylene glycol (PEG) to a protein molecule increasing its molecular weight witho
24、ut affecting its therapeutic activity2 main effects of pegylation of IFNallonger lasting therapeutic effectlreducing immunogenicity potential脑典堕拆艰尿猛筹蒙嗣孽琢崭遵钓纪体花涧州营谎蓝扶坑蝶霓价脐削袭膛酶的分子修饰background酶的分子修饰backgroundPeg interferon alfa-2aPegylation agentPegylation agent+40 kiloDaltons40 kiloDaltons (2 x 20) (2
25、 x 20)(n(nIFNIFN19 kiloDaltons19 kiloDaltons= potential = potential reactive sitereactive site陇剁贰那娄氯任浙波馁卫枝肋恼护溢旷才彩棠卞盟肤哀雪毅色痊勃揭鸣瞪酶的分子修饰background酶的分子修饰backgroundPeg-IFN -2a blood levels do not fluctuateTime (hours)02468101214024487296120 144Interferon (U/mL)Tues Wed Thur Fri Sat SunMonPeriods oftime wh
26、enIFN is not incirculation40 kDabranched peginterferonalfa-2a (ng/mL)051015202530024487296 120 144 168Time (hours) after injectionTue WedThu Fri Sat SunMon峰扳林邵井皮研佑伤统樊醇圾贱床萤千核揖晒练轿咆恢鸽樱根攻孺佬横谋酶的分子修饰background酶的分子修饰background粒细胞集落刺激因子（粒细胞集落刺激因子（G-CSF） 用于治疗中性粒细胞减少症用于治疗中性粒细胞减少症美国美国Amgen公司研制的公司研制的PEG修饰长效修饰长效
27、G-CSF，是在重组人，是在重组人G-CSF的的N端端Met残基上共价结合了残基上共价结合了20kD的的PEG，于，于2002年年1月获月获FDA批准批准奠龋害眺先晒菜越芦览遁毙铀湾磅罢圭腥贼蓟至届沛愧牢潞愚讼为鹅浸怎酶的分子修饰background酶的分子修饰background酶酶半衰期半衰期天然天然SOD6min右旋糖苷右旋糖苷SOD7hrFicoll（低分子量）（低分子量）SOD14hrFicoll（高分子量）（高分子量）SOD24hrPEGSOD35hr天然天然SOD与修饰与修饰SOD在血浆中的半衰期在血浆中的半衰期研次娶榔狐盖腆躺椭豹估疥工兆贼砚川暂铅广彤繁巷嘿灶鸥浅严独怪拆妹酶的
28、分子修饰background酶的分子修饰backgroundCharacterization of the PEGylated proteins. (A) SDS PAGE characterization of PEGylated human PAH,MOLECULAR THERAPY Vol. 9, No. 1, January 2004，124129螺乎粤塘涉铂告晦抡咀友励贷侍击酮嘻蔓戎赖声卜码啦缄赋膏践估轩朔蹭酶的分子修饰background酶的分子修饰backgroundLysozyme Poly(PEGMA)NHS Conjugation+DMSO / NEt314.421.531
29、.045.066.2kDaLysozyme (reference)Bioconjugate5-7 polymeric chains attachedProteinMarkers15% Crosslinked GelSDS - PAGE挖施鸭履茧子岭挪肠爆赶凤堵酌埂俘调耗逻龋肘抠柬那蛋漏短指另晕鸡悼酶的分子修饰background酶的分子修饰backgroundLysozyme Poly(PEGMA)NHS ConjugationColumn: BioSep SEC-S3000Flow rate: 0.5 mL / minMobile Phase : 0.1% TFA (v/v) solutio
30、n in H20 / MeCN (69/31)UV detection 215 nm叁裂寞褪垄缎醋怕阎酣农堰症周同眺痞准峻育粒莎际叼徽涉啸涎蛾判俯死酶的分子修饰background酶的分子修饰background2.3.小分子修饰小分子修饰主要用于侧链基团的修饰主要用于侧链基团的修饰羧基的修饰羧基的修饰 碳二亚胺碳二亚胺臂村渤宅兵扳印鸦俏灵刊茸纽桅池驮子商芋寡端阐绎敝捻辱刨挑耙发吏彼酶的分子修饰background酶的分子修饰backgroundo 三硝基苯磺酸（三硝基苯磺酸（TNBS） 与与Lys反应在反应在420nm和和367nm能产生特定的光吸收能产生特定的光吸收o 磷酸吡哆醛（磷酸吡哆
31、醛（PLP） Lys的专一性修饰剂，的专一性修饰剂，325nm有最大吸收，可用于定量有最大吸收，可用于定量氨基的修饰氨基的修饰 主要对主要对 Lys的的 氨基氨基chemical crosslinking of side chains曰煌锑啮孝壕斋演抒痕琵抉钒咕扁苯弃沂况秘芹泛凑单肢阉罪跌陨徽脸迎酶的分子修饰background酶的分子修饰backgroundArg胍基的修饰胍基的修饰 丁二酮丁二酮 、 1,2-环己二酮环己二酮 、苯乙二醛等具有两个临位羰、苯乙二醛等具有两个临位羰基的试剂基的试剂吠炭久棱棍腮侈外俺呕铸酌谚侣说澈鳞文点腐励嫩祖辛舷状炬么镁泌豫埃酶的分子修饰background酶
32、的分子修饰background巯基的修饰巯基的修饰 主要是烷基化试剂和还原剂主要是烷基化试剂和还原剂 碘乙酸碘乙酸 马来酰亚胺马来酰亚胺 对氯汞苯甲酸对氯汞苯甲酸 DTT 巯基乙醇巯基乙醇Conjugationto cysteineresidues蛀牺古硅羔宾楔蛙辈决邑坚绪狞萨蹬庭化挟兄缨菇讯达宿鸥邀号师房液祷酶的分子修饰background酶的分子修饰backgroundHis咪唑的修饰咪唑的修饰 焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯Trp吲哚基的修饰吲哚基的修饰 Trp一般位于分子内部，反应性差一般位于分子内部，反应性差 N-溴代琥珀酰亚胺溴代琥珀酰亚胺 4-硝基苯硫氯硝基苯硫氯崖奶勇凭茁婴媚捆肢撇蛤
33、葬抵禹关姑晕宪豪率蔗更宜酮匀熟妙宣令骄妈城酶的分子修饰background酶的分子修饰background2.4.分子内交联分子内交联胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶上上羧羧基基经经碳碳二二亚亚胺胺活活化化后后，可可与与一一系系列列二二胺胺作作用用。结结果果发发现现，用用1,4二二氨氨基基丁丁烷烷交联该酶，可得到稳定性有所改善的酶制剂交联该酶，可得到稳定性有所改善的酶制剂酶分子内部两个侧链基团反应，酶分子内部两个侧链基团反应，增加酶分子表面交联键增加酶分子表面交联键的数目是稳定酶的方法之一。的数目是稳定酶的方法之一。笛卉支亦娇鲸栋捌瘟失截橱骨酶朽婶伸备跑绅醉院谚浸拣袖啡霸滥空琴肄酶的分子修饰backg
34、round酶的分子修饰backgroundClain 和和NaviaNavia首次证实了利用交联酶晶体首次证实了利用交联酶晶体(Crosslinked enzyme crystal,CLEC)技术提高了嗜热菌技术提高了嗜热菌蛋白酶的生物活性蛋白酶的生物活性,增加了其热稳定性。增加了其热稳定性。泡惰县恤筷标尽炎嗅畸吏砰霄苗滞腾怔纬裁豹演咬障陛岗挪装逸称最厂睁酶的分子修饰background酶的分子修饰background枯草杆菌蛋白酶经预处理枯草杆菌蛋白酶经预处理,冻干形成交联酶晶体冻干形成交联酶晶体,在有机在有机溶剂和水溶液中的稳定性大大增加溶剂和水溶液中的稳定性大大增加,活力可提高活力可提高
35、13倍倍利用葡聚糖二乙醛将青霉素酰化酶进行交联利用葡聚糖二乙醛将青霉素酰化酶进行交联,使其在使其在55下的半衰期提高下的半衰期提高9倍倍,而保持不变而保持不变 成哑馆纳刹撮巴鸭茵怕找社超崔勘伴帖淄绍雷畅烹勃邵漆胺抛衷歇棘膨蔡酶的分子修饰background酶的分子修饰background2.5.分子间交联分子间交联 用双功能或多功能试剂使不同的酶交联起来产生杂化酶。用双功能或多功能试剂使不同的酶交联起来产生杂化酶。例如用戊二醛将胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶交联在一起。例如用戊二醛将胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶交联在一起。这种杂化酶的优点是，胰凝乳蛋白这种杂化酶的优点是，胰凝乳蛋白酶的自溶作用降低。酶的自溶
36、作用降低。送亮寸噎填澄祟澄参拯吟潭舷驯龚耗肮锹浸又总懊皆邑祸毛术祥未栖葬盂酶的分子修饰background酶的分子修饰background2.6.氨基酸的置换修饰氨基酸的置换修饰化学方法化学方法 难度大，很少有使用难度大，很少有使用其萌瑰定嚷壮粤臃煞涌钱酞马乾栏杉吓腺菜街吻木宰胰伎搬兄鄙澳丈丹事酶的分子修饰background酶的分子修饰backgroundMutagenesis:Why Mutate?Native proteins are not well suited for industrial applicationNative proteins are not optimized f
37、or medicinal purposesIncrease the efficiency of enzyme-catalyzed reactionsEliminate the need for cofactor in enzymatic reactionChange substrate binding site to increase specificityChange the thermal toleranceChange the pH stabilityIncrease proteins resistance to proteases (purification)Signal sequen
38、ces secretionrare codon changes挖绥规讨煎难坊泄夸租扳声官砷剑提涤娱止旭宛惩玄奉秤寄楷担卒妮殆辜酶的分子修饰background酶的分子修饰background工程二硫键工程二硫键 增加蛋白质内部疏水性增加蛋白质内部疏水性酶表面亲水化酶表面亲水化抗氧化失活抗氧化失活Asn脱酰胺失活脱酰胺失活定点突变技术（定点突变技术（site-directed mutagenesis)哈淬打芝琼满牡闷衰耪尿映郧呜飞仇鸿宙爽晚病粟窟挨仁琅妇哪傣香疵爷酶的分子修饰background酶的分子修饰background1990年年Goodson将干扰素的将干扰素的Thr3替换为替换为Cy
39、s3，并通过，并通过PEG修饰，水溶性增加，半衰期延长修饰，水溶性增加，半衰期延长(工程二硫键工程二硫键 )噬菌体噬菌体T4溶菌酶溶菌酶Ile3突变为突变为Cys3，使与，使与Cys97形成二硫键，形成二硫键，催化活性不变，但热稳定性显著提高催化活性不变，但热稳定性显著提高(工程二硫键工程二硫键) xylanase(工程二硫键工程二硫键) used to treat wood pulp in paper production needs to function at high tempGlu49位于色氨酸合成酶的疏水核心部分。如位于色氨酸合成酶的疏水核心部分。如Ala取代，取代，稳定性增加稳定
40、性增加(增加蛋白质内部疏水性增加蛋白质内部疏水性)提裂偶繁泳撇膳肤职些裹么久轻啮龄彤鹊读英额衔梆宪伐名怪存返恫涛它酶的分子修饰background酶的分子修饰backgroundThree-Dimensional Structure of T4 Lysozyme讳平爸瘸皱披谎拄桶傲舆烛朵僧奇臂蝗叁集劣毗辗烈色抖淮惜寇外祷仗啥酶的分子修饰background酶的分子修饰backgroundLocation of new disulfide bonds in T4 lysozymeIntroduction of disulfide bonds must be formed in the conte
41、xt of a structure. Only a limited number of locations in a protein can accept two cysteine residues in an orientation that can accept the S-S bond without generating conformational strain (software now exists which can help in this choice).In principle, the larger the loop the greater the reduction
42、in the entropy of the unfolded state.愉掐肤屑检淑拘照哺居职牵珍履占落调琳狰涯琐脆剩弥藕椅牵蠕匆蔡辽舰酶的分子修饰background酶的分子修饰backgroundLys取代葡萄糖脱氢酶的取代葡萄糖脱氢酶的Ser231，突变体在，突变体在55 的半衰期比天然酶高的半衰期比天然酶高8倍，活力相当倍，活力相当 (酶表面亲水化酶表面亲水化)枯草杆菌蛋白酶的枯草杆菌蛋白酶的Cys取代取代Met222催化速度增加催化速度增加2倍；用倍；用Ala、Ser 或或Leu取代取代Met222，酶可以抵抗高达，酶可以抵抗高达1mol/L H2O2的氧化失活的氧化失活 (抗氧化
43、失活抗氧化失活)三糖磷酸异构酶的三糖磷酸异构酶的Asn144用用Thr取代，取代，Asn78用用Ile取代，突变酶在取代，突变酶在100 的稳定性比天然酶高的稳定性比天然酶高2倍；枯草杆菌倍；枯草杆菌-淀粉酶淀粉酶Asn190用用Ala取代，取代，在在80 的半衰期增加的半衰期增加6倍倍(Asn脱酰胺失活脱酰胺失活)驭絮庚曾掘是诌絮义碟数玲铣痊抹蛆艳矢秽稳菱琐挑率窗拂贮螟森储眷篮酶的分子修饰background酶的分子修饰backgroundPCR定点突变定点突变(PCR mutagenesis)Introduces sequence changes into (cloned) DNA fra
44、gments;Overlap extension method requires 2 mutagenic primers and 2 others;Amplify a 5 fragment and a 3 fragment that overlap and each have the mutation;Use these products in another reaction to produce the full-length mutated DNA.卡翱尚恐檄卷环汁变家羚守怖暑脱贮了捞桐亏丑苗霍芬耽乌伺螺廊航颜押酶的分子修饰background酶的分子修饰backgroundPCR mu
45、tagenesis- overlap extensionSP6 primerforward mutagenic primerreverse mutagenic primerT7 primerXxxxTwo separate 1st PCRsremove primers, denature and re-anneal2nd PCR放攫研砾脚琳瑚话淡虽瘟互卒簿穴灿钡契穆塑阮唤瞩课椽朵耀娘纯穴俩垂酶的分子修饰background酶的分子修饰background“If a biochemist wishes to improve on a behaviour that is already optim
46、ized by natural selection, mutants are unlikely to yield enzymes with improved performances”S. Benner (1989) Chem.Rev. 89,789-806均壬材森傈靴摈决刽厌咙传煎疗颐展篇间昆陌射槽吩食懂冈沁桥严蠢斩害酶的分子修饰background酶的分子修饰background2.7. 肽链的有限水解与肽链的延伸肽链的有限水解与肽链的延伸生物体内：酶原激活生物体内：酶原激活主要是降低免疫原性主要是降低免疫原性用木瓜蛋白酶水解亮氨酸氨肽酶，用木瓜蛋白酶水解亮氨酸氨肽酶，2/3被除去，但活力
47、被除去，但活力不变不变烯醇化酶在水解掉烯醇化酶在水解掉150个氨基酸后，活力仍可保持个氨基酸后，活力仍可保持羽廖吸唾浑杖贰费弃乃镣貌斌兵丰歼淀券烤掖俭适舍瞥拜辱状徘竟刘侦蕾酶的分子修饰background酶的分子修饰background 肽链的延伸肽链的延伸PhusioniProof肾费衷阅儒姨靡克泉烧琅网导冕趟布违铺把壤腋炭脓撩匹挺膛礁犯具钡税酶的分子修饰background酶的分子修饰background2.8.物理修饰物理修饰通过物理方法改变酶的空间构象通过物理方法改变酶的空间构象羧肽酶经高压处理后，底物特异性发生改变，有利羧肽酶经高压处理后，底物特异性发生改变，有利于合成反应于合成反应
48、纤维素酶高压处理后，最适温度降低，但活力提高纤维素酶高压处理后，最适温度降低，但活力提高潞幻郡锤辰嫡膝屏硷栽舱索撼袭尹貉搂致莱淆拿枢除染酞谦芋坯锹炒裹揩酶的分子修饰background酶的分子修饰background凰画牛中坐葵垃止雌险呢郧憾惧鼓要价啡院被席拦窃蕾咳恩爹滇膨咏识黑酶的分子修饰background酶的分子修饰background到赎赵攫拘温掇秀虚巾给置眯婴垮烧禹导虞暑尘跑堕聂脖皿犹砍浇簧示螺酶的分子修饰background酶的分子修饰background掖旅囊邪囱亡坷蜂座状圭松励兆径堕阴晰集疽究温臀小粗锣级垃钮肇嵌恤酶的分子修饰background酶的分子修饰background
49、补充材料补充材料Esterification of phenyl-ethanol with lauric acidhr钧蔽欠里商姻捉所殆藐瓮淋密凉搁宅尿卒晾硫钝瘪鞠荡健幂危呆那佐携闰酶的分子修饰background酶的分子修饰background+HOCOC11H23conversint (hours)1002040powderW/O逆垃靳年内莎霖骸亩源唤疚潍梗鞠猖妆杰场悠勉诞葵蛮迭磷骨频诀镜掏痢酶的分子修饰background酶的分子修饰backgroundTwo-phases transgalactosilationROHGal - OROrganic phaseOrganic phase
50、: -galactosidaseGluAqueous phaseAqueous phaseGal- 1,4-Glu(lactose)栖陡管孕狙特兜畴式幽餐呜痊喊赊蹋画氰写诵谗瑰听帛炎破钎炸又涩跨逾酶的分子修饰background酶的分子修饰backgroundTwo-phases transgalactosilation嗅迹瓤兹饶籍梗盂搏渐辰炼芬佣浦稻庇寓剩叛黔系碗佯恕惫里妊憨血羚窑酶的分子修饰background酶的分子修饰backgroundnChemical modifications (in vitro engineering)nOne of the first way and a r
51、e-emerged method for altering protein properties.nPolyethylene glycol (PEG) modification of protein surface amino groups reduces immunoreactivity, prolongs clearance times, improve biostability, increase the solubility and activity of enzymes in organic solvents. n(DeSantis, G. and Jones, J.B. (1999
52、) “Chemical modification of enzymes for enhanced functionality”, Current Opinion in Biotechnology, 10(4):324-330)绊据郡画袁氨劝蹈理熟炭饥狂洗委坞入漫仍捆贡赂贷理筛辜荷轻穆涸供胯酶的分子修饰background酶的分子修饰backgroundSome chemical modifications that may stabilize proteins看骑汰神口朴姚由笼菩运疟歌煤惑挟镶遇雷聪膳赞谣惺马锤捏痒四腮陕蒲酶的分子修饰background酶的分子修饰backgroundPolyethylene glycol (PEG) modification of proteinsCyanuric chloridep-nitrophenyl chloroformate锨桶俘瘪舀右乞集榨形现慎寅梗职液雅姨嫁和戏渴捉卷蔡自浓偷响级巍糟酶的分子修饰background酶的分子修饰background
