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1、实验二实验二 蛋白质的颜色反应蛋白质的颜色反应 一一 实验目的实验目的 1. 1.了解构成蛋白质的基本结构单位及主要联了解构成蛋白质的基本结构单位及主要联接方式。接方式。 2. 2.了解蛋白质的颜色反应原理。了解蛋白质的颜色反应原理。 3. 3.学习几种常用的鉴定蛋白质的方法。学习几种常用的鉴定蛋白质的方法。实验原理(一一) ) 双缩脲反应双缩脲反应 1 1 原理原理 尿素加热至尿素加热至180180左右生成双缩脲并放出一分子氨。左右生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与双缩脲在碱性环境中能与cucu2+2+结合生成紫红色化合物，此反应结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。称为
2、双缩脲反应。 蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。 一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。 ( (二二) ) 茚三酮反应茚三酮反应 除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有有氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质
3、。 该反应十分灵敏，是一种常用的氨基酸定量测定方法。该反应十分灵敏，是一种常用的氨基酸定量测定方法。 茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成COCO2 2、NHNH3 3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原性茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色成的还原性茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。物质。加热加热 （三）黄色反应（三）黄色反应 在在蛋蛋白白质质分分子子中中，具具有有芳芳香香环环的的氨氨基基酸酸( (如如酪酪氨氨酸酸，色色氨氨酸酸等等) )残残基基
4、上上的的苯苯环环经经硝硝酸酸作作用用可可生生成成黄黄色色的的硝硝基基化化合合物物，在在碱碱性性条条件件下下生生成成物物可可转转变变为为深深橙橙色色的的的的硝硝醌醌衍衍生生物物，反反应应为：为： 多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以都多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以都会发生黄色反应。苯丙氨酸不易硝化，需加少量浓会发生黄色反应。苯丙氨酸不易硝化，需加少量浓硫酸后才能够发生黄色反应。硫酸后才能够发生黄色反应。 ( (四四) )考马斯亮蓝反应考马斯亮蓝反应 考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250G250具有红色和蓝色两种色调。在具有红色和蓝色两种色调。在酸性溶液中，其以游离态存在呈棕红色：当它与蛋酸性溶
5、液中，其以游离态存在呈棕红色：当它与蛋白质通过疏水作用结合后变成蓝色。白质通过疏水作用结合后变成蓝色。 它染色灵敏度高。反应速度快，约在它染色灵敏度高。反应速度快，约在2 2分钟左分钟左右时间达到平衡，在室温一小时内稳定。右时间达到平衡，在室温一小时内稳定。 在在0.01-1.0 mg0.01-1.0 mg蛋白质范围内，蛋白质浓度与蛋白质范围内，蛋白质浓度与A A595595nmnm值成正比。所以常用来测定蛋白质含量。值成正比。所以常用来测定蛋白质含量。实验试剂实验试剂v1 1 蛋白质溶液；蛋白质溶液；v2 0.12 0.1茚三酮水溶液；茚三酮水溶液；v3 3 浓硝酸；浓硝酸；v4 10%Na
6、OH4 10%NaOH溶液；溶液；v5 5 尿素；尿素；v6 16 1硫酸铜溶液；硫酸铜溶液；v7 0.017 0.01考马斯亮蓝染液考马斯亮蓝染液实验操作实验操作（1 1）取取少少量量尿尿素素结结晶晶，放放在在干干燥燥试试管管中中。用用微微火火加加热热使使尿尿素素熔熔化化。熔熔化化的的尿尿素素开开始始硬硬化化时时，停停止止加加热热，尿尿素素放放出出氨氨，形形成成双双缩缩脲脲。冷冷后后，加加1010氢氢氧氧化化钠钠溶溶液液约约1 1毫毫升升，振振荡荡混混匀匀，再再加加1 1硫硫酸酸铜铜溶溶液液1 1滴滴，再再振振荡荡。观观察察出出现现的的粉粉红红颜颜色。色。 （2 2）向向另另一一试试管管加加
7、卵卵清清蛋蛋白白溶溶液液约约1010滴滴和和1010氢氢氧氧化化钠钠溶溶液液约约1010滴滴，摇摇匀匀，再再加加1 1硫硫酸酸铜铜溶溶液液2 2滴滴，随随加加随随摇摇，观观察紫玫瑰色的出现。察紫玫瑰色的出现。 (3) (3) 取取试试管管1 1支支，加加入入蛋蛋白白质质溶溶液液1ml1ml，然然后后各各加加入入0.10.1茚茚三三酮酮水水溶溶液液2 2滴滴，混混匀匀后后于于沸沸水水浴浴中中加加热热1-21-2分分钟，观察颜色由有粉色变紫红色再变蓝。钟，观察颜色由有粉色变紫红色再变蓝。 (4) (4) 于于一一试试管管内内，置置蛋蛋白白质质溶溶液液1010滴滴，浓浓硝硝酸酸3-43-4滴滴，加加热热，冷冷却却后后于于室室温温下下逐逐滴滴加加入入10%NaOH10%NaOH溶溶液液5 5滴滴，观观察颜色变化。察颜色变化。 (5) (5) 操作方法操作方法管号管号蛋白质溶液蛋白质溶液（mlml） 蒸馏水蒸馏水（mlml） 考马斯亮蓝考马斯亮蓝染液染液（滴）（滴） 1 10 01 12 22 20.10.10.90.92 2思考题思考题v1 1 请列举几种鉴别蛋白质的方法？请列举几种鉴别蛋白质的方法？ v2 2 通过实验谈一谈你对蛋白质的颜色反应有通过实验谈一谈你对蛋白质的颜色反应有何认识？何认识？
